Artículo de método

Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análisis de interacción proteína-proteína de membrana

DOI:

10.3791/61298

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16 de julio de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University, 2Institute for Structural Biology, Drug Discovery and Development, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí se presenta un protocolo para la determinación del estado oligomérico de las proteínas de membrana que utiliza un sistema de nanopartículas de membrana celular nativa junto con microscopía electrónica.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las interacciones proteína-proteínas en los sistemas de membrana celular desempeñan un papel crucial en una amplia gama de procesos biológicos, desde interacciones de célula a célula hasta transducción de señal; desde la detección de señales ambientales hasta la respuesta biológica; desde la regulación metabólica hasta el control del desarrollo. La información estructural precisa de las interacciones proteína-proteína es crucial para comprender los mecanismos moleculares de los complejos de proteínas de membrana y para el diseño de moléculas altamente específicas para modular estas proteínas. Se han desarrollado muchos enfoques in vivo e in vitro para la detección y análisis de interacciones proteína-proteína. Entre ellos, el enfoque de biología estructural es único, ya que puede proporcionar información estructural directa de las interacciones proteína-proteína a nivel atómico. Sin embargo, la biología estructural actual de las proteínas de membrana todavía se limita en gran medida a los métodos basados en detergente. El principal inconveniente de los métodos basados en detergente es que a menudo se desvinculan o desnaturen complejos de proteínas de membrana una vez que su entorno nativo de bicapa lipídica es eliminado por moléculas de detergente. Hemos estado desarrollando un sistema nativo de nanopartículas de membrana celular para la biología estructural de proteínas de membrana. Aquí, demostramos el uso de este sistema en el análisis de interacciones proteína-proteína en la membrana celular con un caso de estudio del estado oligomérico de AcrB.

Introducción

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Las interacciones proteína-proteínas (PPI) desempeñan un papel fundamental a lo largo de la biología, desde el mantenimiento de la estructura y la función de las proteínas hasta la regulación de sistemas enteros. Los IBP vienen en muchas formas diferentes y se pueden categorizar en función de qué tipos de interacciones forman. Una de estas categorizaciones es homoolímera o heteroolímera, basada en si las interacciones están entre subunidades idénticas o diferentes proteínas que actúan como subunidades. Otra categorización se basa en la fuerza de la interacción si las interacciones conducen a la formación de complejos estables o estados complejos transitorios. La información estructural sobre los IBP entre proteínas es crucial para comprender el mecanismo por el cual las proteínas llevan a cabo su función. Se ha estimado que más del 80% de las proteínas dependen de una formación compleja para llevar a cabo sus funciones funcionales1. Dado que el porcentaje de proteínas observadas que dependen de los IBP para un funcionamiento innato adecuado, su importancia en la biología es fácilmente evidente, sin embargo, ser capaz de investigar adecuadamente las proteínas que participan en estas interacciones ha seguido siendo un desafío debido a las limitaciones en las técnicas disponibles para observar experimentalmente cuando las proteínas están formando IBP.

Existe un alto grado de desacuerdo entre los resultados de muchos IBP determinados experimentalmente debido a la alta cantidad de ruido, falsos positivos y falsos negativos que se derivan de muchas de las técnicas de determinación de IBP disponibles actualmente. Esto es particularmente así para el sistema de dos híbridos de levadura (Y2H), la afinidad tándem purificación-espectrometría de masas (TAP-MS), y la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), que representan tres de los métodos más utilizados para la determinación PPI2,3,4,5,6,7. En comparación, las técnicas de biología estructural de proteínas, como la resonancia magnética nuclear (RMN), la cristalografía por rayos X y la microscopía electrónica (EM), se pueden utilizar para obtener información estructural de alta resolución sobre las interacciones proteína-proteína hasta el nivel atómico y permitir la confirmación visual directa de las interacciones que se producen para una proteína objetivo de interés. Todas las técnicas de investigación de determinación de IBP no basadas en estructura disponibles actualmente (por ejemplo, Y2H, TAP-MS y FRET) carecen de esta capacidad y, además, sufren dificultades para identificar interacciones débiles y transitorias entre proteínas5. Estas deficiencias se mejoran aún más al estudiar las proteínas de membrana debido a la complejidad añadida provocada por la variable adicional del entorno lipídico que influye en la formación de una estructura cuaternaria adecuada y un conjunto complejo heteromérico.

