Caracterización de las propiedades de transporte intracartílago de los portadores de péptidos catiónicos

Resumen

Este protocolo determina la absorción de equilibrio, la profundidad de penetración y la tasa de difusión sin equilibrio para los portadores de péptidos catiónicos en el cartílago. La caracterización de las propiedades de transporte es fundamental para garantizar una respuesta biológica eficaz. Estos métodos se pueden aplicar para diseñar un portador de medicamentos con carga óptima para apuntar a los tejidos cargados negativamente.

Resumen

Varios tejidos cargados negativamente en el cuerpo, como el cartílago, presentan una barrera a la administración de fármacos dirigidos debido a su alta densidad de aggrecanos cargados negativamente y, por lo tanto, requieren métodos de focalización mejorados para aumentar su respuesta terapéutica. Debido a que el cartílago tiene una alta densidad de carga fija negativa, los medicamentos se pueden modificar con portadores de medicamentos cargados positivamente para aprovechar las interacciones electrostáticas, lo que permite un mejor transporte de fármacos dentro del cartílago. Por lo tanto, estudiar el transporte de los portadores de fármacos es crucial para predecir la eficacia de los fármacos para inducir una respuesta biológica. Mostramos el diseño de tres experimentos que pueden cuantificar la absorción de equilibrio, la profundidad de penetración y la tasa de difusión sin equilibrio de los portadores de péptidos catiónicos en explantes de cartílago. Los experimentos de absorción de equilibrio proporcionan una medida de la concentración de soluto dentro del cartílago en comparación con su baño circundante, que es útil para predecir el potencial de un portador de fármacos en la mejora de la concentración terapéutica de fármacos en el cartílago. Los estudios de profundidad de penetración mediante microscopía confocal permiten la representación visual de la difusión del soluto 1D desde la zona superficial hasta la profunda del cartílago, lo que es importante para evaluar si los solutos alcanzan sus sitios de matriz y diana celular. Los estudios de tasa de difusión sin equilibrio que utilizan una cámara de transporte diseñada a medida permiten medir la fuerza de las interacciones de unión con la matriz tisular mediante la caracterización de las tasas de difusión de los solutos etiquetados fluorescentemente a través del tejido; esto es beneficioso para diseñar portadores de resistencia óptima de unión con cartílago. Juntos, los resultados obtenidos de los tres experimentos de transporte proporcionan una guía para diseñar portadores de medicamentos con carga óptima que aprovechan las interacciones de carga débiles y reversibles para aplicaciones de administración de medicamentos. Estos métodos experimentales también se pueden aplicar para evaluar el transporte de fármacos y conjugadores portadores de fármacos. Además, estos métodos se pueden adaptar para su uso en la orientación a otros tejidos cargados negativamente como el menisco, la córnea y el humor vítreo.

Introducción

La administración de drogas a los tejidos cargados negativamente en el cuerpo sigue siendo un desafío debido a la incapacidad de los fármacos para penetrar profundamente en el tejido para llegar a los sitios diana celular y matriz¹. Varios de estos tejidos comprenden aggrecanos densamente embalados y cargados negativamente que crean una alta densidad de carga fija negativa (FCD)² dentro del tejido y actúan como una barrera para la entrega de la mayoría de las macromoléculas^3,4. Sin embargo, con la ayuda de portadores de medicamentos cargados positivamente, esta b....

Protocolo

Se obtuvieron aprobaciones universitarias para la realización de los experimentos con tejidos muertos. Las juntas bovinas se obtuvieron comercialmente de un matadero.

1. Extracción de explant de cartílago

1. Usando un bisturí (#10 cuchilla), corta y elimina la grasa, los músculos, los ligamentos, los tendones y todo el resto del tejido conectivo para exponer el cartílago de la ranura femoropatelar de las articulaciones de las rodillas bovinas.
2. Usando punzones dérmicos de 3 mm y 6 mm, haga punzones perpendiculares en el cartílago para extraer tapones cilíndricos. Coloque inmediatamente los tapones en pozos individuales de un....

