Un gasoducto que utiliza la electroporación bilateral en Utero para interrogar influencias genéticas en el comportamiento de los roedores

Resumen

El papel de los genes recientemente descubiertos asociados a la enfermedad en la patogénesis de los trastornos neuropsiquiátricos sigue siendo oscuro. Una técnica bilateral modificada de electroporación de útero permite la transferencia de genes en grandes poblaciones de neuronas y el examen de los efectos causales de los cambios de expresión génica en el comportamiento social.

Resumen

A medida que estudios de asociación en todo el genoma arrojan luz sobre los fundamentos genéticos heterogéneos de muchas enfermedades neurológicas, aumenta la necesidad de estudiar la contribución de genes específicos al desarrollo cerebral y la función. Confiar en modelos de ratón para estudiar el papel de manipulaciones genéticas específicas no siempre es factible, ya que las líneas transgénicas de ratón son bastante costosas y muchos genes nuevos asociados a enfermedades aún no tienen líneas genéticas disponibles comercialmente. Además, puede tomar años de desarrollo y validación para crear una línea de ratón. En la electroporación del útero ofrece un método relativamente rápido y fácil de manipular la expresión génica de una manera específica de tipo celular in vivo que sólo requiere desarrollar un plásmido de ADN para lograr una manipulación genética particular. La electroporación bilateral en el útero se puede utilizar para dirigirse a grandes poblaciones de neuronas piramidales de corteza frontal. La combinación de este método de transferencia de genes con enfoques conductuales permite estudiar los efectos de las manipulaciones genéticas en función de las redes de corteza prefrontal y el comportamiento social de ratones juveniles y adultos.

Introducción

Los estudios de asociación en todo el genoma (GWAS) han impulsado el descubrimiento de nuevos genes candidatos que están asociados con patologías cerebrales^1,2,3,4. Estos estudios han sido particularmente beneficiosos para entender trastornos neuropsiquiátricos devastadores como la esquizofrenia (SCZ), donde la investigación de genes novedosos ha servido como punto de partida para nuevas líneas de investigación e intervención terapéutica^5,6. Los genes que albergan el riesgo de SCZ muestran expresión sesgada en la corteza prefrontal (PFC) durante el desarrollo prenatal y postnatal temprano, una región implicada en la patología de varios trastornos neuropsiquiátricos^7. Además, los modelos de ratón de trastornos psiquiátricos presentan actividad anormal en las redes PFC^6,8,9. Estos resultados sugieren que los genes asociados a SZC podrían desempeñar un papel en el cableado del desarrollo de esta región. Se requiere una investigación adicional utilizando modelos animales para entender la contribución de estos genes candidatos al establecimiento de conexiones en el PFC y para determinar si estos genes tienen un papel causal en la patogénesis de los trastornos neuropsiquiátricos. Las técnicas de manipulación genética en ratones que permiten el estudio de cambios de expresión génica en circuitos neuronales específicos durante el desarrollo prenatal y posnatal temprano son un método prometedor para entender los mecanismos moleculares que vinculan los cambios de expresión génica con la disfunción de la PFC.

Las líneas genéticas de ratón ofrecen un método para estudiar el impacto de genes particulares en el desarrollo y la función cerebral. Sin embargo, confiar en ratones transgénicos puede ser limitador ya que no siempre hay líneas disponibles comercialmente para examinar los efectos de genes específicos en el desarrollo de circuitos neuronales. Además, puede ser extremadamente costoso y lento desarrollar líneas de ratón personalizadas. El uso de estrategias de manipulación genética interseccional que combinan ratones transgénicos con enfoques virales ha revolucionado la comprensión del cerebro^10,11,12. A pesar de muchos progresos, las estrategias virales vienen con ciertas limitaciones dependiendo del tipo de vector viral, incluyendo límites en la capacidad de envasado que pueden restringir la expresión viral¹³ y la toxicidad celular asociada con la expresión viral^14. Además, en la mayoría de las condiciones experimentales, la expresión génica robusta utilizando el virus asociado a adeno (AAVs) requiere aproximadamente 2 a 4 semanas^15,haciendo que las estrategias virales rutinarias sean inviables para manipular genes durante el desarrollo postnatal temprano.

