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Artículo de método

Ensayos para validar los inhibidores de la acetiltransferasa histona

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DOI:

10.3791/61289

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6 de agosto de 2020

 , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, and UF Health Cancer Center, University of Florida College of Medicine

En este artículo

Resumen

Los inhibidores de las acetiltransferasas de histona (HATs, también conocidos como acetiltransferasas de lisina), como CBP/p300, son terapias potenciales para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, se necesitan métodos rigurosos para validar estos inhibidores. Tres métodos in vitro para la validación incluyen ensayos HAT con acetiltransferasas recombinantes, inmunoblotting para la acetilación de histona en el cultivo celular, y ChIP-qPCR.

Resumen

Las acetiltransferasas de lisina (KAT) catalizan la acetilación de los residuos de lisina en histonas y otras proteínas para regular la dinámica de la cromatina y la expresión génica. Los TCC, como cbP/p300, están bajo intensa investigación como dianas terapéuticas debido a su papel crítico en la tumorigenesis de diversos tipos de cáncer. El desarrollo de nuevos inhibidores de moléculas pequeñas dirigidos a la función de la histona acetiltransferasa (HAT) de los TCA es un reto y requiere ensayos robustos que puedan validar la especificidad y potencia de los posibles inhibidores.

En este artículo se describe una canalización de tres métodos que proporcionan una validación in vitro rigurosa para nuevos inhibidores de HAT (HATi). Estos métodos incluyen un ensayo HAT de tubo de ensayo, un ensayo de inhibición de la hiperacetilación de cromatina (ChHAI) y PCR cuantitativo con inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-qPCR). En el ensayo HAT, los HAT recombinantes se incuban con histonas en una reacción del tubo de ensayo, lo que permite la acetilación de residuos específicos de lisina en las colas de histona. Esta reacción puede ser bloqueada por un HATi y los niveles relativos de acetilación de histona específica del sitio se pueden medir a través de inmunoblotting. Los inhibidores identificados en el ensayo HAT deben ser confirmados en el entorno celular.

El ensayo ChHAI utiliza inmunoblotting para detectar nuevos HATi que atenúan la hiperacetilación robusta de las histonas inducidas por un inhibidor de la histona deacetilasa (HDACi). La adición de un HDACi es útil porque los niveles basales de la acetilación de histona pueden ser difíciles de detectar a través de inmunoblotting.

Los ensayos HAT y ChHAI miden los cambios globales en la acetilación de histona, pero no proporcionan información sobre la acetilción en regiones genómicas específicas. Por lo tanto, ChIP-qPCR se utiliza para investigar los efectos de HATi en los niveles de acetilación de histona en los elementos reguladores de genes. Esto se logra a través de la inmunoprecipitación selectiva de complejos histone-ADN y el análisis del ADN purificado a través de qPCR. Juntos, estos tres ensayos permiten la validación cuidadosa de la especificidad, potencia y mecanismo de acción de la nueva HATi.

Introducción

Las acetiltransferasas de lisina (KAT) catalizan la acetilación de los residuos de lisina en proteínas histonas y no histonas1,2,3,4. Investigaciones recientes revelan que los KAT y su función acetiltransferasa pueden promover el crecimiento sólido del tumor4,5,6,7,8,9. Por ejemplo, la proteína de unión a CREB (CBP)/p300 son dos KAT paralogos que regulan numerosas vías de señalización en el cáncer2,,3. CBP/p300 tienen una función de histona acetiltransferasa (HAT) bien caracterizada y catalizan Histone 3 lisina 27 acetillación (H3K27ac)2,4,5,10,11, un marcador importante para potenciadores activos, regiones promotoras y transcripción genética activa12,13,14. CBP/p300 sirven como co-activadores críticos para las vías de señalización pro-crecimiento en tumores sólidos mediante la activación de la transcripción de oncogenes a través de la acetilación de histonas y otros factores de transcripción4,9,15,16,17,18. Debido a su papel en la progresión tumoral, CBP/p300 y otros KAT están siendo investigados para el desarrollo de nuevos inhibidores que bloquean su función oncogénica4,,5,,6,7,8,9,18,19,20. A-485 y GNE-049 representan dos intentos exitosos de desarrollar inhibidores potentes y específicos para CBP/p3004,,9. Actualmente se están investigando inhibidores adicionales para CBP/p300 y otros TCC.

Se está cuestionando la calidad de los inhibidores de la KAT descritos anteriormente (KATi), con muchos inhibidores que muestran los efectos diana y la mala caracterización21. Por lo tanto, la caracterización y validación rigurosas de nuevos candidatos a medicamentos es esencial para el desarrollo de sondas químicas de alta calidad. Aquí se describen tres protocolos que forman una canalización para el cribado y la validación rigurosa de la potencia y especificidad de la nueva KATi, con un enfoque específico en la inhibición de la función HAT (HATi) de los KAT. CBP/p300 y sus inhibidores se utilizan como ejemplos, pero estos protocolos se pueden adaptar para otros KAT que tienen una función HAT7.