Las proteínas de membrana constituyen una gran porción del proteoma y se sabe que desempeñan muchos papeles cruciales en el correcto funcionamiento celular dentro de todos los organismos vivos. A pesar del hecho de que se estima que las proteínas de membrana constituyen el 27% del genoma humano y constituyen ~60% de todos los objetivos de fármacos actuales hay una anomalía importante en el número de modelos resueltos para proteínas de membrana que representan sólo ~ 2.2% de todas las estructuras proteicas publicadas8,9,10. La principal causa de la discrepancia en la disponibilidad de información estructural radica en las propiedades intrínsecas de las propias proteínas de las membranas. Debido a su escasa solubilidad, la dependencia de las interacciones con un entorno lipídico para mantener la estructura y la función nativas, y varias propiedades fisicoquímicas de la propia membrana lipídica, las proteínas de membrana siguen representando un problema sustancial a la hora de implementar técnicas de biología estructural para estudiarlas. De estas propiedades intrínsecas, la más importante para obtener información estructural precisa es el requisito de tener interacciones con su entorno lipídico natural para que mantengan su estructura y función nativas. El entorno lipídico es una parte tan integral de la estructura y función de las proteínas de membrana que el concepto de memteína (una combinación de las palabras membrana y proteína) se ha propuesto como la unidad fundamental de la estructura de la membrana-proteína y la función11. A pesar de la importancia de las interacciones lipídica-proteicas, las técnicas de determinación de IBP basadas en estructura disponibles actualmente a menudo requieren que las proteínas que se están estudiando sean solubles o sean solubilizadas con detergentes. La exposición a detergentes agresivos puede desnaturalizar las proteínas o causar falsos positivos y negativos debido a la deslipidación, que puede inducir agregación, desnaturalización de proteínas, disociación de interacciones no covalentes y formación de estados oligoméricos artificiales. Debido a la necesidad de mantener un entorno lipídico natural para la determinación precisa del estado oligomérico nativo de las proteínas de membrana hemos desarrollado un sistema de nanopartículas de membrana celular nativa (NCMNs)12 basado en el método anteriormente reportado Styrene Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13.

SMALP utiliza copolímero de ácido masculino de estireno como polímero activo de membrana para extraer y solubilizar proteínas de membrana. Poly(Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) es un polímero anfifílico único debido a su mitad de estireno hidrofóbico y la mitad de ácido cólico hidrófilo diametralmente opuesto. Forma nanopartículas adsorbándose, desestabilizando e interrumpiendo la membrana celular en un mecanismo dependiente del pH14. Esta actividad funcional de SMA es lo que permite su uso como un sistema libre de detergente para la extracción y solubilización de proteínas de membrana. El sistema NCMN es distinto del sistema SMALP en varios aspectos. La característica más singular del sistema NCMN es que cuenta con una biblioteca de polímeros activos por membrana con una multitud de polímeros que tienen propiedades únicas que los hacen adecuados para el aislamiento de muchas proteínas de membrana diferentes que requieren diferentes condiciones de estabilidad y funcionamiento nativo. El sistema NCMN también tiene diferentes protocolos en comparación con el método SMALP cuando se trata de preparar las nanopartículas. Un ejemplo de este tipo es que las NCMN utilizan una purificación de columna de afinidad de níquel de un solo paso para la determinación de estructura de alta resolución; el efecto de estos diferentes protocolos puede observarse al comparar el protocolo NCMNs, que generó estructuras AcrB crio-EM de 3.2 y 3.0 Å, con un estudio similar utilizando el método SMALP, que dio lugar a una estructura crio-EM AcrB en una resolución de 8,8 Å12,15. Estas características únicas del sistema NCMN son las mejoras realizadas en el método SMALP previamente establecido y lo convierten en un candidato ideal para el estudio de las IBP.

