Enfoque genético de células vivas para identificar y aislar mutantes del desarrollo en Chlamydia trachomatis

Resumen

Este protocolo utiliza promotor-reporteros fluorescentes, microscopía de células vivas y extracción de inclusión individual en un enfoque genético hacia adelante dirigido para identificar y aislar mutantes del desarrollo de Chlamydia trachomatis.

Resumen

El patógeno bacteriano intracelular Chlamydia trachomatis se somete a un ciclo de desarrollo que consiste en dos formas de desarrollo morfológicamente discretas. El cuerpo elemental no replicativo (EB) inicia la infección del huésped. Una vez dentro, la EB se diferencia en el cuerpo reticulado (RB). A continuación, el RB se somete a varias rondas de replicación, antes de diferenciarse de nuevo a la forma de EB infecciosa. Este ciclo es esencial para la supervivencia clamydial, ya que la falta de conmutación entre tipos de celdas impide la invasión del host o la replicación.

Las limitaciones en las técnicas genéticas debidas a la naturaleza intracelular obligatoria de la clamidia han obstaculizado la identificación de los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo de tipo celular. Diseñamos un novedoso sistema de plásmido de doble promotor-reportero que, junto con la microscopía de células vivas, permite la visualización del cambio de tipo celular en tiempo real. Para identificar los genes implicados en la regulación del desarrollo de tipo celular, el sistema promotor-reportero de células vivas se aprovechó para el desarrollo de un enfoque genético hacia adelante mediante la combinación de mutagénesis química de la cepa de reportero dual, imágenes y seguimiento de la clamidia con cinética alterada del desarrollo, seguido por el aislamiento clonal de mutantes. Este flujo de trabajo genético directo es una herramienta flexible que se puede modificar para el interrogatorio dirigido a una amplia gama de vías genéticas.

Introducción

Chlamydia trachomatis (Ctr) es un patógeno intracelular obligado que progresa a través de un ciclo de desarrollo bifásico que es esencial para su supervivencia y proliferación¹. Este ciclo consta de dos formas de desarrollo, el cuerpo elemental (EB) y el cuerpo reticulado (RB). El EB es incompetente de replicación, pero media la invasión celular a través de la endocitosis inducida por el efector². Una vez en el host, el EB madura al RB replicativo. El RB lleva a cabo múltiples rondas de replicación antes de convertir de nuevo al EB con el fin de iniciar rondas posteriores de infección.

La limitada gama de herramientas genéticas ha restringido la mayor parte de la investigación clamidia a estudios bioquímicos o el uso de sistemas sustitutos. Como consecuencia, el esclarecido de la regulación genética y el control del ciclo de desarrollo ha sido difícil^3,4. Uno de los desafíos más importantes en el campo del clamidia es el seguimiento temporal de alta resolución del ciclo de desarrollo clamidial y la identificación de las proteínas implicadas en su regulación. La expresión génica durante el ciclo de desarrollo clamidial se ha realizado tradicionalmente mediante métodos destructivos de "punto final", incluyendo RNAseq, qPCR y microscopía de células fijas^5,,6. Aunque estos métodos han proporcionado información invaluable, las técnicas empleadas son laboriosas y tienen baja resolución temporal^5,,6.

En la última década, la manipulación genética de Ctr ha progresado con la introducción de la transformación del plásmido y los métodos para la mutagénesis^7,8,9. Para este estudio, se desarrolló un sistema basado en plásmidos para monitorear el desarrollo de la clamidia en inclusiones individuales en tiempo real en el transcurso de una infección. Se creó un transformador de clamidia que expresaba un promotor-reportero específico de tipo célula RB y EB. El reportero específico de RB fue construido fusionando al promotor del gen RB temprano euo aguas arriba de la proteína fluorescente Clover. EUO es un regulador transcripcional que reprime un subconjunto de genes asociados a EB tardía¹⁰. El promotor de hctB,que codifica una proteína similar a la histona implicada en la condensación nucleoides EB, fue clonado directamente aguas arriba de mKate2 (RFP) para crear el reportero específico del EB¹¹. La columna vertebral de hctBprom-mKate2/euoprom-Clover fue p2TK2SW2⁷. Los promotores de hctB y euo se amplificaron a partir del ADN genómico Ctr-L2. Cada secuencia promotor consistía en 100 pares base aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción pronosticada para el gen clamidial especificado más los primeros 30 nucleótidos (10 aminoácidos) del ORF respectivo. Las variantes fluorescentes FP se obtuvieron comercialmente como bloques genéticos optimizados Ctr codón y se clonaron en fotograma con los primeros 30 nucleótidos de cada gen clamidol y promotor. El terminador incD fue clonado directamente aguas abajo de mKate2. El segundo promotor-reportero se insertó aguas abajo del terminador de incD. El gen de resistencia a la ampicilina (bla) en p2TK2SW2 fue reemplazado por el gen aadA (Resistencia a la espectinomicina) de pBam4. Esto dio lugar a la construcción final p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover (Figura 1A) que se transformó en Ctr-L2⁷. Esta cepa reportera de RB/EB permitió la observación del ciclo de desarrollo dentro de inclusiones individuales utilizando microscopía de células vivas (Figura 1B,C).

