2D-HELS MS Seq: Un método general basado en LC-MS para la secuenciación directa y de novo de mezclas de ARN con diferentes modificaciones de nucleótidos

Resumen

Aquí, describimos un protocolo detallado para un método de secuenciación basado en LC-MS que se puede utilizar como método directo para secuenciar ARN corto (<35 nt por ejecución) sin un intermedio de ADNc, y como método general para secuenciar diferentes modificaciones de nucleótidos en un solo estudio con precisión de una sola base.

Resumen

Se ha demostrado que los enfoques de secuenciación basados en espectrometría de masas (MS) son útiles en la secuenciación directa de ARN sin necesidad de un intermediario de ADN complementario (ADNc). Sin embargo, estos enfoques rara vez se aplican como un método de secuenciación de ARN de novo , sino que se utilizan principalmente como una herramienta que puede ayudar en el aseguramiento de la calidad para confirmar secuencias conocidas de muestras de ARN monocatenario purificadas. Recientemente, desarrollamos un método de secuenciación directa de ARN mediante la integración de una estrategia de etiquetado final hidrofóbico en tiempo de retención de masa en 2 dimensiones en secuenciación basada en MS (2D-HELS MS Seq). Este método es capaz de secuenciar con precisión secuencias individuales de ARN, así como mezclas que contienen hasta 12 secuencias de ARN distintas. Además de los cuatro ribonucleótidos canónicos (A, C, G y U), el método tiene la capacidad de secuenciar oligonucleótidos de ARN que contienen nucleótidos modificados. Esto es posible porque la nucleobase modificada tiene una masa intrínsecamente única que puede ayudar en su identificación y su ubicación en la secuencia de ARN, o se puede convertir en un producto con una masa única. En este estudio, hemos utilizado ARN, incorporando dos nucleótidos modificados representativos (pseudouridina (Ψ) y 5-metilcitosina (m⁵C)), para ilustrar la aplicación del método para la secuenciación de novo de un solo oligonucleótido de ARN, así como una mezcla de oligonucleótidos de ARN, cada uno con una secuencia diferente y/o nucleótidos modificados. Los procedimientos y protocolos descritos aquí para secuenciar estos ARN modelo serán aplicables a otras muestras cortas de ARN (<35 nt) cuando se utilice un sistema LC-MS estándar de alta resolución, y también se pueden utilizar para la verificación de la secuencia de oligonucleótidos de ARN terapéuticos modificados. En el futuro, con el desarrollo de algoritmos más robustos y con mejores instrumentos, este método podría permitir la secuenciación de muestras biológicas más complejas.

Introducción

Se han desarrollado métodos de secuenciación basados en espectrometría de masas (MS), incluida la MS de arriba hacia abajo y la MS en tándem 1,2,3,4, para la secuenciación directa de ARN. Sin embargo, las técnicas de fragmentación in situ para generar eficazmente escaleras de ARN de alta calidad en espectrómetros de masas actualmente no se pueden aplicar a la secuenciación de novo ^5,6. Además, no es muy trivial analizar los datos tr....

Protocolo

1. Diseño de oligonucleótidos de ARN

1. Diseñar oligonucleótidos de ARN sintéticos con diferentes longitudes (19 nt, 20 nt y 21 nt), incluyendo uno (ARN #6) con nucleótidos canónicos y modificados. ψ se emplea como modelo para modificaciones que no alteran la masa, lo cual es un desafío para la secuenciación de MS porque tiene una masa idéntica a la de U. m⁵C se elige como modelo para las modificaciones que alteran la masa para demostrar la solidez del enfoque.
   
   ARN #1: 5'-HO-CGCAUCUGACUGACCAAAA-OH-3'
   ARN #2: 5'-HO-AUAGCCCAGUCAGUCUACGC-OH-3'
   ARN #3: 5'-HO-AAACCGUUACCAUUACUGAG-OH-3'
   ARN #4: 5'-HO-GC....

Resultados

Introducción de una etiqueta de biotina en el extremo 3' del ARN para producir escaleras de masa-t_R fácilmente identificables. En la Figura 1a se muestra el flujo de trabajo del enfoque MS Seq 2D-HELS. La marca hidrofóbica de biotina introducida en el extremo 3' del ARN (ver Sección 2) aumenta las masas y t_Rs de los componentes de la escalera marcados con 3' en comparación con los de sus contrapartes no marcadas. Por lo tanto, la curva de la escalera 3'.......