El transportador de eflujo multirresistente AcrB existe como homotrimero funcional en E. coli12. Un análisis mutagénico sugirió que una sola mutación de punto P223G, situada en un bucle que es responsable de la estabilidad del recortador AcrB, desestabiliza el estado del recortador y produce un monómero AcrB cuando se prepara con el DDM detergente, que podría detectarse con electroforesis de gel azul nativo16. Sin embargo, el análisis FRET del mutante AcrB-P223G sugirió que cuando estaba en el entorno de bicapa lipídica de membrana celular nativa, la mayoría de los AcrB-P223G mutantes todavía existían como recortador y que los niveles de expresión tanto para el tipo salvaje AcrB como para AcrB-P223G son similares. Sin embargo, a pesar de los resultados del análisis FRET, un ensayo de actividad para el transportador mutante mostró que la actividad disminuyó drásticamente en comparación con el tipo salvaje16. Aunque la tecnología FRET se ha utilizado popularmente para el análisis de interacciones proteína-proteína, la investigación ha demostrado que con frecuencia puede dar falsos positivos17,18,19,20.

Recientemente, se determinaron estructuras crio-EM de alta resolución del recortador AcrB que mostraron la interacción de AcrB con su bicapa lipídica de membrana celular nativa asociada mediante el uso de los NCMN12. En principio, las NCMN se pueden utilizar fácilmente para el análisis de las interacciones proteína-proteína que se encuentran en la membrana celular nativa. En una prueba de este sistema, se llevaron a cabo experimentos para observar directamente el estado oligomérico de AcrB-P223G con el uso de nanopartículas de membrana celular nativa y microscopía electrónica de tinción negativa. Con el fin de comparar con las nanopartículas AcrB de tipo salvaje, utilizamos el mismo polímero activo de membrana (SMA2000 fabricado en nuestro laboratorio, que se indexa como NCMNP1-1 en la biblioteca NCMN) utilizado para la determinación de estructura crio-EM de alta resolución de AcrB y polímeros alternativos que se encuentran en la biblioteca NCMNs12. Sobre la base de los resultados previamente reportados, se esperaba que la mayoría del mutante AcrB-P223G existiría en forma de nanopartículas de membrana celular nativa trimértica21. Sin embargo, no se encontraron recortadores AcrB presentes en la muestra, como los que se observaron con el tipo salvaje AcrB. Esto sugiere que la mayoría de AcrB-P223G no forma recortadores en la membrana celular nativa como se sugirió anteriormente.

Aquí informamos de un análisis detallado del mutante E. coli AcrB-P223G en una comparación con el tipo salvaje E. coli AcrB usando los NCMN. Este caso de estudio de AcrB sugiere que las NCMN son un buen sistema para el análisis de interacción proteína-proteína.

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Protocolo

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1. Expresión proteica

  1. Inocular 15 ml de medios de caldo fantástico (TB) con antibióticos específicos para los plásmidos con células BL21(DE3) pLysS que contienen los plásmidos que expresan AcrB en tubos de 50 ml durante la noche a 37 °C con temblores a 250 rpm.
  2. Compruebe la densidad óptica del cultivo nocturno a 600 nm (OD600)y asegúrese de que sea mayor de 2,0.
  3. Diluir 5 ml de cultivo celular en 1 L de medios de tuberculosis que contengan antibióticos específicos para los plásmidos e incubar a 37 °C con temblores hasta OD600=0.8 y luego inducir con IPTG que tenga una concentración final de 1 mM.
  4. Realizar la inducción a 20 °C con agitación durante 20 h.
  5. Peletizar las células usando centrifugación durante 15 min a 4 °C y 4.000 x g.

