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Artículo de método

Análisis patológico de metástasis pulmonares después de la inyección lateral de células tumorales en la vena de la cola

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DOI:

10.3791/61270

⸱

20 de mayo de 2020

 ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center, 2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

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Resumen

La inyección intravenosa de células cancerosas se usa a menudo en la investigación de metástasis, pero la carga tumoral metastásica puede ser difícil de analizar. Aquí, demostramos un modelo de metástasis de inyección en la vena de la cola e incluimos un enfoque novedoso para analizar la carga tumoral de pulmón metastásica resultante.

Resumen

La metástasis, la principal causa de morbilidad y mortalidad para la mayoría de los pacientes con cáncer, puede ser difícil de modelar preclínicamente en ratones. Pocos modelos de metástasis espontáneas están disponibles. Por lo tanto, el modelo experimental de metástasis que implica la inyección de la vena de la cola de líneas celulares adecuadas es un pilar de la investigación de metástasis. Cuando las células cancerosas se inyectan en la vena de la cola lateral, el pulmón es su sitio preferido de colonización. Una limitación potencial de esta técnica es la cuantificación precisa de la carga tumoral pulmonar metastásica. Mientras que algunos investigadores cuentan macrometástasis de un tamaño predefinido y/o incluyen micrometástasis después de la seccionamiento del tejido, otros determinan el área de lesiones metastásicas en relación con el área normal del tejido. Ambos métodos de cuantificación pueden ser extremadamente difíciles cuando la carga metastásica es alta. Aquí, demostramos un modelo de inyección intravenosa de metástasis pulmonar seguido de un método avanzado para cuantificar la carga tumoral metastásica utilizando un software de análisis de imágenes. Este proceso permite la investigación de múltiples parámetros de punto final, incluido el tamaño promedio de la metástasis, el número total de metástasis y el área total de metástasis, para proporcionar un análisis completo. Además, este método ha sido revisado por un patólogo veterinario certificado por el Colegio Americano de Patólogos Veterinarios (SEK) para garantizar la precisión.

Introducción

A pesar de ser un proceso altamente complejo e ineficiente1, la metástasis es un contribuyente significativo a la morbilidad y mortalidad de los pacientes con cáncer2. De hecho, la mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer se atribuyen a la propagación metastásica de la enfermedad3,4. Para que las células tumorales hagan metástasis con éxito, deben desprenderse del sitio primario, invadir a través del estroma contiguo, intravasar en la circulación sanguínea o linfática, viajar al lecho capilar de un sitio secundario, extravasar en el tejido secundario y proliferar o crecer para formar lesiones metastásicas5. El uso de modelos de ratón ha sido fundamental para avanzar en la comprensión de los mecanismos moleculares responsables de la siembra y el crecimiento metastásico6,7. Aquí, nos centramos en la metástasis del cáncer de mama, para la cual a menudo se utilizan tanto modelos de ratón modificados genéticamente como métodos de trasplante, cada uno con su propio conjunto de ventajas y limitaciones.

Los modelos de tumores mamarios genéticamente modificados hacen uso de promotores específicos de la glándula mamaria, incluyendo MMTV-LTR (repetición terminal larga del virus tumoral mamario de ratón) y WAP (Proteína ácida de suero de leche), para impulsar la expresión de transgenes en el epitelio mamario8. Los oncogenes que incluyen el antígeno T medio del polioma (PyMT), ErbB2 / Neu, c-Myc, Wnt-1 y el virus simio 40 (SV40) se han expresado de esta manera9,10,11,12,13, y aunque estos modelos genéticos son útiles para estudiar el inicio y la progresión del tumor primario, pocos hacen metástasis fácilmente en órganos distantes. Además, estos modelos genéticos de ratón son a menudo más prohibitivos en tiempo y costo que los modelos de metástasis espontáneas o experimentales. Dada la limitación de la mayoría de los modelos de tumores mamarios genéticamente modificados para estudiar la metástasis, las técnicas de trasplante se han convertido en métodos atractivos para estudiar este complejo proceso. Esto incluye la inyección ortotópica, de la vena de la cola, intracardíaca e intracraneal de líneas celulares adecuadas.

