Aquí se presentan métodos para comprender los efectos anticancerígenos del sobrenadante libre de células de Lactobacillus (LCFS). Las líneas celulares de cáncer colorrectal muestran muertes celulares cuando se tratan con LCFS en cultivos 3D. El proceso de generación de esferoides se puede optimizar dependiendo del andamio y los métodos de análisis presentados son útiles para evaluar las vías de señalización involucradas.
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Artículo de método
Evaluación de la muerte celular utilizando sobrenadante libre de células de probióticos en cultivos esferoides tridimensionales de células de cáncer colorrectal
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Resumen
Resumen
Este manuscrito describe un protocolo para evaluar las muertes de células cancerosas en esferoides tridimensionales (3D) de tipos multicelulares de células cancerosas utilizando sobrenadantes del cultivo celular de Lactobacillus fermentum, considerados como cultivos probióticos. El uso de cultivos 3D para probar el sobrenadante libre de células de Lactobacillus (LCFS) es una mejor opción que las pruebas en monocapas 2D, especialmente porque L. fermentum puede producir efectos anticancerígenos dentro del intestino. Se identificó que el sobrenadante L. fermentum posee un aumento de los efectos antiproliferativos contra varias células de cáncer colorrectal (CCR) en condiciones de cultivo 3D. Curiosamente, estos efectos estaban fuertemente relacionados con el modelo de cultivo, demostrando la notable capacidad de L. fermentum para inducir la muerte de las células cancerosas. Se generaron esferoides estables a partir de diversos RC (células de cáncer colorrectal) utilizando el protocolo que se presenta a continuación. Este protocolo de generación de esferoides 3D ahorra tiempo y es rentable. Este sistema fue desarrollado para investigar fácilmente los efectos anticancerígenos de LCFS en múltiples tipos de esferoides CRC. Como era de esperar, los esferoides del CCR tratados con LCFS indujeron fuertemente la muerte celular durante el experimento y expresaron marcadores moleculares específicos de apoptosis analizados por qRT-PCR, western blotting y análisis FACS. Por lo tanto, este método es valioso para explorar la viabilidad celular y evaluar la eficacia de los medicamentos contra el cáncer.
Introducción
Los probióticos son los microorganismos más ventajosos en el intestino que mejoran la homeostasis inmune y el metabolismo energético del huésped1. Los probióticos de Lactobacillus y Bifidobacterium son los más avanzados de su tipo que se encuentran en el intestino2,3. Investigaciones anteriores han demostrado que Lactobacillus tiene efectos inhibitorios y antiproliferativos en varios tipos de cáncer, incluido el cáncer colorrectal4. Además, los probióticos previenen las enfermedades inflamatorias intestinales, la enfermedad de Crohn y l....
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Protocolo
1. Cultivos celulares bacterianos y preparación de sobrenadante libre de células de Lactobacillus (LCFS)
NOTA: Los pasos 1.2 – 1.9 se llevan a cabo en una cámara anaeróbica.
- Prepare un plato de agar MRS y un caldo que contenga L-cisteína y esterilize en autoclave.
- Preincubar la placa de agar MRS en cámara anaeróbica H2 mantenida a 37 °C con 20 ppm de oxígeno.
- Descongelar la población bacteriana de Lactobacillus e inocular la placa de agar con el cultivo bacteriano (Figura 1A (i)).
- Incubar bacterias durante 2 - 3 días en cámar....
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Resultados
Describimos el protocolo de obtención de esferoides a partir de diversas líneas celulares de cáncer colorrectal. Se requirió suplementación con metilcelulosa para generar esferoides. También presentamos un método de preparación de LCFS y presentamos un modelo para estudiar la correlación entre los probióticos y el cáncer colorrectal. Los protocolos de formación de esferoides y preparación de LCFS se ilustran esquemáticamente en la Figura 1A,B. Como se muestra en
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Discusión
El microambiente tisular, incluyendo las células vecinas y la matriz extracelular (ECM), es fundamental para la generación de tejidos y crucial en el control del crecimiento celular y el desarrollo tisular13. Sin embargo, los cultivos 2D tienen varias desventajas, como la interrupción de las interacciones celulares, así como alteraciones en la morfología celular, los ambientes extracelulares y el enfoque de la división14. Los sistemas de cultivo celular 3D han sido rigurosa.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen divulgaciones financieras relevantes.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por los programas "Establecimiento de estándares de medición para química y radiación", número de subvención KRISS-2020-GP2020-0003, y "Desarrollo de estándares de medición y tecnología para biomateriales y convergencia médica", número de subvención KRISS-2020-GP2020-0004, financiado por el Instituto de Investigación de Estándares y Ciencia de Corea. Esta investigación también fue apoyada por el Ministerio de Ciencia y TIC (MSIT), la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF-2019M3A9F3065868), el Ministerio de Salud y Bienestar (MOHW), el Instituto de Desarrollo de la Industria de la Salud de Corea (KHIDI, HI20C0558), el Minister....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