2. Lisis celular y aislamiento de membrana

  1. Resuspend el pellet de celda en el buffer A (Tabla 1, utilice el buffer A DDM o ncmns buffer A dependiendo del esquema de purificación que debe seguir) usando 80 mL por cada 20 g del pellet de celda.
  2. Homogeneizar los pellets celulares resuspended mediante el uso de un homogeneizador de dounce de vidrio a 4 °C o si a temperatura ambiente asegúrese de poner en hielo inmediatamente después.
  3. Transfiera la muestra a un vaso de precipitados metálico sobre hielo y alice las células cargándolas en un homogeneizador de alta presión a 4 °C y 1.500 bar.
    1. Repita el proceso de carga de las células en el homogeneizador y permitiéndoles pasar a través del homogeneizador durante 3-4 ciclos o hasta que el lisato comience a aclararse.
  4. Centrífuga el lisato a 15.000 x g durante 30 min a 4 °C.
  5. Recoge el sobrenadante y carga en tubos ultracentrífugas y centrífugas a 215.000 x g durante 1 h a 4 °C.
  6. Deseche el sobrenadante y recoja los pellets de membrana de los tubos ultracentrífugas. Guarde cualquier exceso de pellet de membrana a -80 °C.

3. Preparación de nanopartículas de membrana celular nativa

  1. Resuspend 1 g de pellet de membrana en 10 mL NCMNs Buffer A (Tabla 1).
  2. Homogeneizar la muestra de membrana celular resuspended con un homogeneizador de vidrio Dounce a 20 °C.
  3. Transfiera la muestra de membrana suspendida a un tubo de polipropileno de 50 ml y agregue la solución de stock de polímeros activos de membrana y el búfer A adicional de NCMN para llevar la muestra a una concentración final de polímero activo de membrana del 2,5% (w/v) (NCMNP1-1 o NCMNP5-2).
    NOTA: Las soluciones de stock de polímeros activos de membrana deben realizarse en agua destilada doble y se pueden mantener a concentraciones variables, pero normalmente al 10% (p/v).
  4. Agitar la muestra durante 2 h a 20 °C.
  5. Cargue la muestra en una ultracentrífuga y gire a 150.000 x g durante 1 h a 20 °C.
  6. Mientras que la muestra está siendo ultra-centrifugada comienzan a equilibrar una columna Ni-NTA de 5 ml con 25 ml de NCMNs Buffer A.
  7. Recoge el sobrenadante después de que se complete la ultracentrifugación y cárgalo en 5 ml de columna Ni-NTA a temperatura ambiente con un caudal de 0,5 ml/min usando una bomba de jeringa.
  8. Lave líneas rápidas de cromatografía líquida proteica (FPLC) con suficientes NCMNs Buffer B(Tabla 1)para vaciar completamente el sistema y luego conecte la columna a la máquina FPLC.
  9. Lave la columna con 30 ml de NCMNs Buffer B con un caudal de 1 mL/min y recoja el flujo.
  10. Lave la columna con 30 ml del búfer C(Tabla 1)ncmns con un caudal de 1 mL/min y recoja el flujo.
  11. Elute la proteína con 20 ml de NCMNs Buffer D (Tabla 1) a un caudal de 0,5 ml/min y recoger la muestra utilizando un colector de fracción y las fracciones cada una se establece en 1,0 ml.
  12. Almacene las muestras de proteínas a 4 °C.
  13. Ejecute un ensayo de electroforesis de gel SDS-PAGE para comprobar las muestras que corresponden a los picos observados en el gráfico de elución FPLC.

