Aquí se presenta un protocolo definido químicamente para la derivación de podocitos renales humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas con alta eficiencia (>90%) e independiente de manipulaciones genéticas o selección de subpoblaciones. Este protocolo produce el tipo de célula deseado dentro de los 26 días y podría ser útil para las pruebas de nefrotoxicidad y el modelado de enfermedades.
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Artículo de método
Diferenciación guiada de podocitos renales maduros de células madre pluripotentes inducidas por humanos en condiciones químicamente definidas
En este artículo
Resumen
Resumen
La enfermedad renal afecta a más del 10% de la población mundial y cuesta miles de millones de dólares en gastos federales. Las formas más graves de enfermedad renal y eventual insuficiencia renal en etapa terminal a menudo son causadas por el daño a los podocitos glomerulares, que son las células epiteliales altamente especializadas que funcionan junto con las células endoteliales y la membrana basal glomerular para formar la barrera de filtración del riñón. Los avances en medicina renal se han visto obstaculizados por la limitada disponibilidad de tejidos primarios y la falta de métodos robustos para la derivación de células renales humanas funcionales, como los podocitos. La capacidad de derivar podocitos de fuentes renovables, como las células madre, podría ayudar a avanzar en la comprensión actual de los mecanismos del desarrollo y la enfermedad renal humana, así como proporcionar nuevas herramientas para el descubrimiento terapéutico. El objetivo de este protocolo era desarrollar un método para derivar podocitos maduros postmitóticos a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPS) con alta eficiencia y especificidad, y en condiciones químicamente definidas. Los podocitos derivados de células hiPS producidos por este método expresan marcadores específicos del linaje (incluyendo nefrina, podocina y tumor de Wilm 1) y exhiben las características morfológicas especializadas (incluidos los procesos primarios y secundarios del pie) asociadas con podocitos maduros y funcionales. Curiosamente, estas características especializadas están notablemente ausentes en la línea celular de podocitos inmortalizados ampliamente utilizada en el campo, lo que sugiere que el protocolo descrito aquí produce podocitos renales humanos que tienen un fenotipo de desarrollo más maduro que las líneas celulares de podocitos existentes típicamente utilizadas para estudiar la biología del riñón humano.
Introducción
Los avances en el cultivo de células madre pluripotentes humanas están a punto de revolucionar la medicina regenerativa, el modelado de enfermedades y la detección de fármacos al proporcionar a los investigadores una fuente renovable y escalable de material biológico que puede diseñarse para obtener casi cualquier tipo de célula dentro del cuerpo humano1. Esta estrategia es especialmente útil para derivar tipos de células especializadas y funcionales que de otro modo serían difíciles de obtener. Las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPS)2,3,
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Protocolo
1. Preparación de reactivos
- Suplemento diluido de medios de cultivo celular hiPS (CCM) descongelado en medio basal de cultivo celular hiPS para obtener una solución 1x de hiPS CCM.
NOTA: El suplemento congelado 5x hiPS CCM requiere un proceso de descongelación lento, idealmente en 4 ° C durante la noche. Las alícuotas del 1x hiPS CCM se pueden almacenar hasta 6 meses a -20 °C. - Preparación de placas recubiertas de matriz de membrana basal (BM) 1 para cultivo celular hiPS: Descongelar la matriz BM 1 durante la noche sobre hielo a 4 °C. Una vez descongeladas, prepare las alícuotas con los factores de dilución apropiados según lo sugerido por el fab....
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Resultados
El objetivo de este protocolo era demostrar que los podocitos humanos maduros pueden derivarse de células hiPS en condiciones químicamente definidas. Los datos presentados en este manuscrito se generaron mediante el uso de la línea celular DU11 hiPS17,que se probó por primera vez y se encontró que estaba libre de micoplasma. También se realizó un análisis cromosómico, y se encontró que las células eran cariotípicamente normales. Comenzando con las células hiPS DU11 indiferenciadas, la estrategia d.......
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Discusión
En este informe, describimos un protocolo para la generación de podocitos glomerulares renales a partir de células hiPS. Los podocitos derivados de células hiPS exhiben características morfológicas y moleculares asociadas con el fenotipo13de podocitos renales maduros. En publicaciones anteriores, demostramos que los podocitos derivados de células hiPS pueden imitar la estructura y la función de filtración selectiva del glomérulo renal cuando se cocultivan con células endoteliales microvasculares g.......
