Imágenes Intranuclear Actin Rods en vivo calor estresado Drosophila Embriones

Resumen

El objetivo de este protocolo es inyectar actina globular conjugada con rhodamina en embriones de Drosophila y el conjunto de barras de actina intranuclear de imagen después del estrés térmico.

Resumen

El propósito de este protocolo es visualizar varillas de actina intranuclear que se ensamblan en embriones drosophila melanogaster vivos después del estrés térmico. Las barras actin son un sello distintivo de una respuesta al estrés actin (ASR) conservada e inducible que acompaña a las patologías humanas, incluida la enfermedad neurodegenerativa. Anteriormente, demostramos que el ASR contribuye a fallos de morfosis y a una menor viabilidad del desarrollo de embriones. Este protocolo permite el estudio continuo de los mecanismos subyacentes al montaje de varillas actin y el ASR en un sistema modelo que es altamente apto para la creación de imágenes, genética y bioquímica. Los embriones se recogen y montan en una cubierta para prepararlos para la inyección. La actina globulaular conjugada con rhodamina (G-actin^rojo)se diluye y se carga en un microneedle. Se realiza una sola inyección en el centro de cada embrión. Después de la inyección, los embriones se incuban a temperatura elevada y las barras de actina intranuclear se visualizan mediante microscopía confocal. La recuperación de fluorescencia después de los experimentos de fotobleaching (FRAP) se puede realizar en las barras actin; y otras estructuras ricas en actina en el citoplasma también se pueden imaginar. Encontramos que G-actin^Red polimeriza como G-actin endógeno y no interfiere, por sí solo, con el desarrollo normal de embriones. Una limitación de este protocolo es que se debe tener cuidado durante la inyección para evitar lesiones graves en el embrión. Sin embargo, con la práctica, inyectar G-actin^rojo en embriones de Drosophila es una manera rápida y confiable de visualizar varillas de actina y se puede utilizar fácilmente con moscas de cualquier genotipo o con la introducción de otras tensiones celulares, incluyendo hipoxia y estrés oxidativo.

Introducción

Este protocolo describe cómo inyectar G-actin^Rojo para visualizar el montaje de barras de actina intranuclear en embriones estresados por calor que están siendo sometidos a una respuesta inducible a la tensión actin (ASR)¹. Desarrollamos este protocolo para ayudar a los estudios del ASR, que en embriones conduce a morfosis interrumpida y viabilidad reducida, y en adultos los tipos de células humanas se asocian con patologías como insuficiencia renal^2,miopías musculares^3,y la enfermedad de Alzheimer y Huntington^4,5,

Protocolo

1. Preparar tazas de recolección de embriones y placas de agar de jugo de manzana

1. Cinco días antes del experimento de inyección, construir²⁸ o adquirir al menos dos pequeñas tazas de recolección de embriones. Hacer platos de agar de jugo de manzana frescos de 60 mm para usar con pequeñas tazas de recolección^28. Guarde los platos en cajas de plástico cubiertas con toallas de papel húmedas a 4 °C.
   NOTA: Las pequeñas tazas de recolección de embriones, pobladas con números de mosca como se describe en el paso 1.3, proporcionarán un número suficiente de embriones por experimento, al tiempo que garantizarán que el....

Resultados

Un flujo de trabajo esquemático de manejo de embriones se representa en la Figura 1y se presenta un calendario para un experimento típico en la Tabla 1. Una estimación para un buen resultado experimental es que por cada 10 embriones inyectados, al menos la mitad de los embriones vistos estarán en la etapa de desarrollo correcta, sin daños, y exhibirán un ASR robusto con estrés térmico a 32 °C. Este ASR será evidenciado por el montaje de varillas de actina intranuclear como .......

