Este protocolo describe tres pasos para preparar los lóbulos ópticos de larvas y adultos de Drosophila para la obtención de imágenes: 1) disecciones cerebrales, 2) inmunohistoquímica y 3) montaje. Se hace hincapié en el paso 3, ya que se requieren distintas orientaciones de montaje para visualizar estructuras específicas de lóbulos ópticos.
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Artículo de método
Disección, inmunohistoquímica y montaje de cerebros de larvas y adultos de Drosophila para la visualización del lóbulo óptico
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Resumen
Resumen
El lóbulo óptico de Drosophila , compuesto por cuatro neuropilas: la lámina, la médula, la lóbula y la placa de lóbula, es un excelente sistema modelo para explorar los mecanismos de desarrollo que generan la diversidad neuronal e impulsan el ensamblaje de circuitos. Dada su compleja organización tridimensional, el análisis del lóbulo óptico requiere que se comprenda cómo se colocan sus neurópilos adultos y sus progenitores larvarios en relación con el cerebro central. Aquí, describimos un protocolo para la disección, inmunotinción y montaje de cerebros de larvas y adultos para la obtención de imágenes del lóbulo óptico. Se hace especial hincapié en la relación entre la orientación del montaje y la organización espacial del lóbulo óptico. Describimos tres estrategias de montaje en la larva (anterior, posterior y lateral) y tres en el adulto (anterior, posterior y horizontal), cada una de las cuales proporciona un ángulo de imagen ideal para una estructura de lóbulo óptico distinta.
Introducción
El sistema visual de Drosophila, compuesto por el ojo compuesto y el lóbulo óptico subyacente, ha sido un excelente modelo para el estudio del desarrollo y la función de los circuitos neuronales. En los últimos años, el lóbulo óptico en particular ha surgido como un poderoso sistema en el que estudiar los procesos del neurodesarrollo como la neurogénesis y el cableado de circuitos 1,2,3,4,5,6,7,8.
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Protocolo
1. Preparación de cerebros de larvas para la obtención de imágenes confocales
- Disecciones
NOTA: Antes de comenzar la disección, prepare las soluciones fijas (4% de formaldehído en solución salina tamponada con fosfato (PBS)) y PBT (0.1-0.3% de Triton en PBS). La solución fija debe colocarse sobre hielo durante la disección. Aunque en este protocolo se utiliza un fijador de paraformaldehído (PFA), se han descrito estrategias de fijación alternativas (utilizando PLP20 o PEM21) para epítopos específicos. Para las disecciones de larvas, se necesitan dos pares de pinzas (Dumont #5 o #55s). Consul....
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Resultados
En la Figura 1 y la Figura 2 se presentan imágenes confocales de lóbulos ópticos larvales y adultos montados en las orientaciones descritas en el protocolo.
La Figura 1 muestra esquemas y cortes confocales representativos de cerebros de larvas colocados en las orientaciones anterior, posterior y lateral. En la orientación de montaje anterior, el epitelio OPC (DE-Cadherin), los neuroblastos del bulbo raquí.......
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Discusión
En este protocolo, describimos un método para inmunoteñir cerebros de larvas y adultos de Drosophila y montarlos en varias orientaciones. Si bien los métodos para teñir cerebros de larvas y adultos se han descrito previamente 22,23,24,27,28, las estrategias de montaje para la visualización óptima de estructuras específicas del lóbulo óptico han recibido menos atención
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a Claude Desplan por compartir con nosotros una alícuota del anticuerpo Bsh. Los anticuerpos monoclonales DE-Cadherin, Dachshund, Eyes Absent, Seven-up y Bruchpilot se obtuvieron del Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo, creado por el NICHD de los NIH y mantenido en la Universidad de Iowa, Departamento de Biología, Iowa City, IA 52242. Este trabajo fue apoyado por una beca NSERC Discovery Grant otorgada a T.E.. U.A. cuenta con el apoyo de una beca de posgrado Alexander Graham Bell de NSERC Canadá. P.V. cuenta con el apoyo de una beca de posgrado de Ontario.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | Bioshop | PBS405 | |
| 37% formaldehído | Bioshop | FOR201 | |
| Alexa Fluor 488 (cabra) uso secundario | de Invitrogen | A-11055 | a 1:500 |
| Alexa Fluor 555 (ratón) uso secundario | de Invitrogen | A-31570 | a 1:500 |
| Alexa Fluor 647 (conejillo de indias) uso secundario | de Invitrogen | A-21450 | a 1:500 |
| Alexa Fluor 647 (rata) secundario | Invitrogen | A-21247 | uso a 1:500 |
| cubrecubreobjetos | VWR | 48366-067 | |
| Pinzas de disección - #5 | Dumont | 11251-10 | |
| Pinza de disección - #55 | Dumont | 11295-51 | |
| Plato de disección | Corning | 722085 | |
| Toallitas secas | Kimbery Clark | 34155 | |
| Anticuerpo primario anti-Bgal de cabra | Uso de | a 1:1000 | |
| Anticuerpo primario anti-Bsh para conejillos de indias | Regalo de Claude Desplan | uso a 1:500 | |
| Anticuerpo primario anti-Vsx1 para conejillos de indias | Erclik et al. 2008 | uso a 1:1000 | |
| Película de laboratorio | Parafilm | PM-996 | |
| Tubos de | microcentrífugaSarstedt | 72.706.600 | |
| Portaobjetos de microscopio | VWR | CA4823-180 | |
| Anticuerpo primario anti-dac de ratón | Estudios del desarrollo Banco de hibridomas (DSHB) | uso de mabdac2-3 | a 1:20 |
| Ratón anticuerpo primario anti-eya | DSHB | eya10H6 | uso a 1:20 |
| Ratón anticuerpo primario anti-nc82 | DSHB | nc82 | uso a 1:50 |
| ratón anticuerpo primario anti-SVP | DSHB | Seven-up 2D3 | uso a 1:100 |
| Arcilla polimérica | Se puede utilizar | ||
| Conejo anti-GFP | Invitrogen | A-11122 | uso a 1:1000 Rata |
| anticuerpo primario anti-DE-Cadherina | DSHB | DCAD2 | uso a 1:20 |
| Medio de montaje Slowfade | Invitrogen | S36967 | También se puede utilizar el medio de montaje Vectashield (cat# H-1000) |
| Triton-x-100 | Bioshop | TRX506 |
Referencias
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell Tissue Research. 258, (1989).
- Hofbauer, A., Campos-Ortega, J. A. Prolif....
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Reimpresiones y permisos