Discusión

A diferencia de la fragmentación de MS basada en tándem, la hidrólisis ácida altamente controlada se utiliza en el enfoque 2D-HELS MS Seq para fragmentar el ARN antes del análisis con un espectrómetro de masas ^9,10. Como resultado, el instrumento puede detectar cada fragmento degradado en ácido, formando el equivalente a una escalera de secuenciación. En condiciones óptimas, este método crea una escalera de secuencia "ideal" a pa.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de adenilación de ADN	de 5' New England Biolabs	E2610S	50uM concentración
6550 Q-TOF espectrómetro de masas	Agilent Technologies	5991-2116EN	Acoplado a un sistema 1290 Infinity LC
A (5´)pp(5&agudo;)Cp-TEG-biotina-3&agudo;	ChemGenes	91718	ATP y gamma purificados por HPLC
; S	Sigma-Aldrich	11162306001	Sal de litio
Bicine	Sigma-Aldrich	B8660	BioXtra, ≥ 99% (valoración)
Biotina maleimida	Vector Laboratories	SP-1501	Brazo largo
Columna C18	Waters	186003532	50 mm &veces; 2,1 mm Columna Xbridge C18 con un tamaño de partícula de 1,7 μ m
Concentrador de vacío centrífugo	Labconco	Refrig 115v/60hz 7310022	Labconco CentriVap
ChemBioDraw	PerkinElmer	ChemDraw Prime	Genere una estructura química y datos de propiedades de estructuras y fragmentos
CMC (N-ciclohexil-N?-(2-morfolinoetil)-carbodiimida meto-p-toluenosulfonato)	Sigma-Aldrich	2491-17-0	95% Purificar
Cianina 3 maleimida (Cy3)	Lumiprobe	11080	Agua
insoluble en agua tratada con DEPC	Thermo Fisher Scientific	AM9906	autoclave y certificada como libre de nucleasasThermo
	Fisher Scientific	108-18-9	99% Alfa Aesar
DMSO	Sigma-Aldrich	276855	Dimetilsulfóxido anhidro, 99,9%
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758	Anhidro, cristalino, Biorreactivo, apto para el cultivo celular
Ácido fórmico	Merck	64-18-6	98-100%, ACS reag, Ph Eur
Hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Thermo Fisher Scientific	920-66-1	99% Acros Organics Viales
de muestra LC-MS	Thermo Fisher Scientific	C4000-11	Viales de rosca de tornillo
de plástico Tapones de viales LC-MS	Muestreador automático Thermo Fisher	C5000-54A	Tapones roscados de rosca para viales Na
2CO3	Sigma-Aldrich	88975	BioUltra, >0,1 M Na2CO3, >0,2 M NaHCO3
Oligo Clean & Concentrador	Zymo Research	D4060	Columna de centrifugado
OriginLab		OriginLab OriginPro	Software de análisis y gráficos de datos
pCp-biotina	TriLink BioTechnologies	NU-1706-BIO	20 ul (1 mM)
RNA #1--#6	Tecnologías de ADN integradas	Oligonucleótidos de ARN personalizados ARN	monocatenario de 19nt-21nt, utilizados sin purificación adicional
Balanceo agitador de plataforma	VWR	Orbital Shaker Standard 1000	Rango de velocidad de 40 a 300 rpm
Perlas magnéticas de estreptavidina	Thermo Fisher Scientific	88816	Encuadernación aprox. 55ug conejo biotinilado lgG por mg de perlas
Cianina sulfonada3 maleimida	Lumiprobe	11380
T4 soluble en agua ADN ligasa 1	New England Biolabs	M0202S	400 unidades/uL
T4 polinucleótido quinasa	Sigma-Aldrich	T4PNK-RO	A partir del fago T4 am N81 pse T1 infectado con Escherichia coli BB
Tampón Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T6455	Tampón Tris-HCl, pH 10, 10&veces;, Recuperador de antígenos
Urea	Sigma-Aldrich	81871	Urea para síntesis. Nº CAS 57-13-6, Nº CE 200-315-5.

Diisopropilamina (DIPA)