Digestión de ojos enteros del ratón para el análisis citométrico de flujo multiparamétrico de fagocitos mononucleares

Resumen

Este protocolo proporciona un método para digerir los ojos enteros en una sola suspensión celular con el propósito de análisis citométrico de flujo multiparamétrico con el fin de identificar poblaciones fagocíticas mononucleares oculares específicas, incluyendo monocitos, microglia, macrófagos y células dendríticas.

Resumen

El sistema inmunitario innato desempeña un papel importante en la fisiopatología ocular, incluida la uveítis, la retinopatía diabética y la degeneración macular relacionada con la edad. Las células inmunes innatas, específicamente fagocitos mononucleares, expresan marcadores de superficie celular superpuestos, lo que hace que identificar estas poblaciones sea un desafío. La citometría de flujo multiparamétrico permite el análisis simultáneo y cuantitativo de múltiples marcadores de superficie celular con el fin de diferenciar monocitos, macrófagos, microglia y células dendríticas en los ojos del ratón. Este protocolo describe la enucleación de ojos enteros del ratón, disección ocular, digestión en una sola suspensión celular y tinción de la suspensión de una sola célula para marcadores de células mieloides. Además, explicamos los métodos adecuados para determinar voltajes utilizando controles de un solo color y para delinear puertas positivas usando fluorescencia menos uno controles. La principal limitación de la citometría de flujo multiparametrista es la ausencia de arquitectura tisular. Esta limitación puede superarse mediante citometría de flujo multiparar de compartimentos oculares individuales o tinción de inmunofluorescencia gratuita. Sin embargo, la inmunofluorescencia está limitada por su falta de análisis cuantitativo y la reducción del número de fluoróforos en la mayoría de los microscopios. Describimos el uso de citometría de flujo multiparamétrico para proporcionar un análisis altamente cuantitativo de fagocitos mononucleares en neovascularización coroidal inducida por láser. Además, la citometría de flujo multiparametrismo se puede utilizar para la identificación de subconjuntos de macrófago, mapeo del destino y clasificación celular para estudios transcriptómicos o proteómicos.

Introducción

El sistema inmunitario innato incluye múltiples tipos celulares que estimulan la activación y la inflamación del complemento. Las células inmunes innatas incluyen células asesinas naturales (NK), mastocitos, basófilos, eosinófilos, neutrófilos y fagocitos mononucleares. Los fagocitos mononucleares, compuestos por monocitos, macrófagos y células dendríticas, se han implicado en la fisiopatología de múltiples afecciones oftálmicas como la uveítis, la retinopatía diabética y la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE)^1. En este protocolo, nos centraremos en la identificación de fagocitos mononucleares utilizando análisis citométricos de flujo multiparamétrico en un modelo de ratón de AMD neovascular^2. Este protocolo es adaptable para modelos de ratón de retinopatía diabética y/o uveítis, pero se recomienda una disección ocular más extensa debido a la naturaleza sistémica de estas enfermedades.