En la electroporación del útero (IUE) es un enfoque alternativo que permite una transferencia de genes rápida y barata^16,17 que, cuando se combina con etiquetado fluorescente y enfoques farmacogenéticos u optogenéticos, proporciona una potente plataforma para diseccionar la función de los circuitos neuronales. Además, con el desarrollo de genes de edición del genoma CRISPR-Cas9 se pueden sobreexprimir o alterar con precisión a través de derribo específico de tipo celular o eliminación de genes específicos o a través de la modulación de promotores^18,19. Los enfoques de manipulación génica que utilizan IUE son especialmente ventajosos cuando el efecto de los genes en los circuitos neuronales debe probarse durante las estrechas ventanas de desarrollo^20. IUE es una técnica versátil y la sobreexpresión se puede lograr fácilmente insertando un gen en un vector de expresión bajo un promotor específico. El control adicional de la expresión génica puede lograrse impulsando la expresión utilizando promotores de diferentes fortalezas o utilizando promotores inducibles capaces de controlar temporalmente la expresión génica^21,22. Además, IUE permite la focalización de células dentro de capas corticales específicas, tipos de células y regiones cerebrales, que no siempre es factible utilizando otros enfoques^5,17. Los recientes avances en la configuración de la IUE basados en el uso de tres electrodos, que genera una distribución de campo eléctrico más eficiente, han ampliado el repertorio funcional de este método y han permitido a los científicos dirigirse a nuevos tipos de células y aumentar la eficiencia, precisión y número de células que pueden ser dirigidas^{a 23,24.} Esta técnica se utilizó recientemente para determinar el papel causal del componente complementario 4A (C4A), un gen vinculado a SCZ, en función PFC y cognición temprana⁵.

Aquí se presenta una canalización experimental que combina enfoques de transferencia de genes para dirigirse a grandes poblaciones de neuronas excitatorias en la corteza frontal, incluyendo el PFC, con paradigmas conductuales que no sólo permite el estudio de los cambios celulares y a nivel de circuito, sino que también permite monitorear el comportamiento a lo largo del desarrollo posnatal temprano y la edad adulta. El primero descrito es un método para transfectar bilateralmente grandes poblaciones de neuronas piramidales de capa (L) 2/3 en regiones corticales frontales. A continuación, se describen las tareas para asescribir el comportamiento social en ratones juveniles y adultos. Los recuentos de celdas se pueden obtener al finalizar las tareas de comportamiento para cuantificar la extensión y la ubicación de la transfección celular. Además, el número de células transfectadas se puede correlacionar con datos de comportamiento para determinar si un mayor número de células transfectadas conduce a mayores perturbaciones en el comportamiento.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) para la investigación animal y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Boston.

