Automatización De Las Mediciones De Microscopio De Fuerza Bio-Atómica En Cientos De Células De C. albicans

Resumen

Este protocolo tiene como objetivo automatizar las mediciones de AFM en cientos de células microbianas. En primer lugar, los microbios se inmovilizan en microestructuras de sello PDMS y luego las mediciones de espectroscopia de fuerza se realizan automáticamente en cientos de células inmovilizadas.

Resumen

El método presentado en este trabajo tiene como objetivo automatizar los experimentos bio-AFM y el registro de curvas de fuerza. Usando este método, es posible registrar curvas de fuerzas en 1000 celdas en 4 horas automáticamente. Para mantener un tiempo de análisis de 4 horas, el número de curvas de fuerza por celda se reduce a 9 o 16. El método combina un programa basado en Jython y una estrategia para ensamblar células en patrones definidos. El programa, implementado en un Bio-AFM comercial, puede centrar la punta en la primera celda de la matriz y luego moverse, automáticamente, de una celda a otra mientras registra las curvas de fuerza en cada celda. Utilizando esta metodología, es posible acceder a los parámetros biofísicos de las células como su rigidez, sus propiedades adhesivas, etc. Con la automatización y el gran número de células analizadas, se puede acceder al comportamiento de la población celular. Este es un gran avance en el campo Bio-AFM donde los datos, hasta ahora, se han registrado en sólo unas pocas decenas de células.

Introducción

Este trabajo proporciona una metodología para realizar mediciones automáticas de fuerza en cientos de células vivas utilizando un microscopio de fuerza atómica (AFM). También proporciona un método para inmovilizar microbios en un sello microestructurado PDMS que es compatible con experimentos AFM realizados en un entorno líquido.

Bio-AFM es una tecnología altamente especializada concebida para aplicaciones en biología y luego utilizada para estudiar células vivas. Se requiere un ingeniero capacitado que pueda analizar una célula en ese momento. En estas condiciones, el número de células diferentes que se pueden analizar es bastante pequeño, típico de 5 a 10 células en 4-5 horas. Sin embargo, la cantidad de mediciones de fuerza registradas en una sola celda suelen ser muy altas y pueden llegar fácilmente a 1000. Por lo tanto, el paradigma actual de las mediciones de fuerza AFM en células vivas es registrar cientos de curvas de fuerza (FCs) pero en un número limitado de células.

Estadísticamente, este enfoque es cuestionable y plantea la cuestión de la representatividad de la muestra. De hecho, es difícil, por ejemplo, evaluar la heterogeneidad de una población celular midiendo sólo unas pocas células, incluso si se registran cientos de mediciones en estas pocas células. Sin embargo, es sobre la base de este paradigma que se han realizado importantes avances en biofísica, microbiología y nanomedicina^1,2,3. De hecho, el análisis nanométrico a escala de células individuales ha proporcionado nueva información sobre la nanomecánica celular, sobre la organización de las proteínas transmembrana, o el mecanismo de acción de los fármacos antimicrobianos o anticancerígenos^4,5,6,7. Sin embargo, recientemente han surgido varias pruebas biomecánicas de alto rendimiento realizadas en células^8,mostrando el interés de la comunidad científica en cambiar este paradigma y acceder a la heterogeneidad de la población celular. Todos estos ensayos se basan en sistemas microfluídicos para deformar las células y medir ópticamente su deformación bajo tensión para obtener una medida indirecta de su elasticidad superficial global^8. Sin embargo, un problema importante con estos métodos es que son mono-paramétricos: sólo la elasticidad celular puede ser sondeada. Además, no permiten la medición de los parámetros mecánicos de las células adherentes, lo que puede ser limitante para los estudios de células de mamíferos no circulantes o biopelículas, por ejemplo.