El primer protocolo es un ensayo in vitro de histona acetiltransferasa (HAT) que utiliza p300 recombinante purificado e histonas en una reacción controlada del tubo de ensayo. Este ensayo es fácil de realizar, es rentable, se puede utilizar para examinar compuestos en un entorno de bajo rendimiento y no requiere materiales radiactivos. En este protocolo, la acetilación de lisina recombinante p300 cataliza la lisina en las colas histonas durante un breve período de incubación y los niveles de acetilación de histona se miden mediante procedimientos de inmunoblotting estándar. La reacción enzimática se puede realizar en presencia o ausencia de inhibidores de CBP/p300 para detectar compuestos que reducen la acetilación de histona. Además, el ensayo HAT se puede utilizar para verificar si los compuestos nuevos son selectivos para CBP/p300 evaluando su actividad contra otros KAT purificados, como pcAF. El ensayo HAT es un excelente punto de partida para investigar nuevos inhibidores debido a su simplicidad, bajo costo y la capacidad de determinar la potencia/selectividad de un inhibidor. De hecho, este protocolo se utiliza a menudo en la literatura como una pantalla in vitro5,10. Sin embargo, los inhibidores identificados en el ensayo HAT no siempre son eficaces en el cultivo celular porque una reacción del tubo de ensayo es mucho más simple que un sistema celular vivo. Por lo tanto, es esencial caracterizar aún más los inhibidores en los experimentos de cultivo celular22,,23.

El segundo protocolo en la canalización es el ensayo de inhibición de la hiperacetilación de cromatina (ChHAI). Este ensayo basado en células utiliza inhibidores de la histona deacetilasa (HDACi) como una herramienta para hiperacetilar histonas en cromatina antes de la incubación con un HATi24. La acetilación basal de histona puede ser baja en el cultivo celular, lo que dificulta la sondeo a través de inmunoblotting sin la adición de un HDACi para aumentar la acetilación. El propósito del ensayo ChHAI es identificar nuevos HATi que pueden atenuar el aumento de la acetilción histona causada por la inhibición del HDAC. Las ventajas de este ensayo incluyen su bajo costo, relativa facilidad de realizar, y el uso de células en el cultivo, que proporciona más relevancia fisiológica que el ensayo HAT del tubo de ensayo. Al igual que el ensayo HAT, este protocolo utiliza inmunoblotting estándar para la recopilación de datos.

Los ensayos HAT y ChHAI proporcionan datos sobre la potencia de los nuevos compuestos para inhibir la acetilación de la histona global, pero no proporcionan información sobre cómo estos compuestos afectan las modificaciones en regiones genómicas específicas. Por lo tanto, el protocolo final, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) es un experimento de cultivo celular que investiga las interacciones ADN-proteína en regiones específicas del genoma. En el protocolo ChIP, la cromatina se reticula para preservar las interacciones ADN-proteína. A continuación, la cromatina se extrae de las células y el complejo de proteínas del ADN se somete a inmunoprecipitación selectiva para la proteína de interés (por ejemplo, utilizando un anticuerpo específico para H3K27ac). El ADN se purifica y analiza utilizando qPCR. Por ejemplo, ChIP-qPCR se puede utilizar para determinar si una nueva HATi regula la acetilción histona en oncogenes individuales, como Cyclin D125. Mientras que ChIP-qPCR es una técnica común utilizada en el campo, puede ser difícil optimizar4,10,26. Este protocolo proporciona consejos para evitar posibles escollos que pueden producirse al realizar el procedimiento ChIP-qPCR e incluye comprobaciones de control de calidad que se deben realizar en los datos.

Cuando se utilizan juntos, estos tres protocolos permiten la caracterización y validación rigurosas de la nueva HATi. Además, estos métodos ofrecen muchas ventajas porque son fáciles de realizar, relativamente baratos y proporcionan datos sobre la acetilación de histona global y regional.

