Este artículo describe el aislamiento y el cultivo de las neuronas simpatizantes de ratas embrionarias de los ganglios cervicales superiores. También proporciona protocolos detallados para la tinción inmunocitoquímica y para la preparación de extractos neuronales para el análisis espectrométrico de masas.
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Artículo de método
Cultivar neuronas simpáticas de ratas de Ganglia cervical superior embrionario para análisis morfológico y proteómico
En este artículo
Resumen
Resumen
Las neuronas simpáticas de los ganglios cervicales superiores de rata embrionaria (SCG) se han utilizado como un sistema modelo in vitro para las neuronas periféricas para estudiar el crecimiento axonal, el tráfico de axonales, la sinaptogénesis, el crecimiento dendrítico, la plasticidad dendrítica y las interacciones nervio-objetivo en los sistemas de cultivo cooperativo. Este protocolo describe el aislamiento y la disociación de las neuronas de los ganglios cervicales superiores de los embriones de rata E21, seguido de la preparación y el mantenimiento de cultivos neuronales puros en medio libre de suero. Dado que las neuronas no se adhieren al plástico sin recubrimiento, las neuronas se cultivarán en cubiertas de vidrio de 12 mm o placas de 6 pocillos recubiertas con poli-D-lisina. Después del tratamiento con un agente antimitotico (Ara-C, citosina-D-arabinofuranoside), este protocolo genera cultivos neuronales saludables con menos del 5% de células no neuronales, que se pueden mantener durante más de un mes in vitro. Aunque las neuronas de SCG de rata embrionaria son multipolares con 5-8 dendritas in vivo; en condiciones libres de suero, estas neuronas extienden sólo un axón en el cultivo y continúan siendo unipolares durante el cultivo. Sin embargo, estas neuronas se pueden inducir para extender las dendritas en presencia de extracto de membrana del sótano, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), o 10% suero de ternera fetal. Estos cultivos neuronales homogéneos se pueden utilizar para la tinción inmunocitoquímica y para estudios bioquímicos. Este artículo también describe el protocolo optimizado para la tinción inmunocitoquímica para la proteína asociada a microtúbulos-2 (MAP-2) en estas neuronas y para la preparación de extractos neuronales para espectrometría de masas.
Introducción
Las neuronas simpáticas derivadas de los ganglios cervicales superiores embrionarios (SCG) se han utilizado ampliamente como un sistema de cultivo neuronal primario para estudiar muchos aspectos del desarrollo neuronal, incluida la dependencia del factor de crecimiento, interacciones neuron-target, señalización de neurotransmisores, crecimiento axonal, desarrollo de dendrita y plasticidad, sinaptogénesis y mecanismos de señalización subyacentes a las interacciones nervio-objetivo/neurona-glia1,2,3,4,5,....
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Protocolo
Todos los procedimientos realizados en estudios con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Saint Mary's College of California. Las pautas de cuidado y uso de animales en Saint Mary's College se desarrollaron sobre la base de las directrices proporcionadas por la Oficina de Bienestar Animal de Laboratorio en el Instituto Nacional de Salud (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf y https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf).
1. Preparación de medios de cultivo (también denominados medios de control)
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Resultados
Aislamiento y mantenimiento de cultivos neuronales de neuronas de SCG embrionarias
Las células disociadas del SCG embrionario de rata fueron chapadas en una placa o cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina y mantenidas en medios de cultivo libres de suero que contienen factor de crecimiento del nervio b. Las células disociadas que contienen una mezcla de neuronas y células gliales se ven circulares sobre el chapado (Figura 1A). Dentro de las 24 horas posteriores al encoj.......
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Discusión
Este artículo describe los protocolos para el cultivo de neuronas simpáticas de ganglios cervicales superiores de cachorros de rata embrionaria. Las ventajas de utilizar este sistema modelo son que es posible obtener una población homogénea de neuronas proporcionando una respuesta similar a los factores de crecimiento, y dado que los requisitos del factor de crecimiento para estas neuronas ha sido bien caracterizado, es posible crecer estas neuronas in vitro en medios definidos, en condiciones libres de suero
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la beca del Fondo de Desarrollo Docente y del Programa de Investigación de Verano en el Saint Mary's College of California. Los autores también quieren agradecer a la Dra. Pamela Lein de la Universidad de California en Davis y al Dr. Anthony Iavarone en la instalación de espectrometría de masas de UC Berkeley por sus consejos durante el desarrollo de estos protocolos. Los autores también quieren agradecer a Haley Nelson en la Oficina de Comunicaciones Universitarias del Saint Mary's College of California por su ayuda con la producción y edición de videos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Bicarbonato de amonio | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R& D Systems | 354-BP | |
| Suero bovino Alúmina | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Raspador de células | Corning | CLS-3010 | |
| Colagenasa | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar o Nunc Fondo plano Placas de cultivo celular | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Citosina- β- D-arabinofuranósido | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| Solución salina tamponada con D-fosfato (libre de calcio y magnesio) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispasa II | Roche | 4942078001 | |
| Agua destilada | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM - Glucosa baja + Glutamina, + piruvato de sodio | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Sin ácidos grasos BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL de stock en DMEM bajo en glucosa |
| Pinzas finas Dumont n.º 4 y n.º 5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Pinzas y tijeras para disección | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Cubrelips de vidrio - 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Cabra-Anti Ratón IgG Alexa 488 conjugado | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's Balanced Salt Soltion (sin calcio ni magnesio) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulina-Selenio-Transferrina (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Yodoacetamida | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamina | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 | medium Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Medios de montaje para cubreobjetos de vidrio | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Anticuerpo anti-MAP2 para ratones (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Factor de crecimiento nervioso | Envigo Bioproducts (anteriormente Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μ g/mL al 0,2% Prionex en DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicilina-Estreptomicina (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lisine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | Solución al 10%, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 x 1 mg |
| Synapt G2 Espectrometría de masas de alta definición | Waters Corporation | ||
| Ácido trifluoroacético - Grado de secuenciación | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tripsina | Promega o NEB | V511A, P8101S | 100 μ g o 5 x 20 mg |
| Waters Viales de recuperación total | Waters Corporation | 186000385c |
Referencias
- Rees, R. P., Bunge, M. B., Bunge, R. P. Morphological Changes in the neuritic growth cone and target neuron during synaptic junction development in culture. Journal of Cell Biology. 9, (1976).
- Chandrasekaran, V., Lein, P. J. Re....
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Reimpresiones y permisos