Los enfoques que involucran AFM han sido desarrollados por los equipos de S. Scheuring⁹ y M. Favre^10. Células inmovilizadas de Scheuring et al. en patrones de fibronectina⁹, obligando a las células individuales a tomar la forma del patrón⁹. Luego, este equipo mapeó las propiedades mecánicas de unas pocas celdas para definir datos promedio, representativos de 14 a 18 celdas. El desarrollo llevado a cabo por Farve et al. tuvo como objetivo multiplexar las mediciones mediante la paralelización de los voladizos AFM¹⁰. A nuestro conocimiento, este trabajo en la dirección de multiplexación no ha llevado a las medidas en células vivas.

Un enfoque interesante propuesto por el equipo de Dujardin presenta un AFM automatizado capaz de identificar células y realizar imágenes de ellas en el fondo de pozos hechos a medida. Aunque este método no permite el análisis de una gran población de células, permite la prueba automática de diferentes condiciones en cada pozo^11.

Nuestro objetivo en este trabajo es más ambicioso ya que hemos querido medir al menos 1000 células para acceder no a una célula media, sino, por el contrario, a la heterogeneidad entre células. La estrategia que desarrollamos aquí para acceder a la heterogeneidad de la población celular utilizando AFM se basa en el análisis de cientos de células en las que se registra un número limitado de curvas de fuerza. En comparación con el enfoque "clásico" de registrar un gran número de curvas de fuerza en un número limitado de células, este enfoque debe considerarse complementario, ya que no proporciona la misma información. De hecho, mientras que el método típico permite sondear la heterogeneidad de la superficie celular individual, utilizando nuestro enfoque, podemos acceder a toda la heterogeneidad de la población celular. Para lograr este objetivo, hemos combinado un método que inmoviliza directamente los microbios (aquí la especie de levadura Candida albicans)en los pocillos de un sello microestructurado PDMS^12,y desarrolla un programa original para mover la punta AFM, automáticamente, de célula a célula¹³ y medir las propiedades mecánicas de cada célula.

Protocolo

1. Cultivo celular microbiano

1. Revivir las células de una culata de glicerol.
   NOTA: C. albicans se almacenan a -80 °C en existencias de glicerol, en mármoles.
   1. Recoger un mármol en el stock de -80 °C y frotarlo en levadura peptona dextrosa (YPD) agar. Cultivar las células durante 2 días a 30 °C, antes del cultivo líquido.
2. Preparar cultivos líquidos.
   1. Llene un tubo de cultivo con 5 mL de caldo YPD estéril y agregue una sola colonia de células de C. albicans, cultivadas en la placa de agar YPD.
   2. Cultivar el cultivo en condiciones estáticas a 30 °C durante 20 h antes de la cosecha por centrifugación (4000 x g,5 min). Deseche el sobrenadante y quítelo como residuo de riesgo biológico.
   3. Lavar los pellets 2x con 10 mL de tampón de acetato (8 mM de acetato de sodio, 1 mM de CaCl_2,1 mM de MnCl_2,pH 5,2). Centrífuga (4000 x g,5 min) entre lavados.
   4. Resuspend el pellet en 2 mL de tampón de acetato y utilizar esta solución para la inmovilización celular en el sello PDMS.
      NOTA: Esta suspensión no se puede almacenar y debe prepararse fresca para la sección 3.