Aunque varias líneas celulares de cáncer de mama hacen metástasis fácilmente después de la inyección ortotópica en la almohadilla de grasa mamaria14,15, la consistencia y reproducibilidad de la carga tumoral metastásica puede ser un desafío, y la duración de dichos estudios puede ser del orden de varios meses. Para evaluar la metástasis pulmonar, en particular, la inyección intravenosa en la vena de la cola es a menudo un método más reproducible y efectivo en el tiempo con diseminación metastásica que generalmente ocurre en el lapso de unas pocas semanas. Sin embargo, dado que el modelo de inyección intravenosa omite los pasos iniciales de la cascada metastásica, se debe tener cuidado al interpretar los resultados de estos estudios. En esta demostración, mostramos la inyección de células tumorales mamarias en la vena de la cola junto con un método de análisis preciso y completo.

A pesar de que la comunidad investigadora ha logrado avances significativos en la comprensión del complejo proceso de la metástasis del cáncer de mama, se estima que más de 150.000 mujeres tienen actualmente cáncer de mama metastásico16. De las pacientes con cáncer de mama en estadio IV, >36% de las pacientes presentan metástasis pulmonar17; sin embargo, el patrón específico del sitio y la incidencia de metástasis pueden variar según el subtipo molecular18,19,20,21. Las pacientes con metástasis pulmonares asociadas al cáncer de mama tienen una mediana de supervivencia de solo 21 meses, lo que pone de manifiesto la necesidad de identificar tratamientos efectivos y nuevos biomarcadores para esta enfermedad17. El uso de modelos experimentales de metástasis, incluida la inyección intravenosa de células tumorales, continuará avanzando en nuestro conocimiento de este importante desafío clínico. Cuando se combinan con la patología de imágenes digitales y el método de análisis de la carga tumoral pulmonar metastásica descrito en este protocolo, las inyecciones de la vena de la cola son una herramienta valiosa para la investigación de metástasis del cáncer de mama.

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Protocolo

El uso de animales siguió las regulaciones de Recursos Animales de Laboratorio de la Universidad (ULAR) bajo el protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de OSU 2007A0120-R4 (PI: Dra. Gina Sizemore).

