El protocolo describe un ensayo rápido, de alto rendimiento, confiable, económico e imparcial para determinar eficientemente la viabilidad celular. Este ensayo es particularmente útil cuando las mitocondrias de las células han sido dañadas, lo que interfiere con otros ensayos. El ensayo utiliza el conteo automatizado de células manchadas con dos tintes nucleares: Hoechst 33342 y yoduro de propidium.
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Artículo de método
Un ensayo automatizado de tinción nuclear diferencial para la determinación precisa de la citotoxicidad mitoca
* These authors contributed equally
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Resumen
Resumen
La contribución de las mitocondrias a la transformación oncogénica es un tema de amplio interés y estudio activo. A medida que el campo del metabolismo del cáncer se vuelve más complejo, el objetivo de apuntar a las mitocondrias utilizando varios compuestos que infligen daño mitocondrial (los llamados mitocanes) se está volviendo bastante popular. Desafortunadamente, muchos ensayos de citotoxicidad existentes, como los basados en sales de tetrazolium o resazurin requieren enzimas mitocondriales funcionales para su rendimiento. El daño infligido por los compuestos que apuntan a las mitocondrias a menudo compromete la precisión de estos ensayos. Aquí, describimos un protocolo modificado basado en la tinción diferencial con dos tintes fluorescentes, uno de los cuales es permeante de células (Hoechst 33342) y el otro de los cuales no es (yoduro de propidium). La diferencia en la tinción permite discriminar las células vivas y muertas. El ensayo es susceptible de microscopía automatizada y análisis de imágenes, lo que aumenta el rendimiento y reduce el sesgo. Esto también permite que el ensayo se utilice de manera de alto rendimiento utilizando placas de 96 pozos, por lo que es una opción viable para los esfuerzos de descubrimiento de fármacos, particularmente cuando los fármacos en cuestión tienen algún nivel de mitotoxicidad. Es importante destacar que los resultados obtenidos por el ensayo de tinción Hoechst/PI muestran una mayor consistencia, tanto con los resultados de exclusión azul tripano como entre réplicas biológicas cuando el ensayo se compara con otros métodos.
Introducción
El primer paso para identificar tratamientos eficaces contra el cáncer es la selección de un ensayo de citotoxicidad robusto e imparcial que se puede utilizar para examinar el efecto del tratamiento. Una opción común para experimentos de bajo rendimiento es la exclusión del tinte azul trypan de las células vivas. Este método se ve favorecido porque permite un método relativamente imparcial para cuantificar la supervivencia celular. el azul de tripano se difunde pasivamente en las células cuyas membranas están comprometidas, pero está efectivamente bloqueado para entrar en las células sanas1. El cociente de las células vivas y las células totale....
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Protocolo
1. Ensayo de citotoxicidad: Configuración
- Preparar soluciones de compuestos de interés a las concentraciones deseadas en los medios apropiados (sin suero o 1, 2,5 o 5% FBS RPMI-1640).
- Para medir la citotoxicidad de un solo compuesto (por ejemplo, para determinar dosis efectivas), prepare compuestos a 2 veces la concentración final.
- Para medir la citotoxicidad de las combinaciones de compuestos, prepare compuestos a 4x concentración final.
- Prepare controles solo con disolventes mezclando la misma cantidad de disolvente con el medio adecuado. Por ejemplo, si los compuestos de ensayo se disuelven en DMSO y metanol, realice un contr....
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Resultados
El protocolo antes mencionado se ha desarrollado utilizando células OCI-AML2, que fueron tomadas como una línea celular representativa de la leucemia mieloide aguda. La LMA se caracteriza por una proliferación anormal de células hematopoyéticas indiferenciadas y no funcionales en la médula ósea26. A pesar de los recientes avances en la terapia dirigida a LMA, el estándar de atención ha permanecido inalterado durante varias décadas, y consiste en terapia de inducción (típicamente compuesta de tres .......
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Discusión
Aunque el protocolo para el ensayo de citotoxicidad Hoechst/PI es robusto y requiere relativamente poco tiempo práctico, hay varios detalles experimentales que son muy importantes para garantizar resultados precisos. En primer lugar, es esencial asegurarse de que la concentración de DMSO se mantenga por debajo del 0,5% (v/v). Generalmente se acuerda que la exposición a dosis incluso bajas de DMSO puede alterar sustancialmente la morfología y la unión de las células y retrasar significativamente la progresión del ciclo ce.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
NVK, un estudiante de CPRIT en Investigación del Cáncer, agradece al Instituto de Prevención e Investigación del Cáncer de Texas (CPRIT) por su generoso apoyo, la subvención CPRIT RR150044. Este trabajo también fue apoyado por la Beca de Investigación C-1930 de la Fundación Welch, y por los Institutos Nacionales de Salud R35 GM129294 otorgados a NVK. Los financiadores no tenían ningún papel en el diseño de estudios, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2-Desoxi-D-glucosa/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-piruvato | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| Placas de 96 pocillos | Greiner Bio-One | 655090 | Placas de 96 pocillos de fondo plano negro o transparente |
| > Reactivo de viabilidad celular HS azul Alamar (100 ml) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Contador de células automatizado Countess II | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solución; concentración final 1:1.000 |
| HyClone suero fetal bovino | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-clorofenilhidrazona/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS | comprimidos Thermo Fisher | BP2944100 | 1 comprimido + 200 mL de agua estéril = 1x solución de PBS |
| Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce Kit de ensayo LDH | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Yoduro de propidio | Thermo Fisher | 50-596-072 | Polvo seco; stock 1 mg/mL en PBS; concentración final 5 µ g/mL (células leucémicas), 1 y micro; g/mL (PBMC normales) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium Con L-glutamina y bicarbonato de sodio, líquido, filtrado estéril, apto para cultivo celular | Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Tinción de azul de tripán (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Líneas celulares | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | Línea celular CML |
| MOLM-13 | Línea celular ATCC | AML | |
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL cell line |
| OCI-AML2 | ATCC | AML line |
Referencias
- Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. Cell viability assessment: toward content-rich platforms. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).
- Melzer, S., et al. Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell ....
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Reimpresiones y permisos