4. Electroforesis de gel SDS-PAGE

  1. Prepare la cámara de fundición sujetando el vidrio al aparato de fundición.
  2. Preparar el gel de separación del 12% según la receta que figura en la Tabla 1.
    NOTA: Una vez que se añade TEMED, el gel se polimerizará rápidamente, así que sólo añadir esto una vez listo para verter el gel.
  3. Vierta el gel, dejando 2 cm por debajo de la parte inferior del peine para el gel de apilamiento.
  4. Retire las burbujas colocando la parte superior del gel con 100% isopropanol y espere a que el gel de separación se polimerice.
  5. Retire el isopropanol y lave cualquier rastro del isopropanol con agua destilada.
  6. Preparar el gel de apilamiento según la receta que aparece en la Tabla 1.
    NOTA: Una vez que se añade TEMED, el gel se polimerizará rápidamente, así que sólo añadir esto una vez listo para verter el gel.
  7. Vierta el gel de apilamiento encima del gel de separación.
  8. Añade un peine a la cámara para formar los pozos y esperar a que el gel de apilamiento se polimerice por completo.
  9. Coloque 1 μL de 1 M de TDT en un tubo de microcentrífuga para cada muestra de fracción que deba ejecutarse en el gel.
  10. Agregue 7 μL de búfer de carga 4x a cada tubo también.
  11. Añadir 20 μL de muestra de las fracciones que deben ejecutarse en el gel a cada tubo de microcentrífuga.
  12. Vórtice los tubos que contienen las muestras.
  13. Gire hacia abajo los tubos de muestra utilizando una microcentrífuga de mesa durante 3 s y asegúrese de que toda la muestra ha vuelto a la parte inferior de los tubos.
  14. Prepare la célula de electroforesis de gel asegurando un casete de gel de poliacrilamida al 12% en su lugar y llenando las cámaras internas y externas de la célula con tampón Tris-acetato-EDTA (TAE) (Tabla 1).
  15. Cargue el marcador de peso molecular en el primer carril del gel con el volumen adecuado requerido por sus instrucciones.
  16. Cargue 28 μL de la muestra de cada tubo mezclado con TDT y búfer de carga.
  17. Coloque la tapa de la célula de electroforesis en la parte superior de la caja y conecte la tapa a la fuente de alimentación.
  18. Encienda la fuente de alimentación y estajela en 100 V y déjela funcionar durante 20 minutos.
  19. Después de 20 minutos, aumente la corriente de la fuente de alimentación a 140 V y continúe ejecutándola durante otros 30-40 minutos o hasta que la banda de tinte tampón de carga llegue a la parte inferior del casete de gel.
  20. Después de completar la mancha de electroforesis y des-manchar el gel para visualizar las bandas de proteínas contenidas dentro del gel.

5. Purificación de proteínas mediante DDM

NOTA: El propósito de llevar a cabo este proceso de purificación es servir como control para los experimentos utilizando los polímeros activos de membrana.

  1. Resuspend 6-10 g de pellet de membrana, desde el paso 2.6, en DDM Buffer A (Tabla 1) utilizando 5 mL/g de pellet de membrana.
  2. Homogeneizar la muestra resuspended con un homogeneizador de vidrio Dounce a 4 °C o si a temperatura ambiente asegúrese de poner en hielo inmediatamente después.
  3. Transfiera la muestra a un tubo de 50 ml de polipropileno y agregue DDM y DDM Buffer A adicional para llevar la muestra a una concentración final de DDM del 2%.
  4. Agitar la muestra durante 2 h a 4 °C.
  5. Cargue la muestra en tubos ultracentrífugas y centrífugas durante 1 h a 4 °C y 150.000 x g.
  6. Mientras que la muestra está siendo ultra-centrifugada comienzan a preparar los 5 ml de la columna Ni-NTA lavando con 25 ml de DDM Buffer A (Tabla 1).
  7. Una vez completada la ultracentrifugación, recoger el sobrenadante y cargarlo en la columna Ni-NTA de 5 ml a 4 °C con un caudal de 0,5 ml/min utilizando una bomba de jeringa.
  8. Lave las líneas FPLC con suficiente DDM Buffer B + 0.05% DDM(Tabla 1)para vaciar completamente el sistema y luego conecte la columna a la máquina FPLC.
  9. Lave la columna con 30 ml de DDM Buffer B + 0.05% DDM con un caudal de 1 mL/min y recoja el flujo.
  10. Lave la columna con 30 ml de DDM Buffer C + 0.05% DDM(Tabla 1)con un caudal de 1 mL/min y recoja el flujo.
  11. Elute la proteína con 20 ml de DDM Buffer D + 0.05% DDM(Tabla 1)a un caudal de 0.5 mL/min y recoger el flujo a través de un colector de fracción y las fracciones cada uno se establece en 1.0 mL.
  12. Seleccione las fracciones que contienen el pico de elución para agruparse y concentrarse utilizando un concentrador centrífugo y centrifugando a 4.000 x g y 4 °C hasta alcanzar los 500 μL.
  13. Mediante un bucle de 500 μL, cargue la muestra en la máquina FPLC y, a continuación, en la columna de exclusión de tamaño de 25 ml a 4 °C. Elute utilizando 30 ml de DDM Buffer E + 0.05% DDM (Tabla 1) a un caudal de 0.5 mL/min y recoger como fracciones con los tamaños de fracción establecidos en ser 0.5 mL por fracción.
  14. Tome las fracciones y mida la concentración de proteínas usando absorbancia de 280 nm para confirmar la curva UV-Vis del gráfico de elución FPLC.
  15. Recoger 20 μL de cada fracción de muestra que corresponda a los picos observados en el gráfico de elución FPLC y se confirmó que eran precisos con la prueba de absorbancia.
  16. Congele el resto de esas fracciones de muestra utilizando nitrógeno líquido o hielo seco en las alícuotas deseadas y almacene muestras de proteínas a -80 °C.
  17. Ejecute un ensayo de electroforesis de gel SDS-PAGE como se describió anteriormente para comprobar las muestras que corresponden a los picos observados en el gráfico de elución fplc.