1. Inyección de células de cáncer de mama en la vena de la cola

  1. Preparación de células y jeringa para inyección
    1. Placa un número apropiado de células en función del número de ratones y la concentración de células que se utilizará.
      NOTA: El número de células inyectadas y el tiempo hasta el desarrollo de metástasis dependerá de la línea celular utilizada y deberá optimizarse. En esta demostración, 1 x 106 células MDA-MB-231 se inyectan por vía intravenosa en ratones NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), y se observan lesiones pulmonares macroscópicas a más tardar 24 días después de la inyección. Para la línea celular tumoral mamaria murina MVT117, se inyectan 3 x 106 células en ratones FVB/N inmunocompetentes con numerosas metástasis pulmonares observadas a los 14 días22,23.
    2. Aspirar medios y enjuagar placas celulares con 1x PBS. Tripsinizar las células en un volumen mínimo, agregar el volumen apropiado de medios y contar las células utilizando un hematocitómetro u otro método preferido. El azul de tripano (0,4%) u otros colorantes de células vivas / muertas se pueden usar para determinar recuentos de células viables.
    3. Células de pellets girando a 180 x g durante 5 min.
    4. Resuspender el número apropiado de células en 1x PBS estéril de tal manera que se inyecte un volumen de 100 μL por ratón. Mantenga la suspensión celular en hielo para mantener la viabilidad.
    5. Antes de la inyección, resuspenda completamente las células con una pipeta de 200 μL o 1 ml para evitar la aglomeración. Extraiga 100 μL en una jeringa de insulina de 28 G (ver Tabla de Materiales).
    6. Elimine las burbujas de aire manteniendo la jeringa vertical, golpeando la jeringa y ajustando lentamente el émbolo. Es probable que la inyección de burbujas de aire en la vena cause una embolia de aire / gas que puede ser fatal.
  2. Inyección lateral de la vena de la cola
    NOTA: Para los ensayos experimentales de metástasis de cáncer de mama, las inyecciones se realizan en ratones hembra de > 6 semanas de edad.
    1. Manipule el ratón por la cola y deslice al animal en un tubo ranurado / dispositivo de sujeción de un tamaño apropiado (consulte la Tabla de materiales para el dispositivo de sujeción utilizado).
    2. Inserte la parte del tapón del dispositivo de sujeción y coloque el mouse de lado de modo que su vena de la cola lateral sea fácil de ver. El ratón tiene una arteria ventral en línea con los genitales, una vena dorsal y dos venas caudales laterales.
    3. Limpie la superficie de la cola del ratón con una toallita aséptica. Agarre la cola entre el dedo índice y el pulgar con la mano no dominante y aplique una ligera tensión.
    4. Comenzando en la porción distal de la cola, inserte la aguja paralela a la vena con el bisel terminado.
    5. Si está permitido, vuelva a tapar cuidadosamente la aguja y doblar a un ángulo de 20-30 °. Se recomienda encarecidamente un enfoque con una sola mano o un dispositivo de recapitulación con aguja.
      NOTA: No es necesario aspirar, ya que esto puede hacer que la vena colapse. Sin embargo, se puede ver un pequeño destello de sangre cuando se coloca por primera vez. La aguja avanzará suavemente hacia la vena con la colocación adecuada.
    6. Dispense lentamente el volumen completo en la vena. No debe haber resistencia cuando se empuja el émbolo.
    7. Si se siente alguna resistencia, retire inmediatamente la aguja de la jeringa. Si es necesario, vuelva a insertar la aguja (idealmente no más de 3 intentos) moviéndose hacia el extremo proximal de la cola o la vena lateral opuesta.
    8. Es probable que un pequeño volumen de sangre se desplace después de la inyección. Aplique una presión suave con una gasa estéril y limpie con una toallita aséptica.
    9. Deseche rápidamente la jeringa en un recipiente apropiado para objetos punzantes.
    10. Devuelva el ratón a una jaula limpia y ventilada y monitoree los signos de angustia.
    11. Monitoree a los ratones 2-3 veces por semana para detectar signos de formación de metástasis (dificultad para respirar, postura encorvada, pérdida de peso) y angustia general. El tiempo hasta el desarrollo de la metástasis dependerá de la línea celular y la tensión del ratón.
    12. Si se utiliza un dispositivo de imágenes de animales vivos in vivo, tome imágenes de ratones inmediatamente después de la inyección de la vena de la cola para confirmar la inyección exitosa de células y obtener datos de tiempo "cero" (los detalles específicos sobre las imágenes de bioluminiscencia in vivo no se incluyen aquí, pero se describen por Yang et al.24).

