Ensayos para validar los inhibidores de la acetiltransferasa histona

Resumen

Los inhibidores de las acetiltransferasas de histona (HATs, también conocidos como acetiltransferasas de lisina), como CBP/p300, son terapias potenciales para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, se necesitan métodos rigurosos para validar estos inhibidores. Tres métodos in vitro para la validación incluyen ensayos HAT con acetiltransferasas recombinantes, inmunoblotting para la acetilación de histona en el cultivo celular, y ChIP-qPCR.

Resumen

Las acetiltransferasas de lisina (KAT) catalizan la acetilación de los residuos de lisina en histonas y otras proteínas para regular la dinámica de la cromatina y la expresión génica. Los TCC, como cbP/p300, están bajo intensa investigación como dianas terapéuticas debido a su papel crítico en la tumorigenesis de diversos tipos de cáncer. El desarrollo de nuevos inhibidores de moléculas pequeñas dirigidos a la función de la histona acetiltransferasa (HAT) de los TCA es un reto y requiere ensayos robustos que puedan validar la especificidad y potencia de los posibles inhibidores.

En este artículo se describe una canalización de tres métodos que proporcionan una validación in vitro rigurosa para nuevos inhibidores de HAT (HATi). Estos métodos incluyen un ensayo HAT de tubo de ensayo, un ensayo de inhibición de la hiperacetilación de cromatina (ChHAI) y PCR cuantitativo con inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-qPCR). En el ensayo HAT, los HAT recombinantes se incuban con histonas en una reacción del tubo de ensayo, lo que permite la acetilación de residuos específicos de lisina en las colas de histona. Esta reacción puede ser bloqueada por un HATi y los niveles relativos de acetilación de histona específica del sitio se pueden medir a través de inmunoblotting. Los inhibidores identificados en el ensayo HAT deben ser confirmados en el entorno celular.

El ensayo ChHAI utiliza inmunoblotting para detectar nuevos HATi que atenúan la hiperacetilación robusta de las histonas inducidas por un inhibidor de la histona deacetilasa (HDACi). La adición de un HDACi es útil porque los niveles basales de la acetilación de histona pueden ser difíciles de detectar a través de inmunoblotting.

Los ensayos HAT y ChHAI miden los cambios globales en la acetilación de histona, pero no proporcionan información sobre la acetilción en regiones genómicas específicas. Por lo tanto, ChIP-qPCR se utiliza para investigar los efectos de HATi en los niveles de acetilación de histona en los elementos reguladores de genes. Esto se logra a través de la inmunoprecipitación selectiva de complejos histone-ADN y el análisis del ADN purificado a través de qPCR. Juntos, estos tres ensayos permiten la validación cuidadosa de la especificidad, potencia y mecanismo de acción de la nueva HATi.

Introducción

Las acetiltransferasas de lisina (KAT) catalizan la acetilación de los residuos de lisina en proteínas histonas y no histonas^1,2,3,4. Investigaciones recientes revelan que los KAT y su función acetiltransferasa pueden promover el crecimiento sólido del tumor^4,5,6,7,8,9. Por ejemplo, la proteína de unión a CREB (CBP)/p300 son dos KAT paralogos que....

Protocolo

1. Ensayo HAT in vitro

1. Preparación de búferes
   NOTA: Consulte la Tabla 1 para las recetas de búfer.
   1. Preparar el tampón de ensayo 5x y el sulfato de Dodecyl de sodio 6x (SDS) y almacenar a -20 oC. Alícuota SDS en 1 ml de alícuotas.
   2. Prepare el tampón de funcionamiento de gel SDS 10x y 10 veces TBST y guárdelo a temperatura ambiente.
   3. Preparar 1x tampón de transferencia y almacenar a 4 oC.
      ADVERTENCIA: Compruebe la ficha de datos de seguridad para ver todos los productos químicos utilizados en este protocolo. La SDS, la TDT y el azul de bromofenol son tóxicos y no deben ingerirse, inhalarse ni....

Resultados

El ensayo in vitro de histona acetiltransferasa (HAT) se puede utilizar para sondear compuestos que inhiben la actividad de p300 HAT hacia un sustrato de histona. La Figura 1A proporciona un esquema experimental para el ensayo HAT. El ácido anacardico, conocido HATi^3,38, se utilizó en este ensayo en un rango de concentración de 12,5-100 M. A 100 m, el ácido anacardico reduce las regulaciones p300 y cataliza la acetilción histona en H.......