6. Preparación negativa de la rejilla de manchas

  1. Coloque las rejillas que se van a utilizar para la preparación de la muestra en una diapositiva de vidrio envuelta en papel filtrante con el lado de carbono hacia arriba.
  2. Coloque la tobogán de vidrio con las rejillas del microscopio electrónico en la cámara de un descargador de resplandor entre los dos electrodos y reemplace la tapa de vidrio asegurándose de que esté centrada y bien sellada.
  3. Ejecute la máquina de descarga de resplandor y asegúrese de que la luz púrpura generada por el plasma sea visible.
  4. Cuando la máquina haya terminado de funcionar, espere hasta que la cámara haya alcanzado la presión atmosférica para quitar la tapa de vidrio y luego devolver la diapositiva con las rejillas al banco donde se cargarán las muestras sobre ellas.
  5. Ajuste la concentración de las muestras de proteína purificadas a aproximadamente 0,1 mg/ml diluyendo la muestra con el búfer adecuado o concentrándose utilizando un concentrador centrífugo.
  6. Cargue 3,5 μL de muestra de proteína en la rejilla de carbono de 10 nm de espesor y espere 1 min.
  7. Retire el líquido de la superficie de la rejilla EM con un papel de filtro.
  8. Lave la superficie de la rejilla 3 veces recogiendo 3 gotas de agua de μL con la rejilla y retirando el agua de la red con papel filtrante entre recoger cada gota.
  9. Lave la superficie de la rejilla 2x recogiendo gotas de 3 μL de acetato de uranio fresco y filtrado al 2% y retire las soluciones de lavado en la red con papel filtrante entre recoger cada gota.
  10. Manchar la rejilla con una gota de 3 μL de acetato de uranio fresco y filtrado al 2% durante 1 min.
  11. Retire la solución de acetato de uranio en la superficie de la red EM con papel filtrante y seque el aire de la red durante al menos 1 minuto.
  12. Almacene la cuadrícula en un cuadro de cuadrícula para su uso posterior.