2. Preparación del sello PDMS

1. Preparación de moldes maestros de silicio
   1. Dibuje las microestructuras deseadas utilizando el software de diseño asistido por computadora (CAD).
      NOTA: Los pozos diseñados deben ser de tamaño similar al microbio a atrapar. El diseño debe proporcionar una matriz grande de pozos de 100 x 100 en la lista. Lo mejor es hacer varias matrices con tamaños ligeramente diferentes alrededor del tamaño promedio del microbio.
   2. Si hay una sala limpia disponible, siga los pasos 2 a 12 del protocolo¹²publicado anteriormente. De lo contrario, el molde maestro de silicio se puede adquirir en instalaciones comerciales de sala limpia.
2. Moldeo de sellos PDMS
   1. Preparar 55 g de solución de prepolímero PDMS que contenga una mezcla de 10 a 1, relación masa, de oligómeros PDMS y agente de curado(Tabla de Materiales).
   2. Mezcle y desgaste esta solución al vacío (en el rango de 10^-1-10^-2 barras) hasta que todas las burbujas atrapadas se eliminen de la solución PDMS (5−10 min).
   3. Verter 20 g de la solución desgastada en el molde maestro de silicio y desgasificar de nuevo (en el rango de 10^-1-10^-2 bares).
      NOTA: El espesor del sello debe ser de alrededor de 2−3 mm.
   4. Cuando se eliminen todas las burbujas, reticular el PDMS a 80 °C durante 1 h.
   5. Corte el sello microestructurado pdms con un bisturí (0,5 x 1,5 cm²⁾en una dirección paralela a las matrices de microestructura visibles.
   6. Pelar el sello del molde maestro de silicio.
   7. Devuelva el sello para exhibir las microestructuras en su parte superior y depositarlo en un portaobjetos de vidrio. Asegúrese de tener las microestructuras mirando hacia arriba lejos de la diapositiva de vidrio. Alinee las microestructuras que se pueden ver en el sello con el lado de la corredera de vidrio, que más tarde servirá como referencia para el procedimiento de automatización AFM.
      NOTA: En esta etapa, el sello PDMS está listo para la inmovilización celular. Los sellos PDMS se pueden almacenar en el molde maestro de silicio durante varios meses. Cuando se retira todo el PDMS del molde maestro, se puede fundir de nuevo un nuevo sello PDMS en el molde maestro (para mantener el molde maestro seguro, es posible replicarlo en poliuretano)¹⁴.

3. Preparación de la muestra

1. Inmovilización celular
   1. Centrífuga (500 x g,5 min) 600 μL de la solución celular resuspended para separar el tampón de las células.
   2. Pipeteo 200 μL del sobrenadante desde el paso 3.1.1 en el sello PDMS, y desgasificación al vacío (en el rango de 10^-1-10^-2 barras) durante aproximadamente 40 min.
      NOTA: Este paso es importante para mejorar la inmovilización celular dentro de los pozos. Las moléculas de la pared celular de la levadura, presentes en el sobrenadante, probablemente se depositan en la superficie de PDMS durante este paso de pre-humectación. Estas moléculas, muy probablemente, mejoran la adhesión de las células y contribuyen al aumento en la tasa de llenado de sellos.
   3. Después de 40 min, con una pipeta, retire el tampón de la superficie del PDMS y deposite, con una pipeta, 200 μL de la solución celular del paso 1.2.4 durante 15 min a temperatura ambiente.
   4. Coloque las células en las microestructuras del sello por ensamblaje convectivo/capilar. Para eso, extienda manualmente 200 μL de suspensión de celdas a través del sello utilizando un portaobjetos de vidrio en ambas direcciones con un ángulo entre 30 y 50 °. Puede ser necesario pasar la diapositiva de vidrio varias veces en el sello para lograr una alta tasa de llenado.
      Nota : una descripción completa de este método está disponible¹³.
   5. Retire la suspensión de la celda con una pipeta. Lavar el sello 3x con 1 mL de tampón de acetato, pH 5.2 para eliminar las células que no quedaron atrapadas.
   6. Seque la parte posterior del sello utilizando el flujo de nitrógeno, con el fin de asegurarse de que el sello se adhiera a la placa de Petri seca.
   7. Finalmente deposite el sello PDMS lleno de células en una placa de Petri(Tabla de Materiales)y llénelo con 2 mL de tampón de acetato para mantener las células en medio líquido.
2. Establecer el sello en el escenario AFM
   1. Centre el escenario en 0:0 al iniciar las operaciones de AFM.
   2. Calibrar la sensibilidad y la constante de resorte del voladizo en vidrio y en agua como se describe en Unsay et al.¹⁵
   3. Tome la placa de Petri con el sello y colótela en el soporte de la placa de Petri AFM.
   4. Alinee el borde del sello perpendicular al eje Y del soporte de la placa de Petri.
      NOTA: Un ángulo de inclinación aceptable es inferior a 5° como se ilustra en la Figura 1.
   5. Coloque la cabeza AFM en el escenario y tenga cuidado de que los motores paso a paso estén lo suficientemente extendidos para evitar que la punta se estrelle contra el sello.