1. Preparación de soluciones de ADN

1. Comprar un plásmido comercial o subclone un gen de interés en plásmido con promotor deseado. Aquí se utilizó un plásmido que contiene EGFP bajo el promotor cag (pCAG-EGFP).
   NOTA: Determine el promotor deseado en función del nivel de expresión necesario. En general, los plásmidos bajo el promotor cag se pueden utilizar para lograr altos niveles del transgénero, mientras que los promotores específicos de tipo celular (por ejemplo, sinapsis para las neuronas) tienden a ser menos activos. El experimentador debe determinar empíricamente los niveles de expresión adecuados para cada plásmido.
2. Transforme las bacterias y haga crecer las poblaciones en medios bacterianos con el antibiótico adecuado.
   1. Retire las células competentes (células DH5α) de -80 °C y descongele el hielo durante 20 min.
   2. Mezclar 100 pg -100 ng del ADN plásmido con 30 μL de células competentes. Incubar la mezcla sobre hielo durante 20 min.
   3. Realice un choque térmico incubando en un baño de agua de 42 °C durante 45 s y luego devolviendo el tubo de vuelta al hielo durante 2 minutos.
   4. Añadir 200 - 1.000 μL de medios LB a las células competentes transformadas y crecer durante 45 minutos a 37 °C en una incubadora de temblores.
   5. Placa 200 μL de las células transformadas en una placa de agar LB que contiene el antibiótico adecuado e incubar la placa durante la noche a 37 °C.
   6. Al día siguiente, incuba una colonia bacteriana en 200 ml de caldo LB con el antibiótico apropiado a 37 °C en una incubadora temblorosa durante la noche.
3. Purifique el ADN plásmido con un kit maxiprep.
   1. Siga las instrucciones proporcionadas en el kit maxiprep obtenido. Para el paso de elución, no eleduja el ADN en el búfer de elución. En su lugar, el ADN elíptico utilizando 200 μL de agua estéril de 1x PBS o de grado molecular.
   2. Asegúrese de que la concentración final del ADN sea superior a 1 μg/μL. Si el plásmido que contiene el gen de interés no contiene un gen reportero, también prepare un plásmido para co-transfectar con una molécula reportera, como la proteína fluorescente verde (GFP), para permitir la visualización de células transfectadas.
4. Preparar la solución de ADN para la cirugía diluyendo el ADN plásmido en 1x PBS a 1 μg/μL concentración final de cada plásmido. Añadir tinte verde rápido a la solución de ADN a una concentración final del 0,1%. Para inyecciones bilaterales, preparar 60 μL de solución por presa (para aproximadamente 10 cachorros).
   NOTA: Si el plásmido no contiene un gen reportero, co-electroporate con GFP. Las tasas de co-electroporación suelen ser del 95% o más. En nuestras manos, la eficiencia de la transfección no se vio afectada por la co-transfección. Todos los plásmidos electroporados deben diluirse a 1 μg/μL.

2. Ordenar o criar ratones preñados embarazadas

1. Si ordena ratones preñados, ordene a los ratones que lleguen el día embrionario (E) 13 o antes para dar a las presas el tiempo adecuado para aclimatarse a la vivienda de los animales.  En este protocolo, los ratones de educación cd-1 se utilizan para todos los experimentos.
   NOTA: Ordenar con unos días de anticipación reducirá el estrés animal y conducirá a una mayor tasa de supervivencia de los cachorros.
2. Si cría ratones preñados, empareje ratones hembra con un macho durante la noche, una vez a la semana. Compruebe la presencia de un tapón vaginal a la mañana siguiente (E0.5). Determine el embarazo monitoreando el peso de los ratones hembra.
   NOTA: Diferentes cepas del ratón tienen diferentes aumentos de peso durante el embarazo, así que determina el aumento de peso típico para la cepa del ratón utilizada.
3. Ya sea ordenando o criando a los ratones, para reducir el estrés de las presas, coloque una almohadilla de anidación y una casa de ratones en la jaula. Reducir el estrés puede ayudar a aumentar la tasa de supervivencia de los cachorros.

3. Diseño y montaje de tres electrodos de punta

1. Utilice láminas de titanio de grado 2 con un espesor de 0,063 como material de stock para contactos de electrodos.
2. Utilizando técnicas de mecanizado estándar o herramientas manuales de precisión, fabrica electrodos con las siguientes dimensiones: 20 mm x 5 mm con punta redondeada y respaldo ranurado. Retire los bordes ásperos o las rebabas con papel de lija de grano fino.
3. Para conectar los contactos del electrodo, envuelva el cable de cobre trenzado de 22 G alrededor de las ranuras del electrodo y asegure mediante soldadura. Proteja esta articulación con tubos termorretráctiles.
4. A continuación, conecte el electrodo conectado a fórceps autoclavables y no conductores utilizando un tubo de reducción de calor adicional para hacer los dos electrodos negativos. Conecte el electrodo positivo único a un material autoclavable y no conductor (como un mango de cepillo de dientes con la cabeza recortada). Coloque el extremo abierto del cable con un tapón de plátano estándar.