10% Mini-PROTEAN TGX Geles de proteínas prefabricadas, 15 pocillos, 15 y micro; l | Biorad | 4561036 | paquete de 10 |
| películas adhesivas ópticas MicroAmp de Biosystems aplicadas | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 100 cubiertas |
| 10x tampón de transferencia | Intron | IBS-BT031A | 1 L |
| 10X Tris-Glycine (con SDS) | Intron | IBS-BT014 | 1 L |
| Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrífuga Tubo, Polipropileno, Transparente, No Estéril, 500 Tubos/Paquete, 10 Paquetes/Caja | Corning | SCT-200-C | 500 Tubos/Paquete, 10 Paquetes/Caja |
| BD Difco Bacto Agar | BD | 214010 | 500 g |
| BD Difco Lactobacilos MRS Caldo | BD | DF0881-17-5 | 500 g |
| CellTiter-Glo 3D Ensayo de viabilidad celular | Promega | G9681 | 100μ l/ensayo en placas de 96 pocillos |
| Cóctel completo de inhibidores de proteasa | Sigma-Aldrich | 11697498001 | vial de 20 comprimidos |
| Solución salina tamponada con fosfato Corning, 1X sin calcio ni magnesio, PH 7,4 ± 0,1 | Corning | 21-040-CV | 500 mL |
| EMD Millipore Immobilon-P Membranas de transferencia de PVDF | fisher Scientific | IPVH00010 | rollo de 26,5 cm x 3,75 m; Tamaño de poro: 0.45um |
| Falcon 5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo, con filtro de células Tapón a presión | Corning | 352235 | 25/Paquete, 500/Caja |
| Suero fetal bovino, certificado, origen en EE. UU. | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 500 mL |
| Kit de síntesis de ADNc iScript, 25 x 20 y micro; l rxns #1708890 | Biorad | 1708890 | 25 x 20 µ L rxns |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad 1725121 | 5 x 1 mL | |
| Lactobacillus fermentum | Colección coreana para cultivos tipo | KCTC 3112 | |
| Clorhidrato de L-cisteína monohidrato | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Metilcelulosa (3500-5600mPa· s, 2% en agua a 20 grados; C) | TCI | M0185 | 500 g |
| MicroAmp Placa de Reacción Óptica Rápida de 96 Pocillos con Código de Barras, 0,1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | 20 placas |
| Unidad de Filtro de Jeringa Millex-GS, 0,22 y micro; m, mezcla de ésteres de celulosa, 33 mm, óxido de etileno esterilizado | Millipore | SLGS033SB | 250 |
| PE Annexina V Kit de detección de apoptosis con 7-AAD | Biolegend | 640934 | 100 pruebas |
| Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 mL |
| de yoduro de propidio | Introgen | P1304MP | 100 mg |
| Tampón de lisis y extracción RIPA | Thermo Fisher Scientific | 89901 | 250 mL |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | 250 |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-119 | 500 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%), rojo fenol | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 100 mL |
| Nombre de materiales/Equipo/Software | Empresa | Número de catálogo | Comments/Description |
| anti - p-Iκ B&alfa; (B-9) | Santa cruze | sc-8404 | 200 y micro; g/mL |
| anti-BclxL (H-5) | Santa cruze | sc-8392 | 200 µ g/mL |
| anti-PARP 1 (C2-10) | Santa cruze | sc-53643 | 50 µ l ascitis |
| anti-β-actina (C4) | Santa cruze | sc-47778 | 200 µ g/mL |
| BD FACSVerse | BD Biosciences | San Diego, CA, EE. UU. | |
| Synergy HTX Lector de microplacas multimodo | BioT | S1LFA | |
| Incubadora de CO2 | Thermo fisher | HERAcell 150i | |
| Tubo cónico 15 ml | SPL | 50015 | |
| Tubo cónico 50 ml | SPL | 50050 | |
| Corning Costar Accesorio ultrabajo Placa de pocillos múltiples | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Corning Costar Fijación ultrabaja Placa de pocillos múltiples | Sigma-Aldrich | CLS3471 | |
| Costar 50 mL Depósitos de reactivos, 5/bolsa, estéril | Costar | 4870 | |
| Countess Cámara de recuento de células Portaobjetos | Thermofisher | C10228 | |
| Countess II FL Contador de células automatizado | invitrogen | ||
| Lector multimodo EnSpire | Perkin Elmer | Enspire 2300 | |
| Eppendorf Research Plus Pipeta multicanal, 8 canales | Eppendorf | 3122000051 | |
| FlowJo | TreeStar | Ashland, OR, EE. UU | |
| . Cabra Anti-ratón IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 115-035-062 | 1,5 mL |
| Cabra Anti-Conejo IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 111-035-144 | 2.0 mL |
| GraphPad Prisma 5 | GraphPad Software | Inc., San Diego, CA, EE. UU | |
| ImageJ | NIH | ||
| ImageQuant LAS 4000 mini | Fujifilm | Tokio, Japón | |
| Agitador incubado | Compañero de laboratorio | SIF-6000R | |
| Multi Gauge Ver. 3.0,Fujifilm | Tokio, Japón | ||
| Densidad óptica (OD)Espectrofotómetros Lambda UV/Vis | Perkin Elmer | Waltham, MA, EE. UU. | |
| Microscopio de contraste de fase | Olympus | Tokio, Japón | |
| Tubo de microcentrífuga SPL 1,5 ml | SPL | 60015 | |
| SPL Reservorios multicanal, 12 canales, PS, estéril | SPL | 21012 | |
| Sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Waltham, MA, EE. UU. | |
| Procesadores de líquidos ultrasónicos Vibra-Cell | SONICS-vibra cell | VC 505 | Procesador ultrasónico de 500 vatios |
| Cámara anaeróbica de vinilo | PRODUCTOS DE COY LAB |
Referencias
- Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa. Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).
- Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., Sánchez, B., Margolles, A.
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Reimpresiones y permisos
