Method Article

Preconcentración basada en papel y aislamiento de microvesículas y exosomas

DOI:

10.3791/61292

⸱

April 29th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical Engineering, Kwangwoon University, 2Korea Institute of Science and Technology (KIST), 3School of Biomedical Engineering, Korea University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentado es un protocolo para fabricar un dispositivo basado en papel para el enriquecimiento y aislamiento efectivos de microvesículas y exosomas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las microvesículas y exosomas son pequeñas vesículas membranosas liberadas al ambiente extracelular y circulan por todo el cuerpo. Debido a que contienen varias biomoléculas derivadas de células parentales como ADN, ARNm, miRNA, proteínas y lípidos, su enriquecimiento y aislamiento son pasos críticos para su explotación como biomarcadores potenciales para aplicaciones clínicas. Sin embargo, los métodos de aislamiento convencionales (por ejemplo, ultracentrifugación) causan pérdidas significativas y daños a microvesículas y exosomas. Estos métodos también requieren múltiples pasos repetitivos de ultracentrifugación, carga y desgaste de reactivos. Este artículo describe un método detallado para fabricar un dispositivo basado en papel de origami (Exo-PAD) diseñado para el enriquecimiento y aislamiento efectivos de microvesículas y exosomas de una manera sencilla. El diseño único del Exo-PAD, que consiste en capas multidobladas similares al acordeón con áreas de muestra convergentes, se integra con la técnica de polarización de concentración de iones, lo que permite un enriquecimiento quintuplicado de las microvesículas y exosomas en capas específicas. Además, las microvesículas y exosomas enriquecidos se aíslan simplemente desplegando el Exo-PAD.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las microvesículas y los exosomas son vesículas de membrana pequeñas que miden 0,2 a 1 m y 30 a 200 nm, respectivamente. Son secretados en el entorno extracelular por varios tipos de células diferentes1,2,3,4,5. Contienen información de células parentales en forma de subconjuntos de ADN, ARNm, MIRNA, proteínas y lípidos, y circulan por todo el cuerpo a través de diversos fluidos corporales como suero, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico y saliva6,7,8,9. Por lo tanto, las técnicas para el aislamiento eficiente de microvesículas y exosomas de fluidos biológicos pueden proporcionar amplias oportunidades en los campos del diagnóstico, pronóstico y monitoreo en tiempo real de la enfermedad, así como en el desarrollo de nuevas terapias.

Sin embargo, el método de aislamiento convencional para microvesículas y exosomas basados en la ultracentrifugación consume mucho tiempo y causa una pérdida y contaminación significativas de la muestra. Esto se debe a que implica varios pasos de pipeteo y carga engorrosos y el descarte de varios reactivos con ultracentrifugación repetida5,6,10,11,12. Por otra parte, la alta tensión de cizallamiento inducida por la ultracentrifugación (100.000 x g)puede causar la lysis física de microvesículas y exosomas, produciendo tasas de recuperación deficientes (5-23%)6,,13,,14. Por lo tanto, se debe desarrollar una técnica de aislamiento altamente eficiente y discreta para microvesículas y exosomas para reducir el daño y la pérdida, logrando así mayores tasas de recuperación.

Un dispositivo basado en papel de origami (Exo-PAD) fue desarrollado para un aislamiento más simple, suave y altamente eficiente de microvesículas y exosomas6. El diseño del Exo-PAD es un papel multiplicizado con áreas de muestra conectadas en serie que disminuyen gradualmente de diámetro. La técnica de polarización de la concentración de iones (ICP), que es un fenómeno nanoelectrocinético que preconcentra biomoléculas cargadas, se integró con este diseño único. El uso del Exo-PAD dio como resultado un enriquecimiento quintuplicado de las microvesículas y exosomas en capas específicas y su aislamiento simplemente desplegando el dispositivo. Este artículo describe el Exo-PAD en detalle, desde la fabricación y operación general del dispositivo hasta el análisis de su uso, para ilustrar el método y mostrar resultados representativos6.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fabricación de dispositivos