2. Fijación del tejido pulmonar y análisis de la carga tumoral pulmonar metastásica

  1. Inflado del tejido pulmonar para mantener el formato estructural de los pulmones para la histopatología
    1. Después de seguir los procedimientos de eutanasia aprobados (por ejemplo, dióxido de carbono al 30 - 70% de desplazamiento del volumen de la cámara / min), asegure la carcasa del ratón a una placa de disección con alfileres. Rocíe o aplique etanol al 70% para mantener el pelaje del ratón fuera del camino durante la disección.
      NOTA: La asfixia por dióxido de carbono puede causar hemorragia pulmonar como una lesión de fondo esperada, especialmente a velocidades de flujo más lentas.
    2. Abra el tórax con una incisión en la línea media, extienda la incisión cranealmente / caudalmente a través del peritoneo y corte el diafragma agarrando el proceso xifoideo.
    3. Usando un juego separado de tijeras para no opacar las cuchillas, corte las costillas a lo largo de cada lado del esternón y retire cuidadosamente la caja torácica dejando espacio para que los pulmones se expandan.
    4. Aislar la tráquea mediante la extirpación de las glándulas salivales submandibulares y la musculatura infrahioidea. Colocar alfileres a cada lado de la tráquea puede evitar el movimiento no deseado durante la inserción de la aguja.
    5. Llene una jeringa de 26 G con 2-3 ml de formalina tamponada neutra al 10% e insértela en la tráquea.
    6. Inyecte lentamente formalina y observe si los pulmones se expanden (generalmente requiere ~ 1.5 ml de formalina).
    7. Una vez que la formalina comienza a filtrarse de los pulmones (evite el inflado excesivo), pellizque la tráquea con un par de fórceps, retire la aguja de la jeringa y desprenda todo el aparato respiratorio. Coloque los pulmones, el corazón, etc. directamente en la formalina, ya que se puede realizar un recorte adicional del tejido después de la fijación.
    8. Procesamiento completo, incrustación, seccionamiento de tejido y tinción de hematoxilina y eosina (H&E) utilizando métodos estándar.
  2. Análisis de la carga tumoral pulmonar metastásica
    1. Escanee las secciones pulmonares teñidas con H&E en un escáner deslizante de alta resolución con un aumento de 40x (Figura 3).
    2. Importe imágenes en software de análisis de imágenes (por ejemplo, Visiopharm Image Analysis) para la cuantificación de metástasis pulmonares.
      NOTA: Recomendamos que los nuevos usuarios obtengan capacitación in situ o en línea para usar el software de análisis de imágenes. Numerosos seminarios web también están disponibles a través de la página web comercial.
    3. Seleccione la aplicación Visiopharm 10118 H&E Lung Metastasis de la biblioteca de aplicaciones del software.
      NOTA: El propósito de esta aplicación es etiquetar y cuantificar la metástasis pulmonar en diapositivas teñidas de H&E. Como parte de la aplicación 10118 H&E Lung Metastasis, el primer paso de procesamiento de imágenes segmenta el tejido pulmonar con la aplicación de detección de tejidos. El segundo paso de procesamiento de imágenes utiliza la aplicación Metastasis Detect que identifica las metástasis dentro del tejido pulmonar. Las metástasis se identifican a través de la forma junto con regiones que están demasiado deformadas, demasiado rojas o demasiado escasas para ser identificadas como metástasis.
    4. Ajuste los parámetros que definen la forma y la dispersión para que se ajusten mejor a las imágenes representativas. Las áreas segmentadas de metástasis tumorales y tejido pulmonar normal se pueden mostrar utilizando etiquetas de diferentes colores para cada tipo de tejido.
      Nota : en el caso de que la aplicación no pueda separar con precisión las metástasis del tejido pulmonar normal, es posible que sea necesario escribir una aplicación personalizada que use el programa Bosque de decisión de Visiopharm como se hizo para los experimentos (consulte la Figura 2 y la Figura 3). Los detalles para escribir un algoritmo personalizado siguen a continuación. De lo contrario, continúe con el paso 2.2.9.
    5. Abra el programa Decision Forest, que funciona entrenando múltiples clases [es decir, tejido pulmonar (no neoplásico), metástasis, glóbulos rojos, epitelio y / o espacio en blanco] en una imagen deseada. En la Figura 2, las metástasis tumorales son azules, el tejido normal es verde y el epitelio bronquiolar es amarillo. Además, los glóbulos rojos están en rojo y los espacios de aire en rosa.
    6. Siga la serie de preguntas de sí o no que se le indique para entrenar adecuadamente a cada clase para una imagen. La precisión del algoritmo determinará el número de preguntas sí/no. Para el análisis, el algoritmo / aplicación personalizado se escribió con una precisión establecida en 50 (rango 0-100).
    7. Ajuste las características de cada clase aplicando filtros para enfocar, desenfocar, ordenar por forma, etc. para mejorar la precisión del algoritmo/aplicación. Visiopharm ve cada clase a través de uno o varios objetivos conocidos como características. Las características cambian la forma en que la clase ve la imagen para resaltar ciertos colores o intensidades.
      NOTA: Para el algoritmo personalizado, las metástasis que miden 8500 μm2 y superiores se etiquetan y miden como metástasis. Esto explica la varianza de tamaño y las metástasis demasiado pequeñas para detectarlas. En la cuantificación normal de tejidos se incluyeron pequeñas áreas mal formadas y pequeñas áreas metastásicas inferiores a 8500 μm2 .
    8. Guarde la configuración modificada de la aplicación o del algoritmo personalizado y, a continuación, aplique el algoritmo/aplicación a un conjunto completo o serie de tejidos teñidos con H&E.
    9. Por último, exporte todas las variables de salida, que incluyen las enumeradas en la Tabla 1. El área en micras al cuadrado (μm2) se puede cuantificar para cada tipo de tejido y los porcentajes se derivan del área neta total de tejido de la muestra (es decir, el tejido total menos el espacio de aire).
    10. Al crear un algoritmo personalizado, revise las marcas de tejido en consulta con un patólogo veterinario certificado por el Colegio Americano de Patólogos Veterinarios para garantizar mediciones precisas y diferenciar entre los tipos de tejidos.