4. Preparación para la cirugía

1. Lleve las presas embarazadas al área de cirugía al menos 30 minutos antes de la cirugía para permitir la reducción de los niveles de estrés después del transporte desde la instalación animal.
2. Esterilizar todo el sitio de cirugía usando toallitas germicidas esterilizantes y luego 70% etanol. Cambie los guantes antes de comenzar la cirugía.
3. Esterilizar las herramientas autoclavadas en un esterilizador de cuentas de vidrio.
4. Transfiera estéril 1x PBS (aproximadamente 50 ml por presa) a tubos cónicos de 50 ml y colóquelo en un bastidor de tubos en el baño de agua calentado a 38-40 °C. Compruebe la temperatura estéril salina con un termómetro.
5. Encienda la bomba de circulación de calefacción de agua para que se caliente a 37 °C antes del inicio de la cirugía. Esto mantendrá la temperatura corporal del ratón durante la cirugía.
6. Encienda el inyector de presión y el electroporador y asegúrese de que funcione correctamente antes de la cirugía.
7. Gire brevemente la solución de ADN plásmido (obtenida en el paso 1.4) en una centrífuga de mesa y colóquela sobre hielo.
8. Tire de pipetas de vidrio en un tirador de pipeta para que la punta de la pipeta de vidrio tirado es de aproximadamente 50 μm de diámetro.
9. Llene la pipeta con 20-40 μL de solución de ADN (obtenida en el paso 1.4).
10. Configure todos los elementos necesarios para la cirugía, incluyendo loción para la extracción de cabello, yodo, 70% etanol, intercambios de algodón, ungüento ocular, suturas, gasa, etc.
11. Prepare una hoja de cirugía y rellene la información necesaria, como la identificación y el peso del ratón, la fecha de la cirugía, el nombre del cirujano, etc.