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Protocolo

1. Ensayo HAT in vitro

  1. Preparación de búferes
    NOTA: Consulte la Tabla 1 para las recetas de búfer.
    1. Preparar el tampón de ensayo 5x y el sulfato de Dodecyl de sodio 6x (SDS) y almacenar a -20 oC. Alícuota SDS en 1 ml de alícuotas.
    2. Prepare el tampón de funcionamiento de gel SDS 10x y 10 veces TBST y guárdelo a temperatura ambiente.
    3. Preparar 1x tampón de transferencia y almacenar a 4 oC.
      ADVERTENCIA: Compruebe la ficha de datos de seguridad para ver todos los productos químicos utilizados en este protocolo. La SDS, la TDT y el azul de bromofenol son tóxicos y no deben ingerirse, inhalarse ni exponerse a la piel ni a los ojos. Consulte la ficha de datos de seguridad para conocer los procedimientos de manipulación adecuados. Utilice una campana de humo química para manipular productos químicos peligrosos.
  2. Reacción HAT
    NOTA: El ácido anacardico es un inhibidor conocido de p3003 y se utiliza como ejemplo para demostrar cómo el ensayo HAT puede identificar nuevos inhibidores de p300. Consulte Protocolo suplementario ( Esquema1) para obtener un esquema del paso 1.2.1.
    1. Preparar la siguiente reacción enzimática en un tubo de PCR de 0,2 ml: 2 ml de tampón de ensayo 5x, 1 l de p300 purificado (0,19 g/l), 1 l de ácido anacardico (HATi) o control DMSO diluido en tampón de ensayo 1x y 2 ml de ddH autoclavedo2O. Preincigula esta mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, añada 3 l de acetil-coa de 100 m y 1 l de H3.1 purificado (0,2 g/L) a la reacción.
    2. Incubar la mezcla de reacción completa a 30oC durante 1 h en un ciclor térmico de PCR.
    3. Agregue 2-mercaptoetanol en una proporción 1:10 al búfer de muestra 6x SDS.
    4. Retire las muestras del ciclor térmico pcR y añada 2 l de SDS 6x (con 2-mercaptoetanol añadido) a la mezcla de reacción.
      ADVERTENCIA: 2-mercaptoetanol es tóxico y debe utilizarse dentro de una campana de humo químico. Consulte la ficha de datos de seguridad para un manejo adecuado.
    5. Caliente las muestras a 95 oC durante 5 minutos en un bloque de calor y enfríe sobre hielo. Almacene las muestras a -20 o -80 oC o realice electroforesis de gel e inmunoblotting como se detalla a continuación.
  3. Electroforesis de gel e inmunoblotting
    NOTA: Si no está familiarizado con la electroforesis de gel y la inmunoblotting, consulte este procedimiento estándar27 para obtener más detalles sobre cómo realizar los pasos 1.3.1-1.3.17. Puede encontrar información adicional aquí28,29,30,31,32,33.
    1. Pipetear 10 l de muestras (desde el paso 1.2.5.) hasta los pomos de un gel de poliacrilamida de 4-20% de gradiente. Pipetear 5 l de la escalera de proteínas en uno de los pozos como referencia de peso molecular. Ejecute el gel a 120 V durante 90 minutos con un depósito de gel.
    2. Transfiera el gel a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) a 100 V durante 70 min utilizando un tanque de transferencia.
    3. Retire la membrana del aparato de transferencia y colóquela en un recipiente de plástico. Bloquee la membrana añadiendo 1x TBST (que contiene 5% de leche) al recipiente y agite suavemente durante 1 h a temperatura ambiente.
    4. Quite el 1x TBST del paso 1.3.3. Incubar la membrana durante la noche con anticuerpos primarios de acetil específicos del sitio seleccionados (p. ej., anticuerpos primarios H3K18ac o H3K27ac a una dilución de 1:5.000 en 1x TBST que contiene 5% de leche) a 4 oC con agitación suave.
    5. Retire la solución primaria de anticuerpos. Lavar la membrana 2x con 1x TBST (sin leche) a temperatura ambiente con agitación suave durante 15 minutos cada lavado.
    6. Diluir el anticuerpo secundario a 1:20.000 en 1x TBST (que contiene 5% de leche) e incubar la membrana durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave.
    7. Retire la solución de anticuerpos secundaria. Lavar la membrana 2x con 1x TBST (sin leche) a temperatura ambiente con agitación suave durante 15 minutos cada lavado.
    8. Escurra el 1x TBST de la membrana. Mezclar la solución de peróxido de sustrato HRP y la solución de luminol de sustrato HRP en una relación 1:1 (1 ml de cada uno) y pipeta 2 ml de la solución combinada a la superficie de la membrana.
    9. Incubar la solución con la membrana durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    10. Escurra el exceso de sustrato quimiominiscente de la membrana sobre una toalla de papel y coloque la membrana en una envoltura de plástico dentro de un soporte de casete de rayos X.
    11. Muévase a una sala oscura dedicada al procesamiento de películas de rayos X. Exponga la membrana a una película de rayos X colocando la película encima de la membrana y cerrando el cassette durante 30 s.
      NOTA: El tiempo de contacto entre la película y la membrana debe determinarse experimentalmente. Las señales fuertes necesitarán exposiciones cortas (segundos) y las señales más débiles pueden necesitar exposiciones más largas.
    12. Retire la película de rayos X del cassette y procese la película ejecutándola a través de un procesador de película de rayos X. Consulte los manuales del fabricante para obtener instrucciones específicas sobre cómo procesar la película de rayos X.
    13. Retire la membrana de la envoltura de plástico y lávela con ddH2O durante 5 minutos a temperatura ambiente con un suave temblor.
    14. Incubar la membrana con 0,2 M NaOH durante 5 min a temperatura ambiente con agitación suave.
    15. Lavar la membrana con ddH2O durante 5 minutos a temperatura ambiente con agitación suave.
    16. Bloquee la membrana añadiendo 1x TBST (que contiene 5% de leche) al recipiente y agite suavemente durante 1 h a temperatura ambiente.
    17. Añadir la siguiente dilución primaria de anticuerpos (p. ej., sonda para H3K27ac si el primer anticuerpo utilizado fue H3K18ac) y agitar durante la noche a 4 oC. Repita los pasos 1.3.4-1.3.17 hasta que se completen todas las sondas de anticuerpos.