Los fagocitos mononucleares expresan marcadores de superficie celular superpuestos. Los macrófagos y microglia residentes en tejidos de larga duración se originan a partir del progenitor eritromicoide derivado del saco de yema^3,mientras que el reciclaje de macrófagos y células dendríticas se diferencian del progenitor de células dendríticas de células dendríticas derivadas de la médula ósea^4. Los marcadores de superficie de celda del ratón comunes a monocitos, macrófagos y celdas dendríticas incluyen CD45, CD11b^5,F4/80^6,Cx3cr1⁷y el marcador intracelular Iba1^8. Con el fin de superar este desafío, el análisis transcriptómico de macrófagos, monocitos y células dendríticas de múltiples tejidos define CD64 como un marcador de superficie celular específico del macrófago⁶. Se han descrito macrófagos en el iris, la coroides, el cuerpo ciliario y el nervio óptico en ojos sanos^3. Alternativamente, la identificación de células dendríticas es más difícil; el método más específico de identificación de células dendríticas requiere mapeo del destino utilizando el ratón reportero Zbtb46-GFP⁹. Independientemente de esta línea de reportero, expresión de CD11c y MHCII en conjunto con la ausencia de CD64 puede identificar posibles células dendríticas^6,10. Las células dendríticas se han identificado en córnea, conjuntiva, iris y coroides en los ojos normales^11. Las microglias son macrófagos especializados ubicados en la retina, protegidos por la barrera hematoencefálica y derivados de las células progenitoras del saco de yema^12. Como resultado, la microglia retiniana se puede diferenciar de los macrófagos derivados de monocitos por sus niveles tenues de la expresión CD45¹³ y los altos niveles de Tmem119, que está disponible como anticuerpo de citometría de flujo^14. Sin embargo, tras la activación de la microglia, el CD45 puede estar regulado¹⁵ y Tmem119 puede estar regulado a la baja^3,lo que demuestra la complejidad de la biología de la microglia y esto es probablemente relevante tanto en AMD como en su modelo de ratón. Por último, los monocitos se pueden dividir en al menos dos subtipos, incluidos los clásicos y no clásicos. Los monocitos clásicos muestran ccr2⁺ly6C^altoCX3CR1^baja expresión, y los monocitos no clásicos demuestran CCR2^-Ly6C^bajoCX3CR1 marcadores^{altos 5}.

Debido a la necesidad del análisis cuantitativo de la expresión de marcadores, es decir, niveles altos frente a bajos/tenues, la citometría de flujo multiparamétrico es el método ideal para la discriminación entre monocitos, macrófagos, microglia y células dendríticas en el ojo y otros tejidos. Otras ventajas incluyen la identificación de subpoblaciones, la capacidad de utilizar la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para ordenar las poblaciones celulares para el análisis transcriptómico o proteómico, y el mapeo del destino. La principal desventaja de la citometría de flujo multiparametrista es la falta de arquitectura tisular. Esto puede ser superado por la disección oftálmica en los diversos subcompartmentos oculares: córnea, conjuntiva, iris, lente, retina y complejo choroide-sclera. Además, se pueden realizar imágenes confirmatorias de inmunofluorescencia, pero está limitada por el número de marcadores y la falta de cuantificación robusta.

Estudios de asociación del genoma han vinculado múltiples genes complementarios con AMD^16. La activación del complemento conduce a la producción de anafiltoxina, el reclutamiento de leucocitos y la inflamación resultante. En ratones deficientes en receptores complementarios, la lesión láser reduce el reclutamiento de fagocitos mononucleares y la neovascularización coroidal inducida por láser (CNV) área^17. Del mismo modo, el ratón knockout del receptor de quimiocina con motivo C-C 2 (CCR2), que es deficiente en el reclutamiento de monocitos al tejido, demuestra tanto la disminución del reclutamiento de fagocitos mononucleares como el área¹⁸del CNV inducida por láser. Estos enlaces de datos complementan y mononucleares fagocitos con CNV experimental y posiblemente AMD neovascular. En apoyo de esta asociación, los receptores complementarios están disregulados en monocitos sanguíneos periféricos en pacientes con DMM neovascular^19,20. Estos datos demuestran una fuerte asociación entre la AMD y los fagocitos mononucleares.

En este manuscrito, utilizaremos el modelo experimental de CNV inducido por láser para caracterizar las poblaciones mononucleares de fagocitos en el ojo del ratón utilizando citometría de flujo multiparametral. El CNV inducido por láser es el modelo estándar de ratón de la AMD neovascular, que demostró la eficacia de la terapia amd neovascular de primera línea actual^21. Este protocolo describirá la enucleación de los ojos del ratón, la disección ocular, la digestión en una sola suspensión celular, la tinción de anticuerpos, la determinación de voltajes láser utilizando controles de un solo color y la estrategia de gating utilizando controles de fluorescencia menos uno (FMO). Para obtener una descripción detallada del modelo CNV inducido por láser, consulte la publicación^{anterior 22}. Con este protocolo, definiremos microglia, monocitos, células dendríticas y poblaciones de macrófago. Además, utilizaremos MHCII y CD11c para definir aún más subconjuntos de macrófago dentro del modelo CNV inducido por láser.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Northwestern. Los ratones C57BL/6 estaban alojados en una instalación de barrera en el Centro de Medicina Comparada de la Universidad Northwestern (Chicago, IL). Todos los animales estaban alojados en ciclo claro/oscuro de 12/12 h con libre acceso a alimentos y agua.