5. En cirugía de electroporación de útero

1. Pesar el ratón antes de la cirugía y anotar esto en la hoja de cirugía.
2. Anestesiar a un ratón embarazada (E16) por inhalación en una cámara de inducción con una mezcla de oxígeno-isoflurano del 4% (v/v). Una vez inducido el ratón, pasar a una inhalación de máscara y mantener el isoflurano en 1-1,5% (v/v) y controlar la respiración durante toda la cirugía. Compruebe que el ratón está completamente anestesiado, la frecuencia de respiración debe ser ~55-65 respiraciones por minuto.
3. Administrar analgésicos preoperatorios: buprenorfina (3,25 mg/kg; SC) y meloxicam (1–5 mg/kg; SC) a un volumen máximo de 10-30 ml/kg.
4. Use crema para la depilación o use cuidadosamente una maquinilla de afeitar para extraer el pelaje del abdomen. Esterilizar el abdomen frotando con povidone-yodo y 70% etanol y repetir esto al menos 3 veces. Crea un campo estéril alrededor del abdomen usando una gasa estéril, también se pueden usar draping estériles.
5. Hacer una incisión en línea media (3-4 cm) en la piel abdominal, asegurándose de levantar la piel con fórceps para evitar cortar a través del músculo. A continuación, cortar a través del músculo, de nuevo teniendo cuidado de levantar el músculo para evitar el corte de órganos vitales.
6. Tire cuidadosamente de los cuernos uterinos de la presa usando fórceps de anillo y colóquelos suavemente en el campo estéril, asegurándose de que el cuerno uterino esté apoyado con relleno y no esté tirando demasiado lejos de la presa. A partir de este momento, mantenga el cuerno uterino humedecido durante el resto de la cirugía con el PBS estéril 1x precalentado.
7. Coloque un embrión con fórceps o dedos. Inserte cuidadosamente la pipeta de vidrio extraída en un ángulo de 45 grados con respecto al plano horizontal de la cabeza e insertada en el ventrículo lateral, que se puede identificar visualmente entre la línea media del cerebro y el ojo. Inyecte aproximadamente 2-3 μL en cada ventrículo lateral insertando la pipeta en uno y luego en el otro ventrículo (recomendado) o inyectando la solución de ADN en un ventrículo hasta que pase a ambos ventrículos laterales. El ventrículo ha sido atacado con éxito si una forma de media luna está presente después de la inyección.
   NOTA: La punta de la pipeta de vidrio podría romperse durante la cirugía. Si esto sucede, reemplace la pipeta de vidrio, asegurándose de que los cuernos uterinos se mantengan humedecidos mientras se prepara una nueva pipeta y se llena con la solución de ADN.
8. Para transfectar las células bilateralmente en la corteza frontal, coloque los dos electrodos negativos en los lados de la cabeza de los embriones justo lateral y ligeramente caudal a los ventrículos laterales y coloque el electrodo positivo entre los ojos, justo delante del hocico en desarrollo.
9. Asegúrese de que el embrión esté generosamente humedecido. Aplicar cuatro pulsos cuadrados (duración del pulso = duración de 50 ms, amplitud de pulso = 36 V, intervalo de interpulsión = 500 ms).
10. Inyectar y electroporar todos los embriones, yendo uno por uno para que cada embrión se electropore inmediatamente después de la inyección de la solución de ADN. Una vez que todos los embriones hayan sido electroporados, vuelva a insertar cuidadosamente los cuernos uterinos en la cavidad abdominal. Durante este paso, cubra la cavidad abdominal en PBS estéril (1x) para ayudar a la colocación de cuernos uterinos.
11. Llene la cavidad abdominal con PBS estéril de 1x para que no queden bolsas de aire después de que se complete el suturado. Sutura el músculo con suturas absorbibles y la piel con suturas no absorbibles de seda.
12. Permita que la presa se recupere por completo en una cámara calentada durante al menos 1 h. En las próximas 48 h, compruebe las presas regularmente. A medida que la presa se recupera de la anestesia y recupera la conciencia, comenzará a moverse y batir.
13. Administrar analgésicos postoperatorios si las presas están mostrando signos de dolor, como levantar sus cuerpos y respirar rápidamente. Sólo administrar si hay signos de dolor ya que las inyecciones de SC podrían estresar las presas, pero si se administran al grupo experimental también se administran al grupo de control, o viceversa.

6. Adiciones sobre el comportamiento social temprano en una tarea de interacción materna

NOTA: Este protocolo se adapta a las publicaciones anteriores^5,25. Realice esta tarea después de que los ratones hayan nacido del día posnatal (P) 18-21.