7. Imágenes em

  1. Cargue la rejilla preparada en el soporte de la rejilla en una mesa de trabajo segura.
  2. Prepare el microscopio colocando los microscopios dewar en una caja de poliestireno y llene el dewar 3/4 lleno de nitrógeno líquido.
  3. Confirme que la cubierta de goma de la ventana del microscopio la está cubriendo y luego cargue el dewar en el microscopio colocando los cables de cobre en la dewar hasta que encaje en la plataforma.
  4. Llene el resto de la dewar con nitrógeno líquido y coloque una tapa en la parte superior de la dewar para cubrirla.
  5. Encienda la alta tensión, acondicione el microscopio y espere a que el microscopio se caliente y establezca un nivel de vacío seguro para su uso.
  6. Una vez que el microscopio esté listo, abra la válvula de columna y confirme que el haz está presente quitando la cubierta de goma de la ventana del microscopio.
  7. Compruebe la estigmación del haz extendiéndose dentro y fuera ajustando la intensidad del haz. Si el astigmatismo está presente, el haz tendrá una forma elíptica a medida que uno se aleja del cruce y el haz debe ser la misma forma ovalada en ambos lados.
  8. Ajuste los binoculares del microscopio para que sean la altura y la distancia correctas según los ojos del observador.
  9. Compruebe el posicionamiento del haz para los modos Buscar, Enfocary Exposición recorriendo los tres modos hasta que el haz esté centrado en cada uno.
  10. Cierre la válvula de columna y proceda a cargar el soporte de la rejilla en el microscopio electrónico.
  11. Ajuste el microscopio a altura eucéntrica utilizando la función de tambaleante de microscopios y ajustando el movimiento de la etapa utilizando el eje Z hasta que no haya movimiento de lado a lado de la muestra en el centro.
  12. Utilizando el modo de búsqueda de dosis bajas en el microscopio buscar en la cuadrícula un área deseable de contraste razonable con las moléculas de muestra presentes para centrarse en la muestra.
  13. Concéntrese en la muestra en el modo Enfoque utilizando un tamaño de paso alto hasta que se vea la muestra y, a continuación, disminuya los pasos para encontrar el nivel de enfoque correcto.
  14. Cero y en blanco el haz y luego asegúrese de que la almohadilla de goma está cubriendo la ventana del microscopio.
  15. Utilizando el modo Exposición, tome la imagen del área de cuadrícula deseada para una exposición de 1 s a una ampliación de 62.000x y compruebe la imagen obtenida.
  16. Cuando termine de crear imágenes, una rejilla cierre las válvulas de columna y retire el soporte de rejilla de la columna.
  17. Cuando termine de tomar imágenes, todas las redes de interés apagan el microscopio apagando la potencia del filamento y eliminando la dewar de nitrógeno líquido del microscopio.
  18. Coloque algo para absorber la humedad en el soporte donde se sentó la dewar para capturar la condensación de las bobinas de cobre del microscopio.
  19. Activa el modo Ciclo Cryo y asegúrate de que la bomba turbo esté apagada.

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Resultados

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Utilizando los procedimientos presentados aquí, se purificaron muestras de tipo salvaje E. coli AcrB y AcrB-P223G mutante de E. coli. A continuación, las muestras fueron adsorbidas a rejillas microscopías electrónicas de electrones de manchas negativas de carbono y manchadas con acetato de urilo con el método de distensión lateral22. Se recogieron imágenes de manchas negativas utilizando microscopía electrónica de transmisión. La imagen de mancha negativa para la muestra de tipo ...

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Discusión

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Las interacciones proteína-proteínas son importantes para la integridad de la estructura y la función de las proteínas de membrana. Se han desarrollado muchos enfoques para investigar las interacciones proteína-proteínas. En comparación con las proteínas solubles, las proteínas de membrana y sus IBP son más difíciles de estudiar debido a las propiedades intrínsecas únicas de las proteínas de membrana. Esta dificultad proviene principalmente del requisito de que las proteínas de membrana se incrusen en un entorno nativo d...