2. Ensayo ChHAI

  1. Tratamientos farmacológicos in vitro y análisis de histonas acetiladas
    NOTA: A-485 es un potente y bien caracterizado p300 HATi2,4 . Este inhibidor se utilizará en los ensayos restantes debido a su eficacia y especificidad en el cultivo celular. MS-275 (Entinostat)24 es un HDACi que aumenta notablemente los niveles de acetilación de histona y se utiliza para facilitar la detección de sondas de acetilación con inmunoblotting estándar. Ver Protocolo Suplementario (Esquema 2) para un esquema de las diluciones de drogas utilizadas en el paso 2.1.
    1. Siembra 100.000 células MCF-7 en una placa de 12 pozos y permite que las células crezcan a 80-90% de confluencia en 1 ml del medio de cultivo celular. Marque los pozos para el siguiente diseño experimental: pozo 1: control DMSO (punto de referencia); pozo 2: A-485 (3 M); pozo 3: A-485 (10 m); pozo 4: MS-275 (3 m); bien 5: MS-275 (3 m) + A-485 (3 m); pozo 6: MS-275 (3 m) + A-485 (10 m).
      NOTA: Para el cultivo de células MCF-7, utilice medios DMEM completos y permita que las células crezcan a 37 oC con 5% de CO2. Consulte la Tabla 1 para ver la receta completa de DMEM.
    2. A las 24 horas después de la siembra, pipeta 4 mL de soporte DMEM completo a un tubo cónico estéril de 15 ml. Pipetear 2 l de MS-275 (6 mM en DMSO) a los 4 ml de medio para una concentración final de 3 mM MS-275.
    3. Pipetear 2 l de DMSO a 4 ml de medio en un tubo cónico estéril separado de 15 ml.
      ADVERTENCIA: Por favor, compruebe la hoja de datos de seguridad para el manejo adecuado de DMSO. Algunos tipos de guantes no están clasificados para el manejo de DMSO.
    4. Aspirar el medio de cultivo celular de los pozos 4-6 y la pipeta 1 mL de 3 mS-275 en medio (paso 2.1.2) a cada pocótula. Deseche el MS-275 diluido no utilizado.
    5. Aspirar el medio de cultivo celular de los pozos 1-3 y la pipeta 1 mL de DMSO diluido (paso 2.1.3) a cada pozo. Deseche el DMSO diluido no utilizado.
    6. Devolver las células a la incubadora e incubar durante 4 horas para permitir la acumulación de histonas acetiladas en las células expuestas a MS-275 (pozos 4-6).
      NOTA: MS-275 es un HDACi y causará hiperacetilidad histona24. Esta pre-incubación de 4 h es necesaria para permitir que la MS-275 induzca hiperacetillación antes de la adición de A-485, que reduce la acetilción de histona2,4.
    7. Después de 4 h de incubación con MS-275, preparar las siguientes diluciones en tubos estériles separados de 1,5 ml por pipeteo: 1,0 ml de DMSO a 1 ml de medios DMEM; 0,5 l de DMSO y 0,5 l A-485 (6 mM) a 1 ml de medios DMEM; 0,5 l de DMSO y 0,5 l de A-485 (20 mM) a 1 ml de medios DMEM; 0,5 l de DMSO y 0,5 l de MS-275 (6 mM) a 1 ml de medios DMEM; 0,5 l de A-485 (6 mM) y 0,5 l de MS-275 (6 mM) a 1 ml de medios DMEM; 0,5 l de A-485 (20 mM) y 0,5 l de MS-275 (6 mM) a 1 ml de medios DMEM.
    8. Aspirar el medio de cultivo celular de los pozos 1-6 y pipeta 1 mL de dilución 1 a pozo 1, dilución 2 a pozo 2, dilución 3 a pozo 3, dilución 4 a pozo 4, dilución 5 a pozo 5, y dilución 6 a pozo 6.
      NOTA: Una regla general es equilibrar el contenido de DMSO (solvente) entre grupos experimentales y no exceder el 0,1% de contenido de DMSO en el cultivo celular para evitar la toxicidad celular y los cambios en la proliferación.
    9. Devuelva las células a la incubadora y al cultivo durante 20 h.
    10. Después de 20 h, aspirar el medio de cultivo celular de los pozos 1-6.
    11. Lavar las células pipeteando 1 ml de PBS a pozos 1-6. Aspirar el PBS.
    12. Agregue 100 l de 1x tampón de lisis pasiva (ver Tabla 1) a los pozos 1-6. Almacene la placa de cultivo celular (con muestras en el búfer de lisis pasiva) a 80 oC durante la noche para congelar el deshielo y la lisis de las células.
      ADVERTENCIA: Compruebe la hoja de datos de seguridad para todos los productos químicos antes de hacer tampones. La CDTA puede causar daños oculares graves e irritación.
    13. Descongelar muestras a temperatura ambiente con agitación suave durante 10 min. Transfiera las muestras a tubos separados de 1,5 ml y colóquelos inmediatamente sobre hielo.
    14. Mida la concentración proteica de cada muestra. La concentración de proteínas se puede determinar utilizando varios protocolos bien establecidos34.
    15. Equilibrar la concentración de proteínas entre las muestras 1-6 (en un volumen igual) utilizando 1x tampón de lisis pasiva para diluir, según sea necesario.
    16. Agregue 2-mercaptoetanol en una proporción de 1:10 a 6x búfer de muestra SDS.
    17. Agregue 6x tampón de muestra SDS con 2-mercaptoetanol a las muestras 1-6 a una concentración final de 1x búfer de muestra SDS.
    18. Caliente las muestras a 95 oC durante 5 minutos en un bloque de calor y enfríe sobre hielo. Las muestras se pueden almacenar a -20 oC o -80 oC hasta el paso 2.1.19.
    19. Pipetear un volumen que contenga 30 g de proteína para muestras de 1-6 a los pocós en un gel de poliacrilamida de 4-20% de gradiente. Realizar el procedimiento de inmunoblotting de acuerdo con el protocolo descrito en el Protocolo 1.

