Este protocolo tiene como objetivo automatizar las mediciones de AFM en cientos de células microbianas. En primer lugar, los microbios se inmovilizan en microestructuras de sello PDMS y luego las mediciones de espectroscopia de fuerza se realizan automáticamente en cientos de células inmovilizadas.
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Artículo de método
Automatización De Las Mediciones De Microscopio De Fuerza Bio-Atómica En Cientos De Células De C. albicans
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En este artículo
Resumen
Resumen
El método presentado en este trabajo tiene como objetivo automatizar los experimentos bio-AFM y el registro de curvas de fuerza. Usando este método, es posible registrar curvas de fuerzas en 1000 celdas en 4 horas automáticamente. Para mantener un tiempo de análisis de 4 horas, el número de curvas de fuerza por celda se reduce a 9 o 16. El método combina un programa basado en Jython y una estrategia para ensamblar células en patrones definidos. El programa, implementado en un Bio-AFM comercial, puede centrar la punta en la primera celda de la matriz y luego moverse, automáticamente, de una celda a otra mientras registra las curvas de fuerza en cada celda. Utilizando esta metodología, es posible acceder a los parámetros biofísicos de las células como su rigidez, sus propiedades adhesivas, etc. Con la automatización y el gran número de células analizadas, se puede acceder al comportamiento de la población celular. Este es un gran avance en el campo Bio-AFM donde los datos, hasta ahora, se han registrado en sólo unas pocas decenas de células.
Introducción
Este trabajo proporciona una metodología para realizar mediciones automáticas de fuerza en cientos de células vivas utilizando un microscopio de fuerza atómica (AFM). También proporciona un método para inmovilizar microbios en un sello microestructurado PDMS que es compatible con experimentos AFM realizados en un entorno líquido.
Bio-AFM es una tecnología altamente especializada concebida para aplicaciones en biología y luego utilizada para estudiar células vivas. Se requiere un ingeniero capacitado que pueda analizar una célula en ese momento. En estas condiciones, el número de células diferentes que se pueden analizar es bastante pequeño,....
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Protocolo
1. Cultivo celular microbiano
- Revivir las células de una culata de glicerol.
NOTA: C. albicans se almacenan a -80 °C en existencias de glicerol, en mármoles.- Recoger un mármol en el stock de -80 °C y frotarlo en levadura peptona dextrosa (YPD) agar. Cultivar las células durante 2 días a 30 °C, antes del cultivo líquido.
- Preparar cultivos líquidos.
- Llene un tubo de cultivo con 5 mL de caldo YPD estéril y agregue una sola colonia de células de C. albicans, cultivadas en la placa de agar YPD.
- Cultivar el cultivo en condiciones estáticas a 30 °C durante 20 h antes de la cosecha por centrifuga....
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Resultados
Utilizamos el protocolo descrito para analizar el efecto del caspofungin sobre las propiedades biofísicas de los albicans humanos oportunistas de C. del patógeno en su forma de levadura. Caspofungin es una molécula antihongos de la última ocasión usada cuando otras drogas son ineficaces debido a los mecanismos de la resistencia que las células desarrollan hacia antihongos. Su mecanismo de acción se basa en la inhibición de la subunidad Fks2 del complejo fks1/Fks2 responsable de la síntesis de glucano ß. Como los.......
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Discusión
La principal mejora proporcionada por esta metodología es un aumento significativo en el número de células medidas en una cantidad determinada de tiempo. La contraparte es una reducción del número de puntos medidos por celda. Esto significa que este método no está diseñado para proporcionar un análisis detallado de una sola celda. El método sólo se aplica a las celdas que pueden caber en los pozos del sello PDMS. El sello es bastante versátil, mientras que contiene pozos de 1,5 x 1,5 μm2 hasta 6 x 6 μm2.<.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Queremos reconocer a FONCYCYT de CONACYT (México), el ministerio de Relaciones Exteriores de Francia y la Universidad París 13, a través del apoyo financiero del proyecto colaborativo internacional ECOS-NORD llamado Nano-palpación para el diagnóstico, No. 263337 (México) y MI5P02 (Francia). AMR desea agradecer el apoyo financiero de SIP-IPN a través del proyecto No. 20195489. SPC es apoyado por una beca de doctorado de CONACYT (No. 288029) e IPN a través del acuerdo cotutelle para obtener doble certificado de doctorado (IPN-UPS). ED y CFD son investigadores del Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Voladizo AFM | Bruker Sondas AFM | MLCT | Los voladizos utilizados fueron los etiquetados " C” con frecuencia de resonancia de 7 a 10 kHz y k: 0,01 N/m |
| Análisis de datos AFM | JPK-Bruker | JPK Versión de procesamiento de datos mínima 5.1.8 | Se puede descargar desde un cuenta de usuario de JPK-Bruker |
| AFM Placas de Petri | WPI | FluoroDish FD35-100 | El calentador se utilizó para controlar los cambios de temperatura durante el experimento |
| Microscopio de fuerza atómica (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II o III | el AFM debe montarse en un microscopio óptico invertido con una platina motorizada |
| Caspofungina | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Se utilizó caspofungina con una concentración de 4 MIC (Concentración Mínima de Inhibidor)Editor de |
| código | Microsoft | Visual Studio Code versión 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
| Cryobeads | IFU | CB12 | |
| Desecador/Desgasificación cámara | Fisherbrand | 15594635 | El equipo se utiliza para desgasificar los sellos de PDMS durante unos 50 minutos, cualquier desecador junto con una bomba de vacío servirá. |
| Calentador de plato de Petri | JPK-Bruker | PetriDishHeater | Este es un complemento del JPK/Bruker AFM. El calentador se utilizó para monitorear los cambios de temperatura durante el experimento |
| Tampón de acetato de sodio pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | La solución contiene 18 mM de acetato de sodio, 1 mM de CaCl2 y 1 mM de MnCl2. Ajustar el pH con ácido acético glacial. La solución se puede almacenar a 4 & grados; C durante 2 meses |
| Lenguaje de análisis estadístico | https://www.r-project.org | R versión 3.6.1 | R es un lenguaje y entorno para la computación estadística y los gráficos. Es un proyecto GNU que es similar al software de análisis estadístico del lenguaje y entorno S |
| https://rstudio.com | R studio versión 1.1.463 | colaboración entre la Fundación R, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP y otros. RStudio y Shiny son proyectos afiliados de la Fundación para las Estadísticas de Acceso Abierto | |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polidimetilsiloxano (PDMS) y agente de curado en un solo juego |
| Levadura Peptona D Caldo | Difco | 242820 | |
| YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |
Referencias
- Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
- Dague, E., et al.
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Reimpresiones y permisos
