Artículo de método

Un gasoducto que utiliza la electroporación bilateral en Utero para interrogar influencias genéticas en el comportamiento de los roedores

DOI:

10.3791/61350

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21 de mayo de 2020

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1The Graduate Program for Neuroscience, Boston University, 2Department of Biology, Boston University, 3Neurophotonics Center, Boston University, 4Center for Systems Neuroscience, Boston University, 5Research and Early Development, Biogen, 6Department Pharmacology and Experimental Therapeutics, Boston University

En este artículo

Resumen

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El papel de los genes recientemente descubiertos asociados a la enfermedad en la patogénesis de los trastornos neuropsiquiátricos sigue siendo oscuro. Una técnica bilateral modificada de electroporación de útero permite la transferencia de genes en grandes poblaciones de neuronas y el examen de los efectos causales de los cambios de expresión génica en el comportamiento social.

Resumen

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A medida que estudios de asociación en todo el genoma arrojan luz sobre los fundamentos genéticos heterogéneos de muchas enfermedades neurológicas, aumenta la necesidad de estudiar la contribución de genes específicos al desarrollo cerebral y la función. Confiar en modelos de ratón para estudiar el papel de manipulaciones genéticas específicas no siempre es factible, ya que las líneas transgénicas de ratón son bastante costosas y muchos genes nuevos asociados a enfermedades aún no tienen líneas genéticas disponibles comercialmente. Además, puede tomar años de desarrollo y validación para crear una línea de ratón. En la electroporación del útero ofrece un método relativamente rápido y fácil de manipular la expresión génica de una manera específica de tipo celular in vivo que sólo requiere desarrollar un plásmido de ADN para lograr una manipulación genética particular. La electroporación bilateral en el útero se puede utilizar para dirigirse a grandes poblaciones de neuronas piramidales de corteza frontal. La combinación de este método de transferencia de genes con enfoques conductuales permite estudiar los efectos de las manipulaciones genéticas en función de las redes de corteza prefrontal y el comportamiento social de ratones juveniles y adultos.

Introducción

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Los estudios de asociación en todo el genoma (GWAS) han impulsado el descubrimiento de nuevos genes candidatos que están asociados con patologías cerebrales1,2,3,4. Estos estudios han sido particularmente beneficiosos para entender trastornos neuropsiquiátricos devastadores como la esquizofrenia (SCZ), donde la investigación de genes novedosos ha servido como punto de partida para nuevas líneas de investigación e intervención terapéutica5,6. Los genes que albergan el riesgo de SCZ mu....

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Protocolo

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Todos los protocolos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) para la investigación animal y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Boston.

1. Preparación de soluciones de ADN

  1. Comprar un plásmido comercial o subclone un gen de interés en plásmido con promotor deseado. Aquí se utilizó un plásmido que contiene EGFP bajo el promotor cag (pCAG-EGFP).
    NOTA: Determine el promotor deseado en función del nivel de expresión necesario. En general, los plásmidos bajo el promotor cag se pueden utilizar para lo....

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Resultados

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Desarrollo e implementación exitosos de un electroporador hecho a medida y tres electrodos de punta.
Para los UIE, se construyó un electroporador personalizado barato basado en un diseño descrito previamente27 (Figura 1A y Figura 2). Se hizo un electrodo de tres puntas23,24 utilizando fórceps de plástico con 2 electrodos negativos unidos a las puntas de las pun.......

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Discusión

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En este documento, se describe un oleoducto que combina la manipulación de nuevos genes de interés en grandes poblaciones de neuronas corticales frontales con ensayos conductuales en ratones. Además, esta canalización permite el estudio longitudinal del comportamiento en los mismos ratones tanto durante el desarrollo postnatal temprano como en la edad adulta. Esta técnica evita la necesidad de confiar en modelos genéticos animales que pueden ser costosos en términos de tiempo y gastos. La fuerza de este protocolo es que .......

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Divulgaciones

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Los autores no declaran intereses competidores.

Agradecimientos

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Agradecemos a Lisa Kretsge por comentarios críticos y edición del manuscrito. Agradecemos a todos los asistentes de investigación en el laboratorio Cruz-Martín que fueron invaluables en ayudar con perfusiones y recuento celular de cerebros conductuales. Agradecemos a Andrzej Cwetsch por su contribución en el diseño del electrodo tripolar, y a Todd Blute y al Núcleo de Imágenes de Biología de la Universidad de Boston por el uso del microscopio confocal. Este trabajo fue apoyado por una Beca de Investigación Joven NARSAD (AC-M, #27202), el Premio Brenton R. Lutz (ALC), el Premio I. Alden Macchi (ALC), la NSF NRT UtB: Neurophotonics National Research Fellowship (ALC, #DG....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sutura trenzada negra de seda de 13 mmPiel desuturaSB77D
Havel Pinzas AdsonF.S.T.11006-12IUE
C270 WebcamLogitechN/AComportamiento de registro
ElectroporadorPersonalizado/AConsulte las Figuras 1 y 2 y Bullmann et al, 2015
EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20prepsBio Basic Inc.BS466Preparación de Pladmid
Fast Green FCFSigmaF7252-5GTinte para solución de ADN
Tijeras finas- afiladasF.S.T.14060-09IUE
Fisherbrand Esponjas de gasaFisher Scientific1376152IUE
Gaymar Calefacción/RefrigeraciónBraintreeTP-700Almohadilla térmica
Extractor de pipetas de vidrioSutter Instrument,P-97IUE
Pipetas de vidrioSutterIUE
Loción DepilatoriaNairN/ADepilación
Hartman HemostatsF.S.T.13002-10IUE
Laberinto de campo abierto- arena acrílica casera Hechoa medidaN/A50 &veces; 50 &veces; 30 cm longitud-anchura-altura
pCAG-GFPAddgene11150Vector de expresión de mamíferos para la expresión de GFP
Picospritzer IIIParker HannifinN/Ainyector de presión
Retractor - 2 puntas romasF.S.T.17023-13Pinza de anillo IUE
F.S.T.11103-09Esterilizador IUE
, perlas secasSigmaZ378569esterilizar herramientas quirúrgicas
SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLETA SOLO PARA USO VETERINARIOMúsculo desuturaHJ398
Baño de aguaCole-ParmerEW-12105-84solución salina estéril de calentamiento
de N Instrument,BF150-117-10 de Havel

Referencias

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  1. Yang, Y., et al. Genetic association and meta-analysis of a schizophrenia GWAS variant rs10489202 in East Asian populations. Translational Psychiatry. 8 (1), 144(2018).
  2. Schizophrenia Working Group of the Psychiatric Genomics Consortium.

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