Discusión

Acetiltransferasas de lisina (KAT) acetillasoar varios residuos de lisina en las colas de histona y factores de transcripción para regular la transcripción genética^2,3. El trabajo en las últimas dos décadas ha revelado que los KAT, como CBP/p300, PCAF y GCN5, interactúan con factores de transcripción oncogénicos y ayudan a impulsar el crecimiento tumoral en varios tipos de tumores sólidos^4,,5,,.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de 1,5 ml	Fisher Scientific	05-408-129	Para todos los métodos
plato de 10 cm	Sarstedt AG & Co.	83.3902	Para el cultivo celular de células MCF-7
10 consejos ul	Fisher Scientific	02-707-454	Para todos los métodos
1000 consejos ul	Corning	4846	Para todos los métodos
10X Tampón			Para el método 3. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
		en ejecución 10X	para los métodos 1 y 2. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
10X TBST			para los métodos 1 y 2. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
Plato de 12 pocillos	Corning	3513	Para el método 2
plato de 15 cm	Sarstedt AG & Co.	83.3903	Para el Método 3
Tubo cónico de 15 ml	Santa Cruz Biotechnology	sc-200249	Para los Métodos 2 y 3
1X TBST con 5% de leche y 0,02% de azida de			Para los Métodos 1 y 2. Se puede usar para diluir anticuerpos primarios que se usarán más de una vez. Permite el almacenamiento a corto plazo de diluciones de anticuerpos primarios. No lo use para la dilución secundaria de anticuerpos. PRECAUCIÓN: La azida de sodio es tóxica.
1X TBST con leche			para los métodos 1 y 2. Se utiliza para bloquear la membrana de PVDF y para la dilatación de anticuerpos. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
200 consejos ul	Corning	4844	Para todos los métodos
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148	para la preparación de tampón de muestra SDS
4-20% gel de poliacrilamida	Thermo Fisher: Invitrogen	XP04205BOX	para los métodos 1 y 2
Tampón			para el método 1. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
		lisis pasivo 5X	para el método 2. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
6X Dodecil Sulfato de Sodio (SDS)			Para los Métodos 1 y 2. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
A-485	MedChemExpress	HY-107455	CBP/p300 Inhbitor para uso en los Métodos 2 y 3. Disuelto en DMSO.
Anticuerpo acetil-CBP (K1535) / p300 (K1499)	Tecnología de señalización celular	4771	para el método 1
Acetil-CoA	Sigma-Aldrich	A2056	para uso en el método 1
Anticuerpo de acetil-histona H3 (Lys 27) (H3K27ac)	Tecnología de señalización celular	CST 8173	antoicuerpos para H3K27ac para inmunoblots y ChIP
Anticuerpo acetil-histona H3 (Lys18) (H3K18ac)	Tecnología de señalización celular	Antoicuerpos CST 9675	para H3K18ac para inmunoblots y anticuerpo ChIP
alfa tubulina	Millipore Sigma	T5168	para el Método 2. Diluir ácido anacárdico 1:20.000
	Cayman Chemical	13144	para el método 1
anticuerpo secundario IgG de ratón HRP tecnología	de señalización celular	7076	para los métodos 1 y 2. Diluir 1:10,000
anticuerpo secundario IgG anti-conejo	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	para los métodos 1 y 2. Diluir 1:10.000 a 1:20.000
Película de autorradiografía	MIDSCI	BX810	Para los métodos 1 y 2
Plataforma giratoria para bailarinas del vientre	Stovall Life Science Incorporated	no disponible	Para los métodos 1 y 2
Suero de ternero bovino (BCS)	HyClone	SH30072.03	medios de cultivo celular
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	para la preparación de tampones
Azul de bromofenol	Sigma-Aldrich	B0126	para la preparación de tampón de muestra SDS
	CDTA Spectrum Chemical	125572-95-4	Para la preparación de tampones
raspador de células	Millipore Sigma	CLS3010	Para el método 3
Tampón			Para el método 3. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
Tampón			para el método 3. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
DMEM completo para celdas MCF-7 para los			métodos 2 y 3. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
Covaris 130 y micro; l microTUBE	Covaris	520045	Tubo de sonicación para uso con Covaris S220 en el Método 3
Covaris S220 Ultrasonido focalizado Covaris		S220	Sonicador de ADN para uso en el Método 3
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	41639	para la dilución de fármacos y el tratamiento de control de vehículos
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815	para tampón de muestras SDS preparación
DMEM	Corning	10-013-CV	medio de cultivo celular