1. Recolección de tejido ocular

1. Sacrificar ratones C57BL/6J de 10-12 semanas de edad de cualquiera de los dos sexos usando la administración regulada de dióxido de carbono hasta que el ratón no responda y ya no inhale. Realizar dislocación cervical u otro método secundario aprobado para garantizar la eutanasia.
   NOTA: Se puede realizar perfusión transcardial para eliminar los leucocitos circulantes que no están en los tejidos oculares. En este experimento, la perfusión sistémica no reduce el número de microglia, monocitos, macrófagos o células dendríticas detectadas en ojos enteros sin tratar o tratados con láser. Por lo tanto, la mayoría de estos tipos de células se encuentran en los tejidos oftálmicos y este paso es opcional.
2. Para enuclear los ojos, empuje hacia abajo cerca de la cavidad ocular mientras coloca un par de fórceps curvas suavemente debajo del ojo mientras se destaca de la cavidad. Pellizcar fórceps cerrados debajo del ojo sin apretar el ojo real. Desalojar la vista de la conjuntiva circundante (véase la publicación previa)²³.
3. Tire del ojo lateralmente hasta que el nervio óptico sea la única conexión restante para separar el ojo. El nervio óptico a menudo se corta con tensión, pero una pequeña tijera a veces es necesaria para cortar el nervio óptico. Coloque el ojo en la solución salina tamponada (HBSS) fría de 1x Hank con calcio y magnesio en tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.

2. Digestión del tejido ocular

1. Preparar el tampón de digestión que contiene 0,1 mg/mL enzima de digestión y 0,2 mg/ml DNase en HBSS frío. Reconstituir 5 mg de enzima digestión en 2 ml de agua estéril inicialmente. Preparar una dilución inicial de 10 mg/ml de DNase en HBSS. Por cada 10 ml del tampón de digestión (suficiente para 3 animales) mezclar 9,4 ml de HBSS frío con 0,4 ml de enzima de digestión reconstituida y 0,2 ml de DNase I diluido.
   NOTA: Estas concentraciones se determinaron empíricamente sobre múltiples experimentos para proporcionar niveles óptimos de tinción de anticuerpos de células individuales, al tiempo que se reducía la muerte celular. La colágena D se probó como una alternativa a la enzima digestión con menor viabilidad celular y disminución de las células CD45^+. Consulte Discusión para obtener más detalles sobre el proceso iterativo para optimizar la digestión.
2. Bajo un microscopio diseccionador a una ampliación total de 10x, retire la conjuntiva y el nervio óptico restantes usando fórceps finos y tijeras de resorte en HBSS frío.
3. Mueva los ojos limpios a un plato de disección seco o a un pequeño bote de pesaje. Inyectar 0,15-0,20 ml/ojo de amortiguador de digestión a través de jeringa equipada con aguja de 30 G en la cavidad vítrea después de que dos heridas perforadoras se hacen en el ojo a través del eje visual y a 90° de distancia de esta primera herida para la salida del búfer de digestión.
4. Ojos enteros mince usando tijeras de resorte y fórceps finos con todas las piezas más pequeñas de 0,5 mm x 0,5 mm. Disociar el tejido de la lente con una interrupción mecánica contundente a través de fórceps para evitar la obstrucción de puntas de pipeta en pasos posteriores. Para cada muestra, enjuague los fórceps y tijeras cada uno con 0,75 ml de amortiguador de digestión en un plato pequeño. Use un plato nuevo para cada muestra.
5. Transfiera el contenido del plato a un tubo de disociación en hielo utilizando pipeta P1000 teniendo cuidado de no perder ningún material en la transferencia de pipeta. Enjuague el plato con 1,5 ml adicionales de amortiguador de digestión, lo que eleva el volumen total en tubo de disociación a 3,25-3,50 ml.
6. Coloque el tubo de disociación invertido en disociador electrónico y ejecute el ciclo "m_brain_03_01", que consiste en una rotación unidireccional de 1 min a 200 rpm a temperatura ambiente, que es un programa precargado. Asegúrese de que todo el tejido esté en la parte inferior del tubo de disociación en contacto con el búfer de digestión y el rotor para este y todos los pasos restantes.
7. Coloque el tubo de disociación en la incubadora de agitación durante 30 minutos a 200 rpm a 37 °C.
8. Repita los pasos 2.6 y 2.7 una vez más. Después de la segunda incubación de 30 minutos realizar una digestión mecánica final utilizando disociador electrónico como en el paso 2.6.
9. Detenga la reacción añadiendo 10 ml de amortiguador de flujo frío y coloque tubos sobre hielo.