Discusión

La importancia de este método es que utiliza el protocolo bien establecido de microinyección en embriones de Drosophila ^{21,22,23,24,25,26,27} para permitir nuevas investigaciones sobre el ASR y el conjunto de barras actin acompañantes. Una ventaja importante de inyectar G-actin^R.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Trifosfato de adenosina (ATP)	Millipore-Sigma		A23835G Componente del tampón G Jugo de
manzana, Mott's, 64 fl oz	Mott's	014800000344	Componente de los platos de jugo de manzana
Bacto Agar	BD	214010	Componente de los platos de jugo de manzana
Lejía, PureBright Germicida, hipoclorito de sodio al 6,0%	KIK International 059647210020		Para embriones decorionantes
Cloruro de calcio	Millipore-Sigma	C1016500G	Componente del tampón G
Filtro de células, 70 μ m	Falcon	352350	Para la recogida de embriones decorionados
Microscopio confocal, LSM 880 de 34 canales con Airyscan	Zeiss	0000001994956	Para la obtención de imágenes de bastones de actina intranuclear
Drierite	desecante	24001	Para la desecación de embriones
Microscopio de disección, Stemi 508 Estereoscopio con zoom 8:1	Zeiss	4350649000000	Para la disposición de embriones en una cuña de agar
Aguja de disección, 5 pulgadas	Fisher Scientific	08965A	Para la disposición de embriones en una cuña de agar
Dithiothreitol (DTT)	Fisher Scientific	BP1725	Componente del tampón G
Cinta adhesiva de doble cara, Scotch Permanent, 0,5 pulgadas x 250 pulgadas	3M	021200010323	Para hacer pegamento para embriones
Jaula de recolección de embriones	Genessee Scientific	59100	Para alojar moscas adultas y recolectar embriones Pinzas de
punta fina, Pinza Dumont, Estilo 5	Microscopía Electrónica Sciences	72701D	Para disponer embriones en cuña de agar
Capilares de vidrio, Vidrio de borosilicato, delgado 1 mm x 0,75 mm	World Precision Instruments, Inc.	TW1004	Para microagujas Aceite de
halocarbono 27	Millipore-Sigma	H8773100ML	Para la hidratación de los embriones
Incubadora de etapa calefactada	Zeiss	4118579020000, 4118609020000, 4118609010000	Para la obtención de imágenes confocales
Limpiadores de tejidos de laboratorio, KimWipes	Kimberly-Clark	34155	Limpiadores de tejidos de laboratorio
Microscopio óptico, Invertoskop 40C Contraste de fase invertida microscopio reacondicionado	Zeiss	Descatalogado	Microscopio de inyección
Metil-4-hidroxibenzoato	Millipore-Sigma		H36471KG Componente de los platos de zumo de manzana
Microinyector, FemtoJet4x	Eppendorf	5253000025	Microinyector
Puntas de microcargador, epT.I.P.S. 20 μ L	Eppendorf	5242956003	Para la carga de microagujas
Micromanipulador y etapa de inyección con diales x, y, z para el ajuste de la aguja	Bernard Instruments, Inc (Houston, TX)	Personalizado	Para realizar microinyecciones
Extractor de micropipetas, modelo P-97, Flaming/Brown	Sutter Instruments	P97	Para tirar de tubos capilares para hacer microagujas
Cubreobjetos de microscopio 24x50-1.5	Fisher Scientific	12544E	Para el montaje de embriones Portaobjetos de
microscopio, Lilac Colorfrost, Prelimpios, 25 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	22037081	Para el montaje de embriones para inyección
n-Heptano	Fisher Scientific	H3601	Componente del pegamento para embriones
Objetivo, 10x	Zeiss	Descatalogado	10x objetivo para microscopio
de inyecciónObjetivo, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. Objetivo de	FCS Zeiss 4217679971711		40x para objetivo confocal
, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 para inmersión en aceite, agua, aceite de silicona o glicerina (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm a D=0.17mm)	Zeiss	4208529871000	25x objetivo de inmersión mixto para confocal
Objetivo, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA	Zeiss 4207829900799		63x objetivo de aceite para confocal
Pincel, Robert Simmons Expression E85 Puntiagudo Redondo tamaño 2	Daler-Rowney	038372016954	Para la transferencia de embriones Toallas de
papel, Kleenex Toallas de papel plegables en C, blancas	Kimberly-Clark	884266344845	Para secar colador de células
Pipeta Pasteur, 5 3/4 en	Fisher Scientific	1367820A	Para cubrir embriones con aceite
Placa de Petri, vidrio, 100 x 20 mm	Corning	3160102	Para cámara de incubación húmeda
Placa de Petri, plástico, 60 x 15 mm	VWR	25384092	Para placas de zumo de manzana
Pipeta, Eppendorf Referencia 0.5-10 μ L	Eppendorf	2231000604	Para cargar la microaguja
Punta de pipeta, xTIP4 250 μ L	Biotix 63300006		Para añadir pegamento de embriones al cubreobjetos
Hoja de afeitar VWR		55411050	Para cortar cuña de agar, cinta, puntas de pipeta
Actina globular conjugada con rodamina, plaquetas humanas (no muscular; 4x10 μ g)	Citoesqueleto, Inc.	APHR-A	G-actina^
Red Frasco de centelleo, 20 mL Borosilicato de vidrio con revestimiento de polietileno y tapas de urea	Fisher Scientific	033377	Para hacer pegamento para embriones
Frasco con tapa de rosca, 16 oz	Nalgene	000194414195	Para desecar embriones
Micrómetro de etapa	Microscopía electrónica Sciences	602104PG	Para calibrar el volumen de inyección de G-actina
Sacarosa	Millipore-Sigma	840971KG	Componente de los platos de zumo de manzana
Base Trizma	Millipore-Sigma	T15031KG	Componente de la levadura tampón G
, Levadura de Lesaffre Yeast Corporation, Red Star Active Dry, 32 oz	Lesaffre Yeast Corporation	117929157002	Componente de pasta de levadura

agua