3. ChIP-qPCR

NOTA: El protocolo siguiente se describe para los inhibidores de p300 como ejemplo.

  1. Preparación de búferes
    NOTA: Consulte la Tabla 1 para las recetas de búfer. Los pasos generales del protocolo ChIP (por ejemplo, recetas de tampón, tiempos de lavado y tiempos de centrifugación) a continuación se modifican y adaptan a partir de las recomendaciones del fabricante de un kit disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales)y de la literatura35,36.
    1. Prepare el tampón de dilución ChIP, el tampón de hinchazón de los núcleos, el tampón de lavado bajo en sal, el tampón de lavado con sal alta, el tampón de lavado LiCl y el tampón TE. Conservar a 4oC.
    2. Prepare el búfer de lisis SDS, el tampón de glicina 10x y el búfer de elución ChIP. Conservar a temperatura ambiente.
      ADVERTENCIA: Compruebe todas las fichas de datos de seguridad para todos los productos químicos antes de hacer tampones para garantizar un manejo adecuado.
  2. Tratamiento farmacológico
    NOTA: Véase Protocolo Suplementario (Esquema 3) para un esquema de las diluciones de medicamentos utilizadas en el paso 3.2.
    1. Seed MCF-7 células en dos platos de cultivo de 15 cm y crecen células a 90% de confluencia en 12 ml del medio DMEM completo. Marque los platos para el siguiente diseño experimental: Plato 1: control DMSO (punto de referencia); Plato 2: A-485 (3 m).
      NOTA: Para el cultivo de células MCF-7, utilice medios DMEM completos y crezca a 37 oC con un 5% de CO2. Consulte la Tabla 1 para ver la receta completa de DMEM.
    2. En un tubo cónico estéril de 15 ml, pipeta de 12 ml de soporte DMEM y pipeta de 6 l de DMSO. Mezcla bien.
    3. En un tubo cónico estéril separado de 15 ml, pipeta 12 mL de soporte DMEM y pipeta 6 l de A-485 (6 mM en DMSO) para obtener una concentración final de 3 M A-485. Mezcla bien.
    4. Aspirar los medios de los platos 1 y 2.
    5. Agregue los 12 ml de DMSO diluido en DMEM (paso 3.2.2.) al plato 1.
    6. Agregue los 12 ml de 3 m A-485 en DMEM (paso 3.2.3.) al plato 2.
    7. Devolver los platos de cultivo celular a la incubadora e incubar durante 24 h.
  3. Fijación celular
    1. Pipetear 330 l (27,5 l por ml) de 37% de formaldehído a los medios completos y agitar suavemente la placa para mezclar.
      ADVERTENCIA: El formaldehído es tóxico. Consulte la ficha de datos de seguridad para conocer los procedimientos de manipulación adecuados.
    2. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
    3. Pipeta 2 mL de 10x glicina a la placa y remolino para mezclar.
    4. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    5. Después de la incubación, coloque los platos sobre hielo y descongele un cóctel alícuota de cóctel inhibidor de la proteasa.
    6. Prepare las siguientes soluciones para las muestras DMSO y A-485 utilizando los búferes preparados en el paso 3.1.
      1. 2 ml de PBS con una dilución de 1:1.000 del cóctel inhibidor de la proteasa
      2. 1 ml de tampón de hinchazón de núcleos con una dilución de 1:1.000 del cóctel inhibidor de la proteasa
      3. 0,5 ml de tampón de lelisis SDS con una dilución de 1:1.000 del cóctel inhibidor de la proteasa
    7. Aspirar los medios de los platos de cultivo celular y lavar las células dos veces con 15 ml de PBS frío.
    8. Pipeta 2 mL de PBS con el cóctel inhibidor de la proteasa (paso 3.3.6.1) a los platos de cultivo celular. Levante las células en la solución con un rascador de células.
    9. Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga. Recoja las células restantes con PBS adicional si es necesario.
    10. Tubos de giro a 800 x g a 4 oC durante 5 minutos para peletizar las células.
    11. Aspirar el sobrenadante y la pipeta 1 ml de tampón de hinchazón de núcleos con el cóctel inhibidor de la proteasa (paso 3.3.6.2) al pellet. Resuspender el pellet e incubar sobre hielo durante 10 min.
    12. Centrifugar los tubos a 2.700 x g a 4 oC durante 5 min hasta los núcleos de pellets.
    13. Aspirar el sobrenadante y la pipeta 0,5 ml de tampón de lelisis SDS con el cóctel inhibidor de la proteasa (paso 3.3.6.3) al pellet. Resuspender el pellet e incubar sobre hielo durante 10 min.
    14. Conservar las muestras de cromatina a -80 oC hasta el paso 3.4.1 o proceder inmediatamente al paso 3.4.
  4. Sonicación de ADN
    1. Transfiera 130 l de cromatina de la muestra DMSO (paso 3.3.14) a dos tubos de sonicación de ADN utilizando una pipeta (130 ml cada uno).
    2. Transfiera 130 l de cromatina de la muestra A-485 (paso 3.3.14) a dos tubos de sonicación de ADN utilizando una pipeta (130 ml cada uno).
    3. Sonicar el ADN a aproximadamente 150-200 fragmentos de par base utilizando los siguientes ajustes de sonicador: Potencia de incidente pico (W) de 175, Factor de trabajo de 10%, 200 ciclos por ráfaga y 430 s tiempo de tratamiento.
      NOTA: Es posible que los ajustes de sonicación difieran entre los modelos y los ajustes para lograr el tamaño de fragmento adecuado para diferentes líneas de celda.