3. Preparación de la suspensión celular

1. Para crear la suspensión de una sola célula, vierta la reacción de digestión ocular detenida a través de un filtro de 40 μm colocado en la parte superior de un tubo centrífugo cónico de 50 ml. Usando el émbolo de una jeringa de 2,5 ml, empuje cualquier pedazo restante de tejido ocular indigno a través del filtro.
2. Lave el tubo de disociación con 10 ml de tampón flow y enjuague el filtro antes de usar el mismo émbolo para pasar de nuevo piezas de tejido ocular no digerida a través del filtro.
3. Repita el paso 3.2 usando 5 mL de búfer de flujo.
4. Lave el tubo de disociación y filtre con un amortiguador final de 10 ml de flujo.
   NOTA: El volumen total de digestión y búfer de flujo es de aproximadamente 38-40 ml para cada muestra.
5. Centrífuga el tubo cónico a 400 x g durante 10 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.
6. Prepare la solución de lysing 1x añadiendo solución de lisante de 10x al agua estéril. Rompe el pellet moviendo el tubo contra otro tubo. Para liar los glóbulos rojos, añadir 1 ml de solución de lisante 1x para 30 s con remolino a temperatura ambiente (RT).
7. Detenga la reacción con 20 ml de búfer de flujo.
8. Centrífuga el tubo cónico a 400 x g durante 10 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.
9. Disociar el pellet moviendo el tubo contra otro tubo. Añadir 5 ml de frío 1x HBSS por tubo.
10. Tubos centrífugas a 400 x g durante 10 min a 4 °C. Aspirar supernadante.