  1. Defina la región que se va a imprimir en papel utilizando el software de impresora (Tabla de materiales).
    NOTA: El diseño tiene 12 capas con patrón de cera en las que los diámetros de las áreas circulares de la muestra se estrechan gradualmente de 5 mm a 2 mm(Figura 1A).
  2. Imprima cera hidrófoba en las regiones designadas a ambos lados del papel de celulosa (Tabla de materiales) utilizando una impresora de cera comercial ( Tabla demateriales) (Figura 1B).
  3. Colocar el papel grabado en cera en un horno de laboratorio durante 80 s a 120 oC.
    NOTA: Este paso permite que la cera llegue al interior del papel logrando un reflujo térmico de la cera impresa. Con este protocolo de incubación, la resolución del patrón es de 2 mm. Por lo tanto, tenga cuidado de no imprimir patrones de menos de 2 mm. De lo contrario los patrones serán bloqueados por la cera.
  4. Corte el papel impreso en cera con un cortador para fabricar dispositivos individuales (Figura 1C).
  5. Disminuir 5 s y 2 l de membrana permselectiva (p. ej., Nafion; Tabla de materiales) en las áreas de muestra en las capas más a la izquierda y a la derecha, respectivamente (Figura 1D).
  6. Coloque las capas recubiertas con la membrana permselectiva en una placa caliente a 70 oC durante 30 minutos para evaporar el disolvente de membrana permselectivo.
  7. Selle la superficie más externa de la capa recubierta frente a la solución tampón con cinta sensible a la presión, dejando un pequeño agujero.
  8. Doble el dispositivo individual impreso (es decir, Exo-PAD) de un lado a otro a lo largo de las líneas blancas.
    NOTA: Al plegar el dispositivo, todas las áreas de muestra se conectan convergentemente(Figura 1E). Este diseño convergente centra las líneas de campo eléctrico cuando se aplica la tensión para ICP, logrando una preconcentración más intensiva de las microvesículas y exosomas.

2. Enriquecimiento y enfoque espacial de microvesículas y exosomas por polarización de la concentración iónica

  1. Cargue 15 l de la muestra de microvesícula y exosoma (3 x 1011 partículas/ml en solución salina tamponada de 0,1x fosfato [PBS] con 0,05% de interpolación 20) en las áreas de muestra convergentes por pipeteo y espere unos segundos para asegurar la humectación completa de todas las áreas de muestra (Figura 1F).
  2. Coloque dos cámaras de acrílico en ambos extremos del Exo-PAD y sujete el Exo-PAD de forma segura con pequeños clips de aglutinante para evitar que se desdoblen(Figura 1G).
  3. Llene las cámaras con 110 l de 0,1x PBS e inserte dos electrodos Ag/AgCl(Figura 1H).
  4. Aplicar 30 V a los electrodos durante 20 minutos utilizando un sistema de medición de fuente de corriente(Tabla de materiales).
    NOTA: El voltaje aplicado genera el fenómeno ICP y por lo tanto preconcentra las microvesículas y exosomas en las capas 8 y 9 del Exo-PAD.

3. Aislamiento de las microvesículas y exosomas enriquecidos

  1. Separe el Exo-PAD plegado de las cámaras de acrílico y desdoble el dispositivo para aislar las microvesículas y exosomas enriquecidos de las otras capas (Figura 1I).
  2. Perforar las áreas de muestra en las capas 8 y 9, donde se enriquecen las microvesículas y los exosomas, para el análisis aguas abajo (Figura 1J).