    4. Mantenga las muestras sobre hielo después de la sonicación.
    5. Transfiera la cromatina sonicada a un tubo de 1,5 ml utilizando una pipeta y una centrífuga a 10.000 x g a 4 oC durante 10 minutos hasta los desechos de pellets.
    6. Pipetear el sobrenadante (contiene cromatina sonicada) a un tubo nuevo y desechar los residuos. La cromatina sónica se puede almacenar a -80 oC.
  5. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
    NOTA: Consulte Protocolo suplementario (Esquema 3) para obtener un esquema de los grupos ip en el paso 3.5.
    1. Mida el contenido proteico de la cromatina sonicada para las muestras DMSO y A-485 del paso 3.4.6. El contenido de proteínas se puede medir utilizando protocolos bien establecidos34.
      NOTA: Para simplificar, este protocolo asumirá que el contenido de proteínas es igual y se utilizarán 100 l de cromatina sonicada. De lo contrario, el contenido proteico tendrá que ser equilibrado entre todas las muestras en un volumen igual.
    2. Pipetear 100 l de cromatina sonicada DMSO a dos tubos de 1,5 ml (100 l cada uno). Pipetear 400 l de tampón de dilución ChIP (que contiene una dilución de 1:1.000 del cóctel inhibidor de la proteasa) a cada tubo para llevar el volumen total hasta 500 l. Retire 5 l de la solución de uno de los tubos y guárdelo a -20 oC como entrada DMSO.
    3. Pipetear 100 l de cromatina sonicada A-485 a dos tubos de 1,5 ml (100 ml cada uno). Pipetear 400 l de tampón de dilución ChIP (que contiene una dilución de 1:1000 del cóctel inhibidor de la proteasa) a cada tubo para llevar el volumen total hasta 500 l. Retire 5 l de la solución de uno de los tubos y guárdelo a -20 oC como A-485 De entrada.
    4. Con una pipeta, añada el anticuerpo de inmunoprecipitación (IP) (por ejemplo, control IgG no específico o anticuerpo específico H3K27ac) a los tubos correspondientes para las muestras DMSO y A-485: IP #1 cromatina DMSO con anticuerpos IgG (5-10 g); IP #2 cromatina DMSO con anticuerpo H3K27ac (5-10 g); IP #3 A-485 cromatina con anticuerpos IgG (5-10 g); LA #4 A-485 con anticuerpo H3K27ac (5-10 g).
    5. Añadir 20 l de proteína A cuentas magnéticas a cada tubo. Asegúrese de que las cuentas estén bien resuspendidas.
    6. Gire las muestras durante la noche a 4 oC.
    7. Pele la proteína Un perla magnética usando un separador magnético y retire el sobrenadante. No moleste las cuentas.
    8. Lavar las perlas con 500 s a 1 ml del tampón de lavado con bajo contenido de sal y girar durante 5 min a 4 oC. Realice un giro rápido hacia abajo, pelete las perlas usando un separador magnético, y retire el sobrenadante.
    9. Lavar las perlas con 500 s a 1 ml de la tampón de lavado de alta sal y girar durante 5 minutos a 4 oC. Realice un giro rápido hacia abajo, pelete las perlas usando un separador magnético, y retire el sobrenadante.
    10. Lavar las perlas con 500 s a 1 ml del tampón de lavado LiCl y girar durante 5 min a 4 oC. Realice un giro rápido hacia abajo, pelete las perlas usando un separador magnético, y retire el sobrenadante.
    11. Lavar las perlas con 500 s a 1 ml de tampón TE y girar durante 5 min a 4 oC. Realice un giro rápido hacia abajo. Mantenga las perlas en el búfer TE hasta el paso 3.5.14.
    12. Retire las muestras de entrada (de los pasos 3.5.2 y 3.5.3) del congelador y manténgalos en hielo.
    13. Descongelar una alícuota de Proteinase K.
    14. Pele el cordón usando un separador magnético y retire el búfer TE de las perlas (del paso 3.5.11).
    15. Añadir 100 l de tampón de elución ChIP + 1 l de Proteinasa K a cada muestra, incluidas las muestras de entrada. Incubar muestras con agitación a 62oC durante 2 h utilizando un termociclo.
    16. Después de 2 h, calienta las muestras a 95oC durante 10 min usando un termociclo.
    17. Enfríe las muestras a temperatura ambiente.
    18. Perlas magnéticas de pellet utilizando un separador magnético y sobrenadante de transferencia (contiene el ADN de interés) a un nuevo tubo de 1,5 ml.
    19. Purifique el ADN utilizando un kit de limpieza de PCR estándar.
    20. El ADN purificado se puede almacenar a -20 oC y se puede utilizar como plantillas en protocolos qPCR estándar. Siga los protocolos del fabricante para ejecutar qPCR.
  6. Análisis de datos ChIP-qPCR
    NOTA: Dos métodos comunes para analizar los resultados de ChIP-qPCR son el enriquecimiento por pliegue sobre el anticuerpo IgG y el método de entrada del 1%. Una fuente comercial proporciona una excelente plantilla para ambos métodos de análisis para calcular rápidamente el enriquecimiento del pliegue para cada anticuerpo IP/objetivo de interés37.
    1. Para calcular el enriquecimiento de pliegues y el % de entrada, copie y pegue los valores de Ct a partir de los datos qPCR obtenidos para cada anticuerpo (IgG no específico, el anticuerpo IP H3K27ac y la entrada del 1%) en la región correspondiente de la plantilla de análisis y la entrada de multiplicado por pliegue y porcentaje de rendimiento se rellenará automáticamente.