4. Tinción de la suspensión celular para fagocitos mononucleares

1. Prepare 0,5 ml de mancha viva/muerta por muestra diluyendo el tinte vivo/muerto 1:5.000 en HBSS frío.
2. Agregue la mancha Live/Dead a cada muestra usando una pipeta P1000 asegurándose de disociar el pellet por completo. Transfiera muestras a tubos de micro titulaciones de 1,2 ml.
3. Tome una pequeña alícuota (10 μL) para contar las células utilizando un hemociclomeciómetro o contador de células automático (ver 4.4). Incuba muestras con mancha viva/muerta durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
4. Cuente celdas usando Trypan blue para determinar el número de celdas vivas por muestra.
   NOTA: Típicamente, 2 ojos de un ratón C57BL/6J de 10-12 semanas de edad contienen menos de 2 x 10⁶ células vivas.
5. Lave muestras añadiendo 400 μL de búfer de flujo frío. Tubos centrífugos en un bastidor de tubo de micro titulaciones a 400 x g durante 10 minutos a 4 °C. Aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.
6. Células resuspend completamente en 500 μL de búfer de flujo frío. Tubos centrífugos en un bastidor de tubo de micro titulaciones a 400 x g durante 10 minutos a 4 °C. Aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.
7. Bloquee hasta 5 x 10⁶ células vivas en 50 μL de bloque F_c (dilución de 1:50 en búfer de flujo frío de rata purificada anti-ratón CD16/CD32). Si más de 5 x 10⁶ células vivas, aumente los volúmenes adecuadamente.
8. Añadir bloque F_c al pellet asegurándose de disociar completamente la muestra. Incubar durante 20 min a 4 °C.
9. Añadir 50 μL de solución de tinción de anticuerpos (ver Tabla 1 para su elección y cantidad de cada anticuerpo que se incluye en la solución) por 5 x 10⁶ células vivas directamente a las células en bloque F_c y mezclar completamente. Incubar durante 30 min a 4 °C.
   NOTA: Las cantidades de anticuerpos dependen de la configuración del citómetro de flujo y deben valorarse de forma independiente para cada laboratorio e instrumento. Consulte la Tabla 2 para la configuración de instrumentos de filtros y espejos. Para valorar anticuerpos, comience con la recomendación del fabricante y calcule el índice de tinción. Realice una prueba de concentraciones de anticuerpos variables (tanto por encima como por debajo de la recomendación del fabricante) y elija la concentración más baja de anticuerpos donde se mantiene el índice de tinción. Además, asegúrese de que la tinción positiva que es menos brillante que el control de un solo color. Utilice células sin manchar para asegurarse de que las células manchadas negativamente están a escala y tienen un pico en o menos de 1 x 10². Utilice una fluorescencia menos un control para definir las células manchadas positivamente.
10. Lave muestras añadiendo 700 μL de búfer de flujo frío. Tubos centrífugos en un bastidor de tubo de micro titulaciones a 400 x g durante 10 minutos a 4 °C. Aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.
11. Opcionalmente, después de la tinción de anticuerpos, las muestras se pueden fijar con 500 μL de paraformaldehído del 2% en el búfer de flujo. Corrija muestras durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, realice un lavado como se describe en 4.10. Almacene muestras fijas a 4 °C. Las cuentas de recuento deben agregarse el día de la recopilación de datos de citometría de flujo. Las muestras fijas deben ejecutarse en el cytómetro de flujo en 1-2 días.
    PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es un peligro corrosivo y para la salud.
12. Lave muestras de nuevo usando 500 μL de búfer de flujo frío. Tubos centrífugos en un bastidor de tubo de micro titulaciones a 400 x g durante 10 minutos a 4 °C. Aspirar la mitad del sobrenadante sin perturbar el pellet celular.
13. Resuspend pellets y transferir a un pozo 96, placa de ensayo de fondo en U. Placa centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Para decantar el sobrenadante, gire la placa y en una sacudida fuerte desaloje el líquido en una cuenca del fregadero, sin perturbar el pellet.
14. En un nuevo tubo micro titulador de 1,2 ml, coloque 50 μL de cuentas de recuento bien vórtices.
15. Pellets resuspend en 96 placa de pozo en 200 μL de amortiguador de flujo frío. Agregue la mezcla celular en la parte superior de las cuentas del paso anterior. Ejecute el citómetro de flujo en un volumen total de 250 μL / tubo de micro titulador.