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Resultados

Si se utilizan células no marcadas para la inyección de la vena de la cola, puede ser difícil confirmar la colonización pulmonar hasta (1) el momento de la necropsia si se pueden observar macrometástasis o (2) después del análisis histológico si existen metástasis microscópicas. Con una extensa carga de tumores pulmonares metastásicos, los ratones tendrán dificultad para respirar. Al igual que con cualquier estudio de tumores, los ratones deben ser monitoreados cuidadosamente durante toda la duración del estudio. El uso ...

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Discusión

A medida que los investigadores continúan utilizando la inyección intravenosa de células tumorales como modelo experimental para la metástasis, faltan prácticas estándar para analizar la carga tumoral metastásica resultante. En algunos casos, se pueden observar diferencias significativas en la carga tumoral metastásica tras la manipulación de líneas celulares particulares y/o el uso de compuestos químicos por vía macroscópica. Sin embargo, en otros casos, las diferencias sutiles en la siembra y el crecimiento metastásico...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los datos representativos se financiaron a través del Instituto Nacional del Cáncer (K22CA218549 a S.T.S). Además de su asistencia en el desarrollo del método de análisis integral que se informa en este documento, agradecemos a The Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Director – Krista La Perle, DVM, PhD) por los servicios de histología e inmunohistoquímica y al Pathology Imaging Core por el desarrollo y análisis de algoritmos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
almohadillas de preparación con alcoholFisher Scientific22-363-750para limpiar la cola antes de la inyección
tijeras de disecciónFisher Scientific08-951-5para disección de ratones e inflado de tejido pulmonar
DMEM con L-glutamina, 4,5 g/L de glucosa y piruvato de sodioFisher ScientificMT10013CVbase de medios de cultivo celular para las líneas celulares MDA-MB-231 y MVT1
La solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1xFisher ScientificMT21030CVutiliza para resuspender células tumorales para
inyección etanol (solución al 70 %)OSUutilizada para minimizar el pelaje de ratón durante la disección; tenga cuidado: inflamable
Tinte azul de EvanMillipore SigmaE2129utilizado al 1 % en PBS estéril para la práctica con el método de inyección en la vena de cola; use precaución - reactivo
peligroso Suero bovino fetalMillipore SigmaF4135aditivo para medios de cultivo celular; utilizado al 10% en DMEM
pinzasFisher Scientific10-270para la disección y el inflado de tejido pulmonar
Ratones FVB/NJEl laboratorio Jackson001800cepa de ratón singénica para células MVT1
hemacitómetro (Bright-Line)Millipore SigmaZ359629para su uso en cultivo celular para obtener recuentos celulares
jeringa de insulina (28 G)Fisher Scientific14-829-1Bpara inyecciones en la vena de cola (BD 329424)
Células MDA-MB-231ATCCcelular de cáncer de mama humano
células MVT1 célulasmamarias de ratón
agujas (26 G)Fisher Scientific14-826-15utilizado para inflar el pulmones
formalina tamponada neutra (10%)Fisher Scientific245685utiliza como fijador de tejidos y para inflar el tejido pulmonar; tenga cuidado: reactivo peligroso
NOD. Ratones Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)El Laboratorio Jackson005557mantenido por OSUCCC Validación de objetivos Recurso compartido
Penicilina Estreptomicina 100xThermoFisher15140163aditivo para medios de cultivo celular
estérilFisher ScientificNC9379092para aplicar presión en la cola del ratón si se produce sangrado
jeringa (5 mL)Fisher Scientific14-955-458utilizado para inflar el retenedor
de venas de cola deBraintree Scientific, Inc.TV-150 STDutilizado para inmovilizar a ratones para inyecciones en las venas de la cola
Azul de tripán (0,4 %)ThermoFisher15250061utiliza en cultivo celular para evaluar la viabilidad
Tripsina-EDTA 0,25 %ThermoFisher25200-114se utiliza en cultivo celular para separar células tumorales de la placa
línea tumorales gasa tejido pulmonar de ratón

Referencias

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Reimpresiones y permisos

Erratum


Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.

The author list was updated from:

Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

to:

Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

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