Este protocolo proporciona un método para digerir los ojos enteros en una sola suspensión celular con el propósito de análisis citométrico de flujo multiparamétrico con el fin de identificar poblaciones fagocíticas mononucleares oculares específicas, incluyendo monocitos, microglia, macrófagos y células dendríticas.
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Artículo de método
Digestión de ojos enteros del ratón para el análisis citométrico de flujo multiparamétrico de fagocitos mononucleares
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Resumen
Resumen
El sistema inmunitario innato desempeña un papel importante en la fisiopatología ocular, incluida la uveítis, la retinopatía diabética y la degeneración macular relacionada con la edad. Las células inmunes innatas, específicamente fagocitos mononucleares, expresan marcadores de superficie celular superpuestos, lo que hace que identificar estas poblaciones sea un desafío. La citometría de flujo multiparamétrico permite el análisis simultáneo y cuantitativo de múltiples marcadores de superficie celular con el fin de diferenciar monocitos, macrófagos, microglia y células dendríticas en los ojos del ratón. Este protocolo describe la enucleación de ojos enteros del ratón, disección ocular, digestión en una sola suspensión celular y tinción de la suspensión de una sola célula para marcadores de células mieloides. Además, explicamos los métodos adecuados para determinar voltajes utilizando controles de un solo color y para delinear puertas positivas usando fluorescencia menos uno controles. La principal limitación de la citometría de flujo multiparametrista es la ausencia de arquitectura tisular. Esta limitación puede superarse mediante citometría de flujo multiparar de compartimentos oculares individuales o tinción de inmunofluorescencia gratuita. Sin embargo, la inmunofluorescencia está limitada por su falta de análisis cuantitativo y la reducción del número de fluoróforos en la mayoría de los microscopios. Describimos el uso de citometría de flujo multiparamétrico para proporcionar un análisis altamente cuantitativo de fagocitos mononucleares en neovascularización coroidal inducida por láser. Además, la citometría de flujo multiparametrismo se puede utilizar para la identificación de subconjuntos de macrófago, mapeo del destino y clasificación celular para estudios transcriptómicos o proteómicos.
Introducción
El sistema inmunitario innato incluye múltiples tipos celulares que estimulan la activación y la inflamación del complemento. Las células inmunes innatas incluyen células asesinas naturales (NK), mastocitos, basófilos, eosinófilos, neutrófilos y fagocitos mononucleares. Los fagocitos mononucleares, compuestos por monocitos, macrófagos y células dendríticas, se han implicado en la fisiopatología de múltiples afecciones oftálmicas como la uveítis, la retinopatía diabética y la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE)1. En este protocolo, nos centraremos en la identificación de fagocitos mononucleares utilizando análisis citométricos de....
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Protocolo
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Northwestern. Los ratones C57BL/6 estaban alojados en una instalación de barrera en el Centro de Medicina Comparada de la Universidad Northwestern (Chicago, IL). Todos los animales estaban alojados en ciclo claro/oscuro de 12/12 h con libre acceso a alimentos y agua.
1. Recolección de tejido ocular
- Sacrificar ratones C57BL/6J de 10-12 semanas de edad de cualquiera de los dos sexos usando la administración regulada de dióxido de carbono hasta que el ratón no responda y ya no inhale. Realizar dislocación cervical u ot....
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Resultados
La Figura 1 mostró histogramas de frecuencia no compensados para los SCCs y las celdas para el láser rojo: Alexa647, Alexa700 y APC-Cy7. En la Figura 1A,la línea magenta representaba el pico del SCC para Alexa647, mientras que la línea de cian mostraba la diferencia de registro 0.5 prevista. Observe que el pico en Alexa700 y APC-Cy7 fue a la izquierda (menos brillante) de la línea de cian. También tenga en cuenta que todas las celdas estaban a la izquierda de la.......