5. Recopilación de datos de citometría de flujo

1. Encienda y prepare el citómetro de flujo. Las instrucciones enumeradas aquí son para un cytómetro láser de cuatro modificados (Tabla 2).
2. Ejecute una muestra de prueba, que incluye una pequeña alícuota de cada muestra, para asegurarse de que todas las células están a escala para cada detector. Ajuste los voltajes para que todas las celdas estén a escala.
3. Ejecute controles de un solo color (SCC) para cada fluoróforo utilizado en el cóctel de tinción(Tabla 3). Coloque el tubo de micro titulación en un tubo de poliestireno de 5 ml más grande para colocarlo en la etapa del citómetro de flujo.
   NOTA: Los fluoróforos radiculares como BV421 (Azul Pacífico), FITC, PE, Alexa647 (APC) y Alexa700 no requieren el mismo anticuerpo que el cóctel (es decir, CD19 PE para CD64 PE). Sin embargo, los fluoróforos tándem como PE-CF594, PE-Cy7 o APC-Cy7 requieren el mismo anticuerpo para SCC que el cóctel debido a la posible disociación de los fluoróforos conjugados.
   1. Cree el SCC para BV421 añadiendo 2 gotas de cuentas de compensación a un tubo de titer de 1,2 ml junto con 1 μL de hámster anti-ratón CD11c BV421. Las cuentas de compensación se utilizan porque CD11c BV421 es un subtipo lambda IgG en lugar de kappa como se describe en 5.3.3. Incubar durante 15 minutos a 4 °C. Agregue 0,2 ml de búfer de flujo.
   2. Crea el SCC para el tinte Live/Dead añadiendo una gota de cuentas de tinción positivas (tapa verde) a partir de las cuentas reactivas de amina, seguidas de 1 μL de tinte Vivo/Muerto. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Añadir una gota de las cuentas negativas (tapa blanca) de las cuentas reactivas amina. Agregue 0,2 ml de búfer de flujo.
   3. Cree los SCC restantes añadiendo una gota de cuentas de tinción positivas (tapa verde) del conjunto de cuentas anti-rata y anti-hámster Ig kappa, seguida de la cantidad de anticuerpos enumerada(Tabla 3)en un tubo de titer de 1,2 ml. Incubar durante 15 min a 4 °C. Añadir una gota de las cuentas negativas (tapa blanca) de la anti-rata y anti-hámster Ig kappa conjunto de cuentas. Agregue 0,2 ml de búfer de flujo.
   4. Vórtice todas las mezclas de cuentas completamente. Almacene los SCCs a 4 °C durante un tiempo de hasta 3 días.
      NOTA: El SCC para ratones reporteros fluorescentes son células sin manchar.
   5. Al ejecutar SCCs, establezca voltajes de tal manera que la muestra SCC tenga un pico mayor que cualquier fluorescencia para una muestra de células en el mismo canal detector. Además, se deben fijar tensiones para que cualquier SCC tenga al menos una diferencia de registro de 0,5 entre el pico del histograma en el canal de interés frente a cualquier otro canal (Figura 1).
4. Ejecute muestras en eventos de mantenimiento "Bajos"/segundo por debajo de 4000. Si el caudal no se puede reducir adecuadamente, diluya las muestras con un búfer de flujo frío adicional. Registre el volumen agregado, ya que esto será necesario para el cálculo del recuento (ver resultados representativos).
5. Recopile al menos 3 x 10⁶ eventos por muestra. Esto puede ser mayor que el número de células debido a que los gránulos pigmentos y los desechos cuentan como eventos en el cytómetro.
6. Registre una Fluorescencia Menos Uno (FMO) para cada fluoróforo que no sea Vivo/Muerto para una estrategia de gating adecuada en la sección 6.4. Una FMO es una muestra que ha sido manchada con todos los fluoróforos excepto uno.
7. Limpie y apague el citómetro de flujo de acuerdo con las instrucciones del fabricante o de la instalación.

6. Anotación de datos de citometría de flujo

1. Abra una nueva hoja de trabajo mediante el software de análisis. Importe archivos FCS desde el citómetro para todas las muestras y controles de un solo color.
2. Utilice SCCs para crear una matriz de compensación.
3. Aplique la matriz de compensación a sus muestras manchadas y FMOs.
4. Utilice los FMOs para determinar la tinción positiva para dibujar puertas.

Resultados

La Figura 1 mostró histogramas de frecuencia no compensados para los SCCs y las celdas para el láser rojo: Alexa647, Alexa700 y APC-Cy7. En la Figura 1A,la línea magenta representaba el pico del SCC para Alexa647, mientras que la línea de cian mostraba la diferencia de registro 0.5 prevista. Observe que el pico en Alexa700 y APC-Cy7 fue a la izquierda (menos brillante) de la línea de cian. También tenga en cuenta que todas las celdas estaban a la izquierda de la...