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1	para la preparación de tampones
Ejemplo de tanque de transferencia y aparato	de transferencia Bio-rad	1704070	para los métodos 1 y 2
EZ-Magna ChIP A/G Kit de inmunoprecipitación de cromatina	Millipore Sigma	17-10086	para el método 3
FK228 ( Romidepsina)	Cayman Chemical	128517-07-7	Inhibidor de HDAC para uso en el Método 2
Solución de formaldehído	Sigma-Aldrich	F8775	para la fijación celular
glicerol	Fisher Scientific	BP229-1	Para la preparación de tampones
glicina	Sigma-Aldrich	G7126	para la preparación de tampones
HEPES	Sigma-Aldrich	54457	para Preparación de tampones
		lavado con alto contenido de sal	Para el método 3
IGEPAL (NP-40)	Sigma-Aldrich	I3021	para la preparación de tampones
Immobilon Sustrato HRP quimioluminiscente	Millipore Sigma	WBKLS0500	para los métodos 1 y 2
KCl	Fisher Scientific	BP366-500	para la preparación de tampones
LiCl	Sigma-Aldrich	L9650	Para la preparación del tampón
Tampón			LiCl Para el Método 3. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
		de lavado bajo en sal	para el método 3. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
Separador magnético	Promega	Z5341	Para uso en el Método 3
	Metanol Sigma-Aldrich	494437	Para la preparación de tampones
Mini tanque de gel	Invitrogen	A25977	Para los Métodos 1 y 2
MS-275 (Entinostat)	Cayman Chemical	209783-80-2	Inhibidor de HDAC para uso en el Método 2. Disuelto en DMSO.
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5	para la preparación de tampones
NaOH	Fisher Scientific	S318-100	para la preparación de tampones en los Métodos 1 y 2
Normal Rabbit IgG	Bethyl Laboratories	P120-101	Anticuerpo de control de conejo para uso en el Método 3
Tampón			Para el Método 3. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
Kit de limpieza de PCR	Qiagen	28104	Para uso en el Método 3
Penicilina/Estreptomicina 100X	Medios de cultivo celular	Corning	30-002-CI
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Corning	21-040-CV	Para los métodos 2 y 3
PIPES	Sigma-Aldrich	80635	para la preparación de tampones
leche en polvo	Nestlé Carnation		para Métodos 1 y 2
Power Pac 200 para la transferencia de Western blot	Bio-rad		Para los métodos 1 y 2
Power Pac 3000 para el funcionamiento del gel SDS	Bio-rad		para los métodos 1 y 2
Escalera de proteínas preteñida	Thermo Fisher	26616	Para los métodos 1 y 2
Cóctel de inhibidores de proteasa	Sigma-Aldrich	PI8340	para uso en el método 3
Proteína A Magentic Beads	New England BioLabs	S1425S	Para uso en el Método 3
Proteinasa K	New England BioLabs	P8107S	Para uso en el Método 3
PTC-100 Controlador térmico programable	MJ Research Inc.	PTC-100	para el método 1
Membrana de transferencia de PVDF	Millipore Sigma	IEVH00005	para los métodos 1 y 2
H3.1 recombinante	New England BioLabs	M2503S	para uso en el método 1
p300 recombinante	ENZO Life Sciences	BML-SE451-0100	para uso en el método 1
SAHA (Vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	Inhibidor de HDAC para uso en el método 2
		de lisis SDS	para el método 3. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
Azida de sodio	Fisher Scientific	26628-22-8	para los métodos 1 y 2. PRECAUCIÓN: La azida de sodio es tóxica. Consulte SDS para obtener información sobre el manejo adecuado.
Bicarbonato de sodio	Fisher Scientific	S233-500	para la preparación de tampones
Desoxicolato de sodio	Sigma-Aldrich	D6750	para la preparación de tampones
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	Sigma-Aldrich	71725	para la preparación de tampones de muestras SDS
Heatblock estándar	VWR Scientific Products	Np. de artículo del fabricante: 949030	Para los métodos 1 y 2
Tablero centrífuga	Eppendorf	5417R	Para todos los métodos
Tampón			Para el método 3. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
Búfer			para los métodos 1 y 2. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
Trichostatina A	Cayman Chemical	58880-19-6	Inhibidor de HDAC para uso en el Método 2
Tris	Fisher Scientific	BP152-5	para la preparación de tampones
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	para la preparación de tampones
Tween 20	Sigma-Aldrich	9005-64-5	para la preparación de tampones en los métodos 1 y 2
Procesador	de película de rayos XKonica Minolta Medical & Gráfico, Inc.	SRX-101A	para los métodos 1 y 2

de glicina Búfer sodio al 5% de ensayo 5X Tampón de de dilución ChIP de elución ChIP Tampón de de lavado Tampón de hinchazón de núcleos Tampón TE de transferencia