1. Comportamiento de perfeccionamiento materno en la tarea de interacción materna I (MI1).
   1. Asegúrese de que la ropa de cama enjaulada no se cambie en la semana anterior a la realición de la tarea.
   2. Obtenga o construya una arena de campo abierto (OF) que se pueda limpiar fácilmente (se recomienda acrílico) con las siguientes dimensiones: 50 x 50 x 30 cm (longitud-anchura-altura). Las condiciones de iluminación durante el rendimiento de los comportamientos pueden variar dependiendo de la pregunta experimental y pueden influir en los niveles de excitación y comportamiento similar a la ansiedad. Registre experimentos conductuales bajo una luz tenue (aproximadamente 20 lux) colocada sobre el centro de la arena.
   3. Durante dos días antes de las pruebas de comportamiento, aclimate la presa a la arena colocándola debajo de una taza de alambre de malla (como una taza de lápiz) en una esquina de la arena durante cinco minutos por día.
   4. El día de la prueba, que puede ser de P18-21, antes de que los ratones hayan sido destetados, limpie bien la arena con toallitas desinfectante y 70% etanol.
   5. Instala la arena con dos esquinas opuestas que contienen ropa de cama limpia y una esquina que contiene ropa de cama de nido sucia de la jaula de la casa del cachorro.
   6. Permita que cada cachorro explore la arena durante 3 minutos, colocando a cada cachorro en la esquina neutral y vacía al principio.
      NOTA: Graba el comportamiento con una cámara de vídeo a 30 fps. Limpie bien la arena entre cada cachorro y reemplace la ropa de cama fresca. Alterna qué esquina es la ropa de cama fresca versus nido como control para evitar la preferencia de la esquina debido a otras razones (es decir, ruido ambiental o luz). Si ejecuta varias camadas a través de la ventana de desarrollo P18-21, ejecute experimentos de comportamiento al mismo tiempo entre días. Asegúrese también de que durante un día determinado, los grupos de control y experimentales se ejecuten en paralelo.
2. Interacción social materna en la tarea de interacción materna II (MI2)
   1. Realice esta tarea inmediatamente después de la tarea MI1.
   2. Configure la arena para que una esquina contenga una taza de malla de alambre vacía y la esquina opuesta contenga la presa debajo de una taza de alambre de malla. Si los ratones son capaces de mover la taza, pesar la taza hacia abajo con un peso que se puede pegar a la parte superior de la taza para evitar el movimiento. Ponga ropa de cama de nido sucia desde la jaula de casa en otra esquina.
   3. Ejecute la tarea MI2. Coloca al cachorro en la esquina vacía y registra el comportamiento durante cinco minutos a 30 fps, permitiendo que el cachorro explore. Corre cada cachorro por separado y limpia bien toda la arena y las tazas de malla de alambre entre cada cachorro.

7. Ensayo de la tarea de comportamiento social de los adultos

1. Ejecute el comportamiento social de los adultos en los mismos ratones que se ejecutaron en la tarea MI1 y MI2 una vez que sean adultos (P60-P70 o más). Los datos recopilados aquí se realizaron en una cohorte separada.
2. Manipule los ratones adultos durante 3 días consecutivos para permitir la habituación al experimentador. Asegúrese de que solo los experimentadores que se han familiarizado con los ratones ejecuten experimentos de comportamiento, lo ideal es que la misma persona ejecute todas las tareas.
3. Habituar ratones a la arena OF durante 3 días durante 5 minutos cada día.
4. Asesta el comportamiento en una nueva tarea de reconocimiento de objetos para medir la locomoción general y el interés en un objeto novedoso. Esto permitirá una interpretación más significativa del comportamiento social si los ratones tienen un déficit específico en las interacciones sociales.
   1. Coloca ratones en la arena durante 5 minutos con un objeto novedoso (pequeño juguete de plástico con superficies lisas y limpiables) en una esquina de la arena. Limpie bien la arena entre ratones con un 70% de etanol.
   2. Para el reconocimiento de objetos novedosos, coloque el "objeto novedoso" expuesto anteriormente, que ahora es familiar, en una esquina y coloque un nuevo objeto novedoso en la esquina opuesta. Para todas las tareas, cambie las esquinas entre pruebas como control.
   3. Para una interacción social novedosa, asegúrese de que los ratones novedosos son de edad, tensión y sexo-emparejado y se aclimatan a la taza de alambre de malla durante 2 días consecutivos durante 5 minutos cada día. Para cada prueba, coloque un ratón novedoso debajo de una taza de alambre de malla y en la esquina opuesta coloque una taza de alambre de malla vacía. Deje que los ratones exploren la arena durante 5 minutos mientras graban el comportamiento. Limpie bien la arena y las tazas de alambre de malla entre cada ensayo.