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Resultados

El ensayo in vitro de histona acetiltransferasa (HAT) se puede utilizar para sondear compuestos que inhiben la actividad de p300 HAT hacia un sustrato de histona. La Figura 1A proporciona un esquema experimental para el ensayo HAT. El ácido anacardico, conocido HATi3,38, se utilizó en este ensayo en un rango de concentración de 12,5-100 M. A 100 m, el ácido anacardico reduce las regulaciones p300 y cataliza la acetilción histona en H...

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Discusión

Acetiltransferasas de lisina (KAT) acetillasoar varios residuos de lisina en las colas de histona y factores de transcripción para regular la transcripción genética2,3. El trabajo en las últimas dos décadas ha revelado que los KAT, como CBP/p300, PCAF y GCN5, interactúan con factores de transcripción oncogénicos y ayudan a impulsar el crecimiento tumoral en varios tipos de tumores sólidos4,,5,,...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses o divulgaciones que hacer.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa de Investigación Biomédica James y Esther King (6JK03 y 20K07), y Bankhead-Coley Cancer Research Program (4BF02 y 6BC03), Florida Department of Health, Florida Breast Cancer Foundation y UF Health Cancer Center. Además, nos gustaría dar las gracias al Dr. Zachary Osking y a la Dra. Andrea Lin por su apoyo durante el proceso de publicación.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de 1,5 mlFisher Scientific05-408-129Para todos los métodos
plato de 10 cmSarstedt AG & Co.83.3902Para el cultivo celular de células MCF-7
10 consejos ulFisher Scientific02-707-454Para todos los métodos
1000 consejos ulCorning4846Para todos los métodos
10X TampónPara el método 3. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
en ejecución 10Xpara los métodos 1 y 2. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
10X TBSTpara los métodos 1 y 2. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
Plato de 12 pocillosCorning3513Para el método 2
plato de 15 cmSarstedt AG & Co.83.3903Para el Método 3
Tubo cónico de 15 mlSanta Cruz Biotechnologysc-200249Para los Métodos 2 y 3
1X TBST con 5% de leche y 0,02% de azida dePara los Métodos 1 y 2. Se puede usar para diluir anticuerpos primarios que se usarán más de una vez. Permite el almacenamiento a corto plazo de diluciones de anticuerpos primarios. No lo use para la dilución secundaria de anticuerpos. PRECAUCIÓN: La azida de sodio es tóxica.
1X TBST con lechepara los métodos 1 y 2. Se utiliza para bloquear la membrana de PVDF y para la dilatación de anticuerpos. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
200 consejos ulCorning4844Para todos los métodos
2-mercaptoetanolSigma-AldrichM3148para la preparación de tampón de muestra SDS
4-20% gel de poliacrilamidaThermo Fisher: InvitrogenXP04205BOXpara los métodos 1 y 2
Tampónpara el método 1. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
lisis pasivo 5Xpara el método 2. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
6X Dodecil Sulfato de Sodio (SDS)Para los Métodos 1 y 2. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
A-485MedChemExpressHY-107455CBP/p300 Inhbitor para uso en los Métodos 2 y 3. Disuelto en DMSO.
Anticuerpo acetil-CBP (K1535) / p300 (K1499)Tecnología de señalización celular4771para el método 1
Acetil-CoASigma-AldrichA2056para uso en el método 1
Anticuerpo de acetil-histona H3 (Lys 27) (H3K27ac)Tecnología de señalización celularCST 8173antoicuerpos para H3K27ac para inmunoblots y ChIP
Anticuerpo acetil-histona H3 (Lys18) (H3K18ac)Tecnología de señalización celularAntoicuerpos CST 9675para H3K18ac para inmunoblots y anticuerpo ChIP
alfa tubulinaMillipore SigmaT5168para el Método 2. Diluir ácido anacárdico 1:20.000
Cayman Chemical13144para el método 1
anticuerpo secundario IgG de ratón HRP tecnologíade señalización celular7076para los métodos 1 y 2. Diluir 1:10,000
anticuerpo secundario IgG anti-conejoJackson ImmunoResearch711-035-152para los métodos 1 y 2. Diluir 1:10.000 a 1:20.000
Película de autorradiografíaMIDSCIBX810Para los métodos 1 y 2
Plataforma giratoria para bailarinas del vientreStovall Life Science Incorporatedno disponiblePara los métodos 1 y 2
Suero de ternero bovino (BCS)HyCloneSH30072.03medios de cultivo celular
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-AldrichA2153para la preparación de tampones
Azul de bromofenolSigma-AldrichB0126para la preparación de tampón de muestra SDS
CDTA Spectrum Chemical125572-95-4Para la preparación de tampones
raspador de célulasMillipore SigmaCLS3010Para el método 3
TampónPara el método 3. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
Tampónpara el método 3. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