Discusión

La citometría de flujo multiparamétrico permite el análisis cuantitativo de múltiples tipos de células en un tejido complejo. En este informe, describimos la detección citométrica de flujo de poblaciones mononucleares de fagocitos, incluidos monocitos, células dendríticas y subconjuntos de macrófagos, después de lesiones láser en el ojo del ratón. Liyanage et al recientemente informó de una estrategia de gating similar para detectar neutrófilos, eosinófilos, linfocitos, DCs, macrófagos, macrofagos infiltrados y monocitos...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de microcentrífuga de 0,6 ml	Fisher Scientific	05-408-120
Tubos de microcentrífuga de 1,7 ml	Costar	3620
pipetas de 10 ml	Fisher Scientific	431031
cónicas de 15 ml	ThermoFisher	339650
1x HBSS, 500 ml	Gibco	14025-092
Jeringa de 2,5 ml	Henke Sass Wolf	7886-1
Solución de paraformaldehído al 20%	Microscopía Electrónica Sciences	15713-S
Pipetas de 25 ml	Fisher Scientific	431032
aguja de 30 G	Exel	26437
3ml jeringa Luer Lock	Fisher Scientific 14955457
41 x 41 x 8 mm plato de pesaje de poliestireno	Fisher Scientific	08-732-112
50 ml cónicas Falcon		352070
Placa de ensayo de 96 pocillos, fondo en U sin tapa	Falcon	353910
Perlas reactivas a la amina	ThermoFisher	A10628
Software de análisis	FlowJo	v 10
Juego de cuentas Ig kappa anti-ratas y anti-hámster	BD Biosciences	552845
Ratones C57BL/6J	Laboratorio Jackson	664
Contador de células	Invitrogen	AMQAX1000
Portaobjetos de contador de células	Invitrogen	C10283
Cuentas de compensación	ThermoFisher	01-1111-42
Cuentas de conteo	ThermoFisher	01-1234-42
Pinzas curvas	Fisher Scientific	16-100-123
Enzima de digestión	Sigma Aldrich	5401020001
Microscopio de disección	National Optical and Scientific Instruments, Inc.	DC3-420T Tubos
de disociación	Miltenyi Biotec	130-096-334
DNase	Roche	10104159001
Disociador electrónico	Miltenyi Biotec	130-095-937
FACS Diva software	BD Biosciences
Fc bloque, rata anti-ratón CD16/CD32	BD Biosciences	553142
Pinza fina	Integra Miltex	17035X
Tampón de flujo	Miltenyi Biotec	130-091-221
Citómetro	de flujo BD Biosciences
Tubos de flujo	Halcón	352008
Hamster anti-ratón CD11c BV421	BD Biosciences
Cubitera	Fisher Scientific	07-210-123
Tinte vivo/muerto	ThermoFisher	65-0866-14
Solución de lisado, solución 10x	BD Biosciences	555899
Micro titulación de tubo y gradilla	Fisher Scientific	02-681-380
Antiratón CD64 PE	BioLegend	139304
Antiratón NK1.1 PECF594	BD Biosciences	562864
Puntas de pipeta P1000	Denville Scientific	P2404
Pipeta P1000	Gilson	FA10006M
Puntas de pipeta P2	Eppendorf	22491806
P2	Gilson	FA10001M
Pipeta P20 Puntas de pipeta	Gilson	FA10003M
P200	Denville Scientific	P2401
Pipeta P200	Gilson	FA10005M
Pipeta hombre	Fisher Scientific	FB14955202
Rata anti-ratón B220 PECF594 BD	Biosciences	562313
Rata anti-ratón CD11b APC-Cy7	BD Biosciences	557657
Rata anti-ratón CD19 AlexaFluor 700	BD Biosciences	557958
Rata anti-ratón CD19 PE	BD Biosciences	553786
Rata anti-ratón CD4 PECF594	BD Biosciences	562314
Rata anti-ratón CD45 FITC ThermoFisher		11-0451-82
Rata anti-ratón CD45 PE-Cy7	BD Biosciences	552848
Rata anti-ratón CD8 PECF594	BD Biosciences	562315
Rata anti-ratón Ly6C	BD Biosciences
Rata anti-ratón Ly6G PECF594	BD Biosciences	562700
Rata anti-ratón MHC II AlexaFluor 700	BioLegend	107622
Rata anti-ratón Siglec F PECF594	BD Biosciences	562757
Rata anti-ratón Tim4 AlexaFluor647	BD Biosciences	564178
Incubadora de agitación	Labnet	311DS
Tijeras de resorte	Fine Science Tools	15024-10
Colador de células estériles, malla de nailon de 40 mm	Fisher Scientific	22363547
Agua estéril, 500 ml	Gibco	A12873-01
Centrífuga de cubo oscilante	eppendorf	5910 R
Azul tripano, solución al 0,4%	Gibco	15250061