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Discusión
La citometría de flujo multiparamétrico permite el análisis cuantitativo de múltiples tipos de células en un tejido complejo. En este informe, describimos la detección citométrica de flujo de poblaciones mononucleares de fagocitos, incluidos monocitos, células dendríticas y subconjuntos de macrófagos, después de lesiones láser en el ojo del ratón. Liyanage et al recientemente informó de una estrategia de gating similar para detectar neutrófilos, eosinófilos, linfocitos, DCs, macrófagos, macrofagos infiltrados y monocitos.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
JAL fue apoyado por la subvención de los NIH K08EY030923; Cmc fue apoyado por una subvención K01 (5K01AR060169) del Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticos del NIH y una Nueva Beca de Investigación (637405) de la Alianza de Investigación lupus.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de microcentrífuga de 0,6 ml | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Tubos de microcentrífuga de 1,7 ml | Costar | 3620 | |
| pipetas de 10 ml | Fisher Scientific | 431031 | |
| cónicas de 15 ml | ThermoFisher | 339650 | |
| 1x HBSS, 500 ml | Gibco | 14025-092 | |
| Jeringa de 2,5 ml | Henke Sass Wolf | 7886-1 | |
| Solución de paraformaldehído al 20% | Microscopía Electrónica Sciences | 15713-S | |
| Pipetas de 25 ml | Fisher Scientific | 431032 | |
| aguja de 30 G | Exel | 26437 | |
| 3ml jeringa Luer Lock | Fisher Scientific 14955457 | ||
| 41 x 41 x 8 mm plato de pesaje de poliestireno | Fisher Scientific | 08-732-112 | |
| 50 ml cónicas Falcon | 352070 | ||
| Placa de ensayo de 96 pocillos, fondo en U sin tapa | Falcon | 353910 | |
| Perlas reactivas a la amina | ThermoFisher | A10628 | |
| Software de análisis | FlowJo | v 10 | |
| Juego de cuentas Ig kappa anti-ratas y anti-hámster | BD Biosciences | 552845 | |
| Ratones C57BL/6J | Laboratorio Jackson | 664 | |
| Contador de células | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Portaobjetos de contador de células | Invitrogen | C10283 | |
| Cuentas de compensación | ThermoFisher | 01-1111-42 | |
| Cuentas de conteo | ThermoFisher | 01-1234-42 | |
| Pinzas curvas | Fisher Scientific | 16-100-123 | |
| Enzima de digestión | Sigma Aldrich | 5401020001 | |
| Microscopio de disección | National Optical and Scientific Instruments, Inc. | DC3-420T Tubos | |
| de disociación | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Disociador electrónico | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Fc bloque, rata anti-ratón CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | |
| Pinza fina | Integra Miltex | 17035X | |
| Tampón de flujo | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Citómetro | de flujo BD Biosciences | ||
| Tubos de flujo | Halcón | 352008 | |
| Hamster anti-ratón CD11c BV421 | BD Biosciences | ||
| Cubitera | Fisher Scientific | 07-210-123 | |
| Tinte vivo/muerto | ThermoFisher | 65-0866-14 | |
| Solución de lisado, solución 10x | BD Biosciences | 555899 | |
| Micro titulación de tubo y gradilla | Fisher Scientific | 02-681-380 | |
| Antiratón CD64 PE | BioLegend | 139304 | |
| Antiratón NK1.1 PECF594 | BD Biosciences | 562864 | |
| Puntas de pipeta P1000 | Denville Scientific | P2404 | |
| Pipeta P1000 | Gilson | FA10006M | |
| Puntas de pipeta P2 | Eppendorf | 22491806 | |
| P2 | Gilson | FA10001M | |
| Pipeta P20 Puntas de pipeta | Gilson | FA10003M | |
| P200 | Denville Scientific | P2401 | |
| Pipeta P200 | Gilson | FA10005M | |
| Pipeta hombre | Fisher Scientific | FB14955202 | |
| Rata anti-ratón B220 PECF594 BD | Biosciences | 562313 | |
| Rata anti-ratón CD11b APC-Cy7 | BD Biosciences | 557657 | |
| Rata anti-ratón CD19 AlexaFluor 700 | BD Biosciences | 557958 | |
| Rata anti-ratón CD19 PE | BD Biosciences | 553786 | |
| Rata anti-ratón CD4 PECF594 | BD Biosciences | 562314 | |
| Rata anti-ratón CD45 FITC ThermoFisher | 11-0451-82 | ||
| Rata anti-ratón CD45 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552848 | |
| Rata anti-ratón CD8 PECF594 | BD Biosciences | 562315 | |
| Rata anti-ratón Ly6C | BD Biosciences | ||
| Rata anti-ratón Ly6G PECF594 | BD Biosciences | 562700 | |
| Rata anti-ratón MHC II AlexaFluor 700 | BioLegend | 107622 | |
| Rata anti-ratón Siglec F PECF594 | BD Biosciences | 562757 | |
| Rata anti-ratón Tim4 AlexaFluor647 | BD Biosciences | 564178 | |
| Incubadora de agitación | Labnet | 311DS | |
| Tijeras de resorte | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Colador de células estériles, malla de nailon de 40 mm | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Agua estéril, 500 ml | Gibco | A12873-01 | |
| Centrífuga de cubo oscilante | eppendorf | 5910 R | |
| Azul tripano, solución al 0,4% | Gibco | 15250061 |
Referencias
- Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
- Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A.
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