4. Ejecución del programa AFM

NOTA: El programa AFM se proporciona como material complementario (AutomatipSoftware2019.pdf). Requiere un JPK-Bruker AFM Nanowizard II o III equipado con una etapa motorizada y software de escritorio JPK versión 4.3. El programa ha sido desarrollado bajo Jython (versión basada en python 2.7)

1. Adquisición de datos
   1. Centre la punta AFM en la parte superior de la esquina izquierda de los pozos de 4,5 x 4,5 μm² (correspondiente al tamaño de la célula) utilizando el microscopio óptico AFM. Si se necesita otro tamaño de pozo, centre en la esquina superior izquierda de los pozos deseados.
   2. Realice un mapa de fuerza de 64 x 64 (rango Z = 4 μm, velocidad de punta = 90 μm·s^-1,fuerza aplicada de 3 a 5 nN) sobre un área de 100 x 100 μm². Seleccione Modo de asignación de fuerza en el cuadro desplegable Modo de medición. En el panel de asignación de control de fuerza ingrese los siguientes parámetros: Rel. Setpoint = 3 a 5 nN; longitud z 4 μm; Movimiento Z: duración constante; tiempo de extensión: 0.01s; retraso externo: 0; Retardo retr: 0, modo de retardo: fuerza constante, frecuencia de muestreo 2048 Hz; Z bucle cerrado desmarque; Cuadrícula: compruebe imagen cuadrada, rápido 100 μm, lento: 100μm, X desplazamiento: 0 μm; Desplazamiento Y: 0 μm; ángulo de la cuadrícula: 0 grados; Píxeles: 64x64; proporción de píxeles: 1:1
      Nota: Un resultado típico se muestra en la figura 2. Esta imagen ayudará a medir y verificar el tono entre dos pozos.
   3. Tenga en cuenta las coordenadas del centro del pozo superior izquierdo (W1) y del pozo inferior izquierdo (denominado W2 en la Figura 2). Para ello, haga una caja cuadrada alrededor del pozo. La coordenada del centro del cuadro aparece en el panel izquierdo del software AFM en cuadros de coordenadas x,y.
   4. Para abrir el software de automatización(Automatip_scan.py):en el software de escritorio JPK, haga clic en avanzar en el menú de la barra superior y seleccione abrir el script. En la ventana que se abre, seleccione la ruta hacia el archivo de script proporcionado en Datos suplementarios (Automatip_scan.py).
   5. Implemente los valores de coordenadas W1 y W2 en la sección del cuadro Entradas del script Jython (Figura 3). Introduzca las coordenadas W1 en la línea variable P1 239 del script y las coordenadas W2 en la línea variable P2 241.
      NOTA: Los pozos seleccionados como coordenadas iniciales (W1 y W2) no deben estar demasiado cerca del borde del área de escaneo. De lo contrario, el algoritmo de centrado no se ejecutaría correctamente porque necesita medir la altura en la superficie pdms a cada lado del pozo. Para obtener un ejemplo, consulte la figura 4.
   6. Atribuya el valor de tono a la línea de variable de tono 245 del script.
   7. Introduzca la dimensión de pozo en la línea de variable Ws 248. Esto se sabe a partir del diseño de los patrones del pozo y se puede comprobar en la misma imagen que la utilizada para verificar el tono (Figura 2).
   8. Escriba la ruta de acceso al directorio de almacenamiento en la línea 251 para guardar los datos en el lugar deseado.
   9. Establezca la línea variable totalArea 254 en el múltiplo "n" de deseo de 100 μm (que es el área de escaneo máxima del AFM utilizado). El número total de pozos que se sondearán se puede calcular utilizando este valor y el tono: área de exploración máxima / tono *n².
      NOTA: En el ejemplo de la Figura 3,se analizarán 9 áreas de 100 x 100^{μm 2.}
   10. Establezca la matriz de curvas de fuerza, fila y columna (3, 3 o 4, 4), registradas por pozo en la línea variable 257 de numScans.
       NOTA: En el ejemplo de la Figura 3,se registrará una matriz de 3 x 3 = 9 CF para cada pozo.
   11. Ejecute el programa. Haga clic en el botón Inicio.