4. Análisis de microscopía electrónica de barrido

  1. Fijar las microvesículas y exosomas enriquecidos sumergiendo las áreas perforadas en 2,5% de glutaraldehído en 0,1 M tampón de cacodilato sódico durante 1 h y en 1% de tetroxido de osmio en 0,1 M de cacodilato sódico durante 1 h.
    ADVERTENCIA: El tetróxido de Osmio es un producto químico altamente venenoso y peligroso. Debido a que el tetróxido de osmio puede penetrar en los plásticos, debe almacenarse en vidrio. Cualquier manipulación de tetróxido de osmio debe realizarse en una campana química con guantes de doble nitrilo.
  2. Deshidratar las microvesículas fijas y los exosomas con grados ascendentes de etanol a prueba de 200 (es decir, 50%, 70%, 90% y 100%) durante 30 minutos cada uno.
  3. Seque químicamente la muestra sumergiéndola en hexametildisilazane en un desecador durante 30 min.
    ADVERTENCIA: Hexamethyldisilazane es un producto químico inflamable y sensible a la humedad. Debe almacenarse en un área seca y bien ventilada lejos de fuentes de ignición.
  4. Recubrir las microvesículas completamente secas y los exosomas con oro/paladio (20 nm) a través de imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de pulverización y captura.

5. Análisis de seguimiento de nanopartículas

  1. Golpee las áreas de muestra en las capas 6, 8 y 10 usando un punzón de biopsia después de 20 minutos de operación del dispositivo.
  2. Sumerja cada área perforada en solución tampón (0,1x PBS con 0,01% de interpolación 20).
  3. Vórtice durante 10 min y centrífuga durante 30 s a 6.000 rpm para resuspender las microvesículas y exosomas enriquecidos.
  4. Retire las áreas perforadas de la solución y mida la concentración de microvesículas y exosomas mediante un instrumento de análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) (Tabla de materiales).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El tiempo de operación debe optimizarse para lograr el máximo rendimiento de recuperación de las microvesículas y exosomas enriquecidos. El tiempo insuficiente no permite una migración suficiente de las microvesículas y exosomas, lo que disminuye el enriquecimiento, mientras que el tiempo excesivo deteriora el enfoque espacial y por lo tanto dispersa las microvesículas y exosomas. Así, a través del paso de optimización del tiempo, se puede identificar el factor máximo de preconcentración de microvesículas y exosomas y la...

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Discussion

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Aunque el Exo-PAD se utilizó con éxito para el enriquecimiento y aislamiento de microvesículas y exosomas, se deben considerar cuidadosamente varios puntos críticos: 1) el tiempo y la temperatura de incubación del horno durante la preparación del dispositivo, 2) el tiempo de procesamiento, 3) la aplicación de voltaje con diferentes números de capa y diámetros de área de muestra, y 4) la aplicabilidad a las muestras clínicas.

El tiempo de incubación y la temperatura indicados en el protocolo so...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio fue apoyado por la National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A090840444. J. H. Lee fue apoyado por una beca de investigación de la Universidad de Kwangwoon en 2019. Hyerin Kim recibió el apoyo del "Programa de Desarrollo de Competencias para Especialistas en Industria" del Ministerio de Comercio, Industria y Energía de Corea (MOTIE), operado por el Instituto Coreano para el Avance de la Tecnología (KIAT) (No. P0002397, programa HRD para la convergencia industrial de dispositivos inteligentes portátiles).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Electrodos de Ag/AgClA-M Systems, Inc.5315000,15"
de diámetro de suero bovino (BSA), Alexa Fluor 594 conjugadoThermo Fisher ScientificA13101BSA conjugado con Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Tampón de carbonato-bicarbonatoSigma-AldrichC3041-50CAPTampón de carbonato
Software CorelDraw (Coral Co., Canadá)Corel CorporationSoftware de impresora para definir la impresión en cera región
ColorQube 8870Xerox CorporationImpresora de cera
Papel de cromatografía grado 1Whatman3001-861 Papel decelulosa, dimensión: 20 * 20 cm
Patrones de exosomas marcados con fluorescenciaHansaBioMed Life Sciences, Ltd.HBM-F-PEP-100Exosoma marcado con FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Medidor de fuente de corriente/voltaje Keithley 2410Keithley Instruments, Inc.Actual– sistema de medición de fuente de voltaje
Nafion solución de resina perfluoradaSigma-Aldrich31175-20-9Membrana permselectiva, 20 % en peso en la mezcla de alcoholes alifáticos inferiores y agua; contiene 34% de agua
Tecnología NanoSight LM10NanoSight Máquinaanálisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)
Solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH7.4)Thermo Fisher Scientific10010001
Albúmina de de

References

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