8. Análisis de datos de comportamiento

1. Utilice DeepLabCut (https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut) para realizar el seguimiento básico de piezas del cuerpo). Las notas detalladas sobre cómo instalar y usar DeepLabCut se pueden encontrar en su página de GitHub. También está disponible una biblioteca personalizada basada en Python 'dlc_utils' (https://github.com/balajisriram/dlc_utils) para un análisis posterior de los datos una vez completado el seguimiento básico de las partes del cuerpo. Puede encontrar más detalles sobre cómo usar esta biblioteca en la página de GitHub.
   1. Instale DeepLabCut mediante el proceso de instalación de anaconda. Instale una versión compatible con GUI solo para CPU de DeepLabCut, así como la versión habilitada para GPU para entrenar la red.
   2. Siga las instrucciones disponibles en el siguiente enlace para crear un proyecto de seguimiento de partes del cuerpo. Breifly, elija una muestra de fotogramas de su conjunto de datos y marque manualmente las partes relevantes del cuerpo en estos marcos muestreados. Entrene la red DeepLabCut para predecir las partes del cuerpo y comprobar que la red entrenada funciona correctamente.
      https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut/blob/master/examples/Demo_yourowndata.ipynb
   3. Con el fin de rastrear la posición del cuerpo e identificar interacciones simples en un campo abierto, identificar el centroide del animal, la cabeza (definida operativamente como el punto medio entre las orejas), las orejas izquierda y derecha, así como el hocico y la base de la cola. Tener varias partes del cuerpo rastreadas permite la sustitución adecuada cuando faltan algunas partes del cuerpo en el marco debido a la oclusión.
   4. Además de las partes del cuerpo animal, realice un seguimiento de una variedad de puntos relacionados con el medio ambiente: como los bordes de las cajas de comportamiento. Estos permiten una estimación repetible de estos puntos en varias sesiones, incluso si la posición de la configuración del comportamiento cambia ligeramente en relación con la cámara entre sesiones.
   5. Después de realizar un seguimiento de las partes del cuerpo a partir de los datos de comportamiento, tiene cuidado de filtrar las ubicaciones de las partes del cuerpo predichas en función de la confianza asociada con la predicción en cada fotograma del vídeo. Las predicciones de baja confianza generalmente se asocian con partes del cuerpo ocluidas. Para tales predicciones, sustituya una parte del cuerpo determinada por otra (si dicha sustitución es apropiada) o utilice las ubicaciones de otras partes del cuerpo para predecir dónde es probable que esté la parte del cuerpo pertinente. Para la mayoría de las aplicaciones de campo abierto, el centroide del cuerpo de los roedores rara vez se ocluye y se puede predecir con alta precisión y precisión.
   6. Utilice la ubicación predicha del centroide, así como la ubicación de los puntos rastreados en el entorno para estimar una serie de características del comportamiento del animal. Por ejemplo, en los datos de campo abierto, el derivado del tiempo de la posición se puede utilizar para calcular la velocidad del animal.
2. Para evitar sesgos, realice todos los experimentos "ciegos" con respecto al grupo experimental cuando sea posible, especialmente cuando hay algún elemento subjetivo en la evaluación de los resultados. Prueba del efecto de las diferencias sexuales en los principales resultados experimentales mediante la agrupación de datos en grupos masculinos y femeninos. Todas las pruebas estadísticas están diseñadas para probar un número igual de animales entre grupos.