       NOTA: El programa primero ejecuta automáticamente un algoritmo de centrado para determinar mejor el centro de los pozos W1 y W2 (paso 1). A continuación, adquiere automáticamente la matriz de curvas de fuerza (FCs) en cada pozo de la primera área de escaneo (paso 2). Cuando se sondean todos los pozos de esa área, el script mueve automáticamente la punta AFM al primer pozo de la siguiente área de escaneo. La punta se retrae, la etapa del microscopio se mueve a la siguiente área, la punta se aborda de nuevo en el sello y el algoritmo de centrado se ejecuta de nuevo para volver a centrar automáticamente en el primer pozo (1') de esa área (paso 3). La primera área es definida por el usuario, la segunda, está a la derecha, etc. hasta que se alcanza n. El área n+1 está debajo de n, n+2 a la izquierda de n+1, etc. hasta que se alcanza 2n. 2n+1 está por debajo de 2n, y 2n+2 está a la derecha en 2n, etc. A nivel mundial, la punta serpentina a través de la zona total. Los pasos 2 y 3 se repiten automáticamente hasta que se haya sondeado el número total "n²" de áreas de escaneo. La Figura 5 presenta el diagrama de flujo del programa. Se tarda ~ 4 h para completar el programa.
2. análisis de datos
   1. Ejecute el script python "Copy files"(Copy_files_L.py, proporcionado en Supplementary Data)para organizar los archivos de FCs en una carpeta. Este script fue desarrollado con Python 2.7 y el módulo SciPy. Use el software Visual Studio Code para abrir el script de Python.Use Visual Studio Code software to open the python script. Ruta de entrada a la carpeta general (línea 67 del script proporcionado en datos complementarios) y donde se almacenará (línea 73).
   2. Abra el software de procesamiento de datos del fabricante de AFM para analizar las curvas de fuerza. En el menú superior Archivo, seleccione abrir 'lote de curvas de espectroscopia.
   3. En la ventana de procesamiento por lotes, seleccione el proceso proporcionado en Datos suplementarios (StiffnessProcess.jpk-proc-force). Seleccione el último paso del proceso y haga clic en Mantener y aplicar a todos. Todas las curvas de fuerza recibirán el mismo tratamiento.
      NOTA: El proceso utiliza la calibración de los archivos de CF para convertir las curvas de deflexión en curvas de fuerza calibradas en Newton; se aplica un algoritmo de suavizado de datos (promedio de 3 puntos consecutivos); la línea de base se traduce para descansar en el eje cero; el punto de contacto se extrapola y el FC se desplaza para colocar el punto de contacto en la coordenada (0,0); la flexión del voladizo se resta a los FCs, se ajusta la pendiente de retracción. Al final del tratamiento de datos, el software genera un archivo que contiene una tabla que da para cada CF: su nombre, Módulo joven, punto de contacto, fuerza de adhesión, pendientes, etc.
   4. Repita los pasos 4.2.1 a 4.2.3 para todos los experimentos. Tenga cuidado de guardar los datos en diferentes carpetas (es decir: "...\TREATED\" y "...\UNTREATED\")
   5. Utilice el script R proporcionado en Datos suplementarios para trazar histogramas y diagramas de caja y realizar tratamientos estadísticos ANOVA.
      1. Para abrir el script de R (DataAnalisys.R), utilice el software de estudio de R y cargue los archivos que contienen la información extraída con el software de procesamiento de datos (.tsv).
      2. En la ventana de entorno, use el botón Importar conjunto de datos, en la lista que se muestra, seleccione de texto (readr) y en la nueva ventana, seleccione el botón Explorador y busque el archivo .tsv.
      3. Una vez cargado el fichero, seleccione las columnas (rigidez y adherencia) que se incluirán para el análisis. Para ejecutar todo el código, presione Ctrl+Alt+R.
         NOTA: La secuencia de comandos funciona con 4 conjuntos de datos, considere dos experimentos que tienen células no tratadas y tratadas. Es posible ejecutar bloques del script y ver cómo cambian las variables según las funciones ejecutadas.