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Divulgaciones

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Y.G aparece como inventor del polímero activo de membrana NCMNP5-2 y del sistema NCMN.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta investigación fue apoyada por el fondo de startups VCU (a Y.G.) y el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número R01GM132329 (a Y.G.) El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. Agradecemos a Montserrat Samso y Kevin McRoberts por su generoso apoyo a la grabación de vídeo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Productos químicos
30% Acrilamida/BIS SOL (37.5:1)Bio-Rad161-0158
4x Tampón de muestra Laemmli (tampón de carga)Bio-Rad1610747
Ácido acético glacialThermoFisher ScientificA38S-212
Persulfato de amonio (APS)Bio-Rad161-0700
CloranfenicolGoldbioC-105-5
Coomassie Brilliant Blue R-250 tinte de proteínaen polvo Bio-Rad161-0400
DTT (Ditiotreitol) (> 99% de pureza) Sin proteasasGoldbioDTT10
GlicerolThermoFisher ScientificG33-4
HEPESThermoFisher ScientificBP310-1
ImidazolAffymetrix17525 1 KG
IPTGGoldbioI2481C100
KanamicinaGoldbioK-120-25
Cloruro de magnesio hexahidratadoThermoFisher ScientificAA3622636
MetanolThermoFisher ScientificA412-4
N,N-dimetiletilendiamina (EDTA)Merck8.03779.0100
NCMNS-P5-2Aún no disponible comercialmenteEnvíe la solicitud para obtener al autor
Precision Plus Protein Dual Color StandardBio-Rad161-0374
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)Bio-Rad161-0301
SMA2000Cray ValleyEnvíe la solicitud para obtener al autor
Cloruro de sodioThermoFisher ScientificS271-10
TCEP-HClGoldbioTCEP25
TEMEDBio-Rad161-0800
Terrific Caldo MediaAffymetrix75856 1 KG
Tris BaseBio-Rad161-0719
Acetato de uraniloAmbinterAmb22348393
Equipment
Avanti J-26S XPIBeckman CoulterB14538
Avanti JXN-30Beckman CoulterB34193
Rejillas de Microscopio Electrónico de Carbono (10 nm)Ciencias de la Microscopía ElectrónicaCF300-Cu-TH
Homogeneizador de tejidos Con-TorqueEberbachE7265
Corning LSE Mini MicrocentrífugaThermoFisher Scientific07-203-954
EmulsiFlex-C3Avestin
F9-RGE Healthcare Life Sciences29003875
Mini-PROTEAN Tetra Célula de electroforesis vertical TetraBio-Rad165-8004
NanoDrop 2000 EspectrofotómetroThermoFisher ScientificND-2000
Ultracentrífuga Optima L-90KBeckman CoulterPN LL-IM-12AB
PELCO Sistema de limpieza de descarga easiGlow GlowTed Pella91000S-230
Potter-Elvehjem Trituradora de tejidos de molienda seguraWheaton358013
PowerPac Fuente de alimentación básicaBio-Rad164-5050
Razel R99-E Bombade jeringa de velocidad variableRazel Scientific Instruments
Superdex 200 Aumento 10/300 GLGE Healthcare Ciencias de la Vida28990944
Tecnai F20 200kVFEI
Tipo 70 Ti Rotor de ángulo fijoBeckman Coulter
General Materials
1.5 ml Microcentrífuga Tubos ThermoFisher Scientific05-408-129
4 ml Amicon Ultra-4 30 kDaMillipore SigmaUFC803024
AKTA pure 25 L1 FPLCGE Healthcare Life Sciences29018225
BL21(DE3)pLysS CellsThermoFisher ScientificC606003
Falcon 50 ml Tubo de centrífuga cónicoThermoFisher Scientific14-959-49A
HisTrap HP 5 Columnaml GE Healthcare Ciencias de la Vida17524802
pET-24aEMD Biosciences69749-3
correspondiente para correspondencia Colector de fracciones

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).
  3. Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination. Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).
  4. Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).
  5. Ngounou Wetie, A. G., et al. Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future. Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).
  6. Schaufele, F. Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy. Methods. 66 (2), 188-199 (2014).
  7. Berney, C., Danuser, G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).
  8. Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin. BMC Biology. 7, 50(2009).
  9. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there. Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
  10. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
  11. Overduin, M., Esmaili, M. Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function. Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).
  12. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  13. Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).
  14. Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers. Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).
  15. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).
  16. Yu, L., Lu, W., Wei, Y. AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies. PLoS One. 6 (12), 28390(2011).
  17. Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).
  18. Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
  19. Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes. Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).
  20. Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. Signal/noise analysis of FRET-based sensors. Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).
  21. Wang, Z., et al. Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter. Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).
  22. Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199(2018).
  23. Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization. Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).
  24. Lebon, G. Structure and Function of GPCRs. , Springer International Publishing. 229-230 (2019).
  25. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087(2014).
  26. Lee, S. C., et al. A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment. Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).
  27. Hall, S. C. L., et al. An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles. Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).
  28. Oluwole, A. O., et al. Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer. Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).

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