Resultados

Después de la absorción de equilibrio de CPC por cartílago, la fluorescencia del baño disminuye cuando el soluto ha sido tomado por el tejido. Sin embargo, si el valor de fluorescencia del baño final sigue siendo similar al inicial, indica que no hay/mínimo absorción de soluto. Otra confirmación de la absorción de soluto es si el tejido ha cambiado visiblemente el color al color del tinte fluorescente. La absorción cuantitativa de solutos en el cartílago se determinó utilizando la relación de absorción (R_U) de.......

Discusión

Los métodos y protocolos descritos aquí son significativos para el campo de la administración de fármacos dirigidos a los tejidos cargados negativamente. Debido a la alta densidad de aggrecanos cargados negativamente presentes en estos tejidos, se crea una barrera, evitando así que los fármacos lleguen a sus sitios de destino celular que se encuentran profundamente dentro de la matriz. Para hacer frente a este desafío excepcional, los medicamentos pueden ser modificados para incorporar portadores de medicamentos cargados.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Arandela SAE de acero inoxidable 316	McMaster-Carr	91950A044	Para tamaño de tornillo número 5, 0.14 "ID, 0.312" OD
Placa de poliestireno de 96 pocillos	Fisherbrand 12566620
Acrílico negro Lámina de calibre grueso	Polímero Reynolds	N/A	no equilibrio y cámara de transporte de difusión 1-D
Antibiótico-Antimicótico	Gibco	15240062	100x
Investigación de cartílago bovino	87	N/A	2-3 semanas de edad, surco femoropatellar
Albúmina sérica bovina Bioreactivos		Fisher BP671-1
CPC+14 LifeTein		LT1524	Péptido diseñado a medida
CPC+20	LifeTein	LT1525	Péptido diseñado a medida
CPC+8	LifeTein	LT1523	Personalizado péptido diseñado
Limpiadores para tareas delicadas	Kimberly-Clark Professional	34155
Punzón dérmico	MedBlades	MB5-1
Portaobjetos de microscopio de vidrio liso económicos de 3	Fisherbrand	12550A3
Placas de cultivo celular de fondo plano	Corning Costar	3595	Transparente, 96 pocillos
Película de envoltura flexible	Bemis Parafilm M Laboratorio	1337412
Sello de Oro Cubierta de vidrio	Microscopía Electrónica Ciencias	6378701	# 1.5, 18x18 mm
Perforadora accionada por martillo	McMaster-Carr	3427A15	1/2" de diámetro
Perforadora impulsada por martillo	McMaster-Carr	3427A19	Láser de 3/4"
de	Tecnología Chroma AT480	/30m	Espectrofotómetro Láser
Tuerca hexagonal ligera de acero de baja resistencia	McMaster-Carr	90480A007	6-32 Tamaño de rosca
LSM 700 Microscopio Confocal	Zeiss	LSM 700
Micro Barras de agitación magnéticas	Bel-Art Spinbar	F37119-0007	7x2 mm
Lámina de caucho de neopreno multiusos	McMaster-Carr	1370N12	1/32" de espesor
Leche bovina desnatada	Sigma Aldrich	M7409
Placa de Petri	Chemglass Life Sciences	CGN1802145	150 mm
de diámetro Solución salina tamponada con fosfato	Corning	21-040-CMR	1x
Agitador de placas	VWR	89032-088
Inhibidores de proteasa	Thermo Scientific	A32953
Hojas de afeitar	Fisherbrand	12640
Lámina acrílica de calibre fino R-Cast	Polímero Reynolds N	/A	Insertos de cámara de transporte negros
RTV	Silicona Loctite	234323	Epoxi, no corrosivo, transparente
Bisturí	TedPella	549-3	#10, #11 cuchillas
Receptor de señal	Tecnología Chroma	ET515lp	Espectrofotómetro Receptor de señal láser
Microcentrífuga Snap-Cap Tubos	Eppendorf	22363204	1.5 mL
Espátula	TedPella	13508
Synergy H1 Lector de microplacas	Biotek	H1M
Tornillo de cabeza hueca de acero aleado galvanizado	McMaster-Carr	90128A153	6-32 Tamaño de rosca, 1" de largo

Para difusión en , 4 y 6 mm diámetro