Resultados

Utilizamos el protocolo descrito para analizar el efecto del caspofungin sobre las propiedades biofísicas de los albicans humanos oportunistas de C. del patógeno en su forma de levadura. Caspofungin es una molécula antihongos de la última ocasión usada cuando otras drogas son ineficaces debido a los mecanismos de la resistencia que las células desarrollan hacia antihongos. Su mecanismo de acción se basa en la inhibición de la subunidad Fks2 del complejo fks1/Fks2 responsable de la síntesis de glucano ß. Como los...

Discusión

La principal mejora proporcionada por esta metodología es un aumento significativo en el número de células medidas en una cantidad determinada de tiempo. La contraparte es una reducción del número de puntos medidos por celda. Esto significa que este método no está diseñado para proporcionar un análisis detallado de una sola celda. El método sólo se aplica a las celdas que pueden caber en los pozos del sello PDMS. El sello es bastante versátil, mientras que contiene pozos de 1,5 x 1,5 μm² hasta 6 x 6 μm^2.<...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Voladizo AFM	Bruker Sondas AFM	MLCT	Los voladizos utilizados fueron los etiquetados " C” con frecuencia de resonancia de 7 a 10 kHz y k: 0,01 N/m
Análisis de datos AFM	JPK-Bruker	JPK Versión de procesamiento de datos mínima 5.1.8	Se puede descargar desde un cuenta de usuario de JPK-Bruker
AFM Placas de Petri	WPI	FluoroDish FD35-100	El calentador se utilizó para controlar los cambios de temperatura durante el experimento
Microscopio de fuerza atómica (AFM)	JPK-Bruker	Nanowizard II o III	el AFM debe montarse en un microscopio óptico invertido con una platina motorizada
Caspofungina	Sigma-Aldrich	SML0425-5MG	Se utilizó caspofungina con una concentración de 4 MIC (Concentración Mínima de Inhibidor)Editor de
código	Microsoft	Visual Studio Code versión 1.40.1	https://code.visualstudio.com/
Cryobeads	IFU	CB12
Desecador/Desgasificación cámara	Fisherbrand	15594635	El equipo se utiliza para desgasificar los sellos de PDMS durante unos 50 minutos, cualquier desecador junto con una bomba de vacío servirá.
Calentador de plato de Petri	JPK-Bruker	PetriDishHeater	Este es un complemento del JPK/Bruker AFM. El calentador se utilizó para monitorear los cambios de temperatura durante el experimento
Tampón de acetato de sodio pH 5.2	Sigma-Aldrich	S7899	La solución contiene 18 mM de acetato de sodio, 1 mM de CaCl2 y 1 mM de MnCl2. Ajustar el pH con ácido acético glacial. La solución se puede almacenar a 4 & grados; C durante 2 meses
Lenguaje de análisis estadístico	https://www.r-project.org	R versión 3.6.1	R es un lenguaje y entorno para la computación estadística y los gráficos. Es un proyecto GNU que es similar al software de análisis estadístico del lenguaje y entorno S
	https://rstudio.com	R studio versión 1.1.463	colaboración entre la Fundación R, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP y otros. RStudio y Shiny son proyectos afiliados de la Fundación para las Estadísticas de Acceso Abierto
Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761028	Polidimetilsiloxano (PDMS) y agente de curado en un solo juego
Levadura Peptona D Caldo	Difco	242820
YPD Agar	Difco	DF0427-17-6