DMEM completo para celdas MCF-7 para losmétodos 2 y 3. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
Covaris 130 y micro; l microTUBECovaris520045Tubo de sonicación para uso con Covaris S220 en el Método 3
Covaris S220 Ultrasonido focalizado CovarisS220Sonicador de ADN para uso en el Método 3
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-Aldrich41639para la dilución de fármacos y el tratamiento de control de vehículos
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815para tampón de muestras SDS preparación
DMEMCorning10-013-CVmedio de cultivo celular
EDTAFisher ScientificBP120-1para la preparación de tampones
Ejemplo de tanque de transferencia y aparatode transferencia Bio-rad1704070para los métodos 1 y 2
EZ-Magna ChIP A/G Kit de inmunoprecipitación de cromatinaMillipore Sigma17-10086para el método 3
FK228 ( Romidepsina)Cayman Chemical128517-07-7Inhibidor de HDAC para uso en el Método 2
Solución de formaldehídoSigma-AldrichF8775para la fijación celular
glicerolFisher ScientificBP229-1Para la preparación de tampones
glicinaSigma-AldrichG7126para la preparación de tampones
HEPESSigma-Aldrich54457para Preparación de tampones
lavado con alto contenido de salPara el método 3
IGEPAL (NP-40)Sigma-AldrichI3021para la preparación de tampones
Immobilon Sustrato HRP quimioluminiscenteMillipore SigmaWBKLS0500para los métodos 1 y 2
KClFisher ScientificBP366-500para la preparación de tampones
LiClSigma-AldrichL9650Para la preparación del tampón
TampónLiCl Para el Método 3. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
de lavado bajo en salpara el método 3. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
Separador magnéticoPromegaZ5341Para uso en el Método 3
Metanol Sigma-Aldrich494437Para la preparación de tampones
Mini tanque de gelInvitrogenA25977Para los Métodos 1 y 2
MS-275 (Entinostat)Cayman Chemical209783-80-2Inhibidor de HDAC para uso en el Método 2. Disuelto en DMSO.
NaClFisher Scientific7647-14-5para la preparación de tampones
NaOHFisher ScientificS318-100para la preparación de tampones en los Métodos 1 y 2
Normal Rabbit IgGBethyl LaboratoriesP120-101Anticuerpo de control de conejo para uso en el Método 3
TampónPara el Método 3. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
Kit de limpieza de PCRQiagen28104Para uso en el Método 3
Penicilina/Estreptomicina 100XMedios de cultivo celularCorning30-002-CI
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Corning21-040-CVPara los métodos 2 y 3
PIPESSigma-Aldrich80635para la preparación de tampones
leche en polvoNestlé Carnationpara Métodos 1 y 2
Power Pac 200 para la transferencia de Western blotBio-radPara los métodos 1 y 2
Power Pac 3000 para el funcionamiento del gel SDSBio-radpara los métodos 1 y 2
Escalera de proteínas preteñidaThermo Fisher26616Para los métodos 1 y 2
Cóctel de inhibidores de proteasaSigma-AldrichPI8340para uso en el método 3
Proteína A Magentic BeadsNew England BioLabsS1425SPara uso en el Método 3
Proteinasa KNew England BioLabsP8107SPara uso en el Método 3
PTC-100 Controlador térmico programableMJ Research Inc.PTC-100para el método 1
Membrana de transferencia de PVDFMillipore SigmaIEVH00005para los métodos 1 y 2
H3.1 recombinanteNew England BioLabsM2503Spara uso en el método 1
p300 recombinanteENZO Life SciencesBML-SE451-0100para uso en el método 1
SAHA (Vorinostat)Cayman Chemical149647-78-9Inhibidor de HDAC para uso en el método 2
de lisis SDSpara el método 3. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
Azida de sodioFisher Scientific26628-22-8para los métodos 1 y 2. PRECAUCIÓN: La azida de sodio es tóxica. Consulte SDS para obtener información sobre el manejo adecuado.
Bicarbonato de sodioFisher ScientificS233-500para la preparación de tampones
Desoxicolato de sodioSigma-AldrichD6750para la preparación de tampones
Dodecil sulfato de sodio (SDS)Sigma-Aldrich71725para la preparación de tampones de muestras SDS
Heatblock estándarVWR Scientific ProductsNp. de artículo del fabricante: 949030Para los métodos 1 y 2
Tablero centrífugaEppendorf5417RPara todos los métodos
TampónPara el método 3. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
Búferpara los métodos 1 y 2. Consulte la Tabla 1 para ver la receta.
Trichostatina ACayman Chemical58880-19-6Inhibidor de HDAC para uso en el Método 2
TrisFisher ScientificBP152-5para la preparación de tampones
Triton X-100Sigma-AldrichT8787para la preparación de tampones
Tween 20Sigma-Aldrich9005-64-5para la preparación de tampones en los métodos 1 y 2
Procesadorde película de rayos XKonica Minolta Medical & Gráfico, Inc.SRX-101Apara los métodos 1 y 2
de glicina Búfer sodio al 5% de ensayo 5X Tampón de de dilución ChIP de elución ChIP Tampón de de lavado Tampón de hinchazón de núcleos Tampón TE de transferencia

Referencias

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