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Divulgaciones
S.M. es autor de una patente pendiente para métodos para la generación de podocitos renales a partir de células madre pluripotentes (solicitud de patente estadounidense 14/950859). Los autores restantes declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Escuela de Ingeniería Pratt de la Universidad de Duke, la División de Nefrología de la Escuela de Medicina de Duke, el Premio de Investigación de una Cátedra del Departamento de Medicina de la Universidad de Duke y un Premio Ad Hoc de Transición de Carrera PDEP del Fondo Burroughs Wellcome a S.M. M.B fue apoyado por el Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias. Agradecemos al Laboratorio Bursac por proporcionarnos generosamente la línea de células madre DU11, y al Laboratorio Varghese de la Universidad de Duke por compartir temporalmente sus instalaciones de cultivo de tejidos con nuest....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| fuertes | |||
| Esta línea ha sido analizada para micoplasma y nuestro laboratorio realizó el cariotipo por última vez en julio de 2019, y resultó ser cariotípicamente normal. | |||
| Crecimiento fuerte y suplementos de mediosÁcido | |||
| retinoico trans fuerte (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 suplemento sin suero | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | Puede mostrar una variación de lote a lote |
| Kit mediano completo con CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Sistemas de celdas | Medios de mantenimiento de podocitos |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 con suplemento GlutaMAX | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 con suplemento de glutamina |
| FBS inactivado por calor 10082147 | Thermo/Life Technologies Activina | ||
| humana A | PHC9564 | Thermo/Life Tecnologías | |
| BMP7 humano | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| VEGF humano | PHC9394 | medio Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 | 05850 | Stem Cell Technologies | medios de cultivo celular hiPS (CCM) |
| Penicilina– estreptomicina líquida (100&veces;) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 Inhibidor de ROCK | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– y Alexa Fluor 594– anticuerpos secundarios conjugados | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R& D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminina-E8 (LM-E8) fragmento | N-892012 | Iwai Norteamérica | Matriz de membrana basal (BM) 2 |
| Matrigel Matriz calificada para hESC, vial de 5 ml | 354277 | BD Biociencias | Matriz de membrana basal (BM) 1. Puede mostrar una variación de lote a lote |
| Enzimas y otros reactivos | |||
| Accutasa | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Solución de desprendimiento de celdas |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO es tóxico. Debe manipularse en una campana de seguridad química |
| Tampón de disociación celular sin enzimas, Hank' Sal equilibrada 13150016 | Thermo/Life Technologies | ||
| Solución de etanol, 70% (vol/vol), grado biotecnológico | 97065-058 | VWR | es inflamable y tóxico |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehído (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | El PFA debe manipularse en una campana de gases químicos con el equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes, bata de laboratorio y anteojos de seguridad. Evite la inhalación y el contacto con la piel. |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Agua destilada estéril | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Pipetas de aspiración, envueltas individualmente | 29442-462 | Centrífuga Corning | |
| Avanti J-15R | B99516 | Beckman Coulter | |
| Tubo de centrífuga cónico, 15 mL | 352097 | cónico Corning | |
| , 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | Para el almacenamiento de productos congelados alícuotas |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Microscopio fluorescente utilizado para adquirir imágenes de células iPS fijadas y teñidas y sus derivados |
| Hemocitómetro | 100503-092 | Incubadora | |
| Heracell VIOS 160i | 51030403 | Thermo/Life Technologies | Para el cultivo y mantenimiento rutinarios |
| de células iPS y sus derivadosZeiss Axio Observer invertido equipado con cámara AxioCam 503 | 491916-0001-000(microscopio) ; 426558-0000-000(cámara) | Carl Zeiss Microscopy | Se utiliza para adquirir imágenes de contraste de fase de células iPS vivas y sus derivados en cada etapa de la diferenciación de podocitos |
| Guantes de nitrilo Kimberly-Clark | 40101-346 | Toallitas Kimwipe VWR | |
| grandes | 21905-049 | Toallitas Kimwipes VWR | |
| pequeñas | 21905-026 | Puntas | |
| P10 | P1096-FR | de barrera Denville Scientific | |
| P100 | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 puntas de pipeta de barrera | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 puntas de pipeta de barrera P1121 | Denville Scientific | ||
| P200 Puntas | de pipeta de barreraP1122 | Denville Scientific | |
| , 10 mL, envuelta individualmente | 356551 | Pipeta | |
| , 25 mL, envuelta individualmente | 356525 | Pipeta | |
| , 5 mL, envuelta individualmente | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0,22 μ m, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Tubos de microcentrífuga estériles | 1138W14 | Thomas Scientific | Para la alícuota de factores de crecimiento |
| Cultivo de tejidos– placas de 12 pocillos tratadas | 353043 | de tejidos de Corning | |
| – placas de seis pocillos tratadas | 353046 | Corning Bata | |
| laboratorio VWR blanca techuni | 10141-342 | VWR | |
| Elevador de celdas de bisel ancho | 3008 | Corning |
Referencias
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L.
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Reimpresiones y permisos