9. Recuento de células post hoc para caracterizar el alcance de la transfección celular

1. Determinar el número de células transfectadas por ratón ya que no todos los ratones tendrán transfección exitosa y habrá variación en el número de células transfectadas. Un método para lograr esto implica contar el número de neuronas transfectadas en secciones coronales alternas seguidas de una interpolación para estimar el número total de células transfectadas. Para ello, imagen y contar todas las demás secciones coronales (50 μm).
   1. Utilice perfusiones transcardiales con un 4% de PFA para reparar el tejido y luego diseccionar el cerebro. Después de la crioprotección, seccione el cerebro en secciones coronales a 50 μm.
   2. Para la corteza frontal, cuente las células dentro de +2.75 y + 1.35 mm de Bregma. Estas coordenadas contienen áreas corticales frontales e incluyen parte de la corteza somatosensorial (S1).  Utilizando este método, no se observaron células transfectadas en regiones corticales más caudales o áreas subcorticales.
   3. Asegúrese de denotar la izquierda desde el hemisferio derecho, como marcar un hemisferio con un agujero de aguja durante la sección, y contar las células bilateralmente. Utilice un software automatizado de recuento de celdas o cuente celdas manualmente, confirmando la presencia de un cuerpo celular utilizando DAPI.
2. Una vez obtenidos los recuentos de celdas, establezca un umbral para la inclusión. Por ejemplo, solo incluya ratones electroporados bilateralmente en el análisis. Para un análisis posterior, correlacione el número de células transfectadas con respuestas conductuales para ver si hay una asociación. Esta técnica se dirigirá a múltiples áreas cerebrales, por lo que es necesario proporcionar información sobre qué regiones cerebrales han sido manipuladas genéticamente.
   NOTA: Es posible que la manipulación de ciertos genes podría alterar la migración neuronal, especificación y/o muerte. Asegúrese durante el recuento celular de que la anatomía cerebral se examina y cada neurona transfectada está dentro de la capa que supuestamente fue transfectada (es decir, L2/3). Las mediciones anatómicas brutas, como el grosor cortical, también se pueden cuantificar midiendo la distancia desde la pia hasta la L6 cortical.

Resultados

Desarrollo e implementación exitosos de un electroporador hecho a medida y tres electrodos de punta.
Para los UIE, se construyó un electroporador personalizado barato basado en un diseño descrito previamente²⁷ (Figura 1A y Figura 2). Se hizo un electrodo de tres puntas^23,24 utilizando fórceps de plástico con 2 electrodos negativos unidos a las puntas de las pun...

Discusión

En este documento, se describe un oleoducto que combina la manipulación de nuevos genes de interés en grandes poblaciones de neuronas corticales frontales con ensayos conductuales en ratones. Además, esta canalización permite el estudio longitudinal del comportamiento en los mismos ratones tanto durante el desarrollo postnatal temprano como en la edad adulta. Esta técnica evita la necesidad de confiar en modelos genéticos animales que pueden ser costosos en términos de tiempo y gastos. La fuerza de este protocolo es que ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sutura trenzada negra de seda de 13 mm	Piel de	sutura	SB77D
Havel Pinzas Adson	F.S.T.	11006-12	IUE
C270 Webcam	Logitech	N/A	Comportamiento de registro
Electroporador	Personalizado	/A	Consulte las Figuras 1 y 2 y Bullmann et al, 2015
EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps	Bio Basic Inc.	BS466	Preparación de Pladmid
Fast Green FCF	Sigma	F7252-5G	Tinte para solución de ADN
Tijeras finas- afiladas	F.S.T.	14060-09	IUE
Fisherbrand Esponjas de gasa	Fisher Scientific	1376152	IUE
Gaymar Calefacción/Refrigeración	Braintree	TP-700	Almohadilla térmica
Extractor de pipetas de vidrio	Sutter Instrument,P-97		IUE
Pipetas de vidrio	Sutter		IUE
Loción Depilatoria	Nair	N/A	Depilación
Hartman Hemostats	F.S.T.	13002-10	IUE
Laberinto de campo abierto- arena acrílica casera Hecho	a medida	N/A	50 &veces; 50 &veces; 30 cm longitud-anchura-altura
pCAG-GFP	Addgene	11150	Vector de expresión de mamíferos para la expresión de GFP
Picospritzer III	Parker Hannifin	N/A	inyector de presión
Retractor - 2 puntas romas	F.S.T.	17023-13	Pinza de anillo IUE
	F.S.T.	11103-09	Esterilizador IUE
, perlas secas	Sigma	Z378569	esterilizar herramientas quirúrgicas
SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLETA SOLO PARA USO VETERINARIO	Músculo de	sutura	HJ398
Baño de agua	Cole-Parmer	EW-12105-84	solución salina estéril de calentamiento