Empleando nuestra construcción promotor-reportero en combinación con la mutagénesis química, se ideó un protocolo para rastrear y aislar clones individuales que mostraban anomalías en el desarrollo de poblaciones mutadas de Ctr serovar L2. Este protocolo permite el monitoreo directo de inclusiones clamidiales individuales, el seguimiento de los perfiles de expresión génica a lo largo del tiempo, la identificación de clones clamiales que expresan un patrón alterado de expresión génica del desarrollo, y el aislamiento clonal de la clamidia a partir de inclusiones individuales.

Aunque este protocolo ha sido creado específicamente para la identificación de genes implicados en el desarrollo clamidial, podría adaptarse fácilmente para interrogar cualquier número de vías genéticas clamidiales.

Protocolo

Todos los scripts de Python utilizados en este protocolo están disponibles en Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing

1. Mulamydia del reportero mutagenize

NOTA: Ctr-L2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover EBs fueron mutados directamente utilizando metanoesulfonato etílico (EMS) en los medios esxenicos CIP-1 ya que este medio apoya el metabolismo EB y el mantenimiento de la infectividad EB¹².

1. Descongelar un caldo de clamidia sobre hielo que contenga 3 x 10⁷ EBs transformados con el p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover reportero plásmido y pellet a >14,000 x g durante 30 min a 4 oC.
   NOTA: Los organismos de clamidia utilizados para estos experimentos fueron purificados y congelados al 30% de densidad de renografin purificados y congelados a -80 oC en 1x tampón de sacarosa-fosfato-glutamato (SPG).
2. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet EB en 100 ml de tampón CIP-1 con sonicación sobre hielo a una potencia del 10% durante 10 s. Divida las 100 l de suspensión de EB en dos alícuotas de 50 ml para muestras mutagenizadas y simuladas tratadas.
3. Preparar 20 mg/ml de solución EMS-CIP-1 en un tubo de microcentrífuga separado de 1,5 ml. Para ello, añada 6,8 l de EMS en un volumen total de 375 l.
4. Añadir 50 l de la solución EMS-CIP-1 en una de las alícuotas clamiales para mutagénesis y 50 l de CIP-1 sólo a la otra alícuota clamidial para mutagénesis simulada.
   NOTA: La concentración final de EMS es de 10 mg/ml. El título clamidol, la concentración de SME y el tiempo de exposición utilizado en este protocolo conducen a una reducción de aproximadamente 60-80% en la progenie infecciosa. Este nivel de reducción corresponde a lesiones de ADN de 5-20 euros por genoma clamidial⁸.
5. Incubar durante 20 min a temperatura ambiente. Los EB mutados se utilizarán directamente para infectar monocapas en la sección 2.
   ADVERTENCIA: EL SME es un carcinógeno conocido. Todos los equipos y materiales que entren en contacto con EMS deben estar empapados en 1 M NaOH durante 24 horas antes de su eliminación, los guantes deben utilizarse en todo momento durante el protocolo y la limpieza de los materiales de EMS.

2. Imágenes del mutante Ctr

1. Cultivo celular anfitrión para la toma de imágenes y el aislamiento de Ctr mutagenizado
   1. Semilla de una placa inferior de vidrio de 6 pozos con 6 x 10⁵ células Cos-7 (ATCC) por pozo en 2 ml de medios completos (RPMI-1640 complementado con 10% de suero bovino fetal y 10 mg/ml de gentamicina). Utilice esta placa inferior de vidrio para obtener imágenes de Ctr mutagenizado.
   2. Semilla una placa de poliestireno de 24 pocillos con 1 x 10⁵ células Cos-7 (ATCC) por pozo en medios completos de 1 ml. Utilice esta placa de poliestireno para la reinfección de clamidia aislada de interés.
   3. Incubar ambas placas a 5% de CO₂, 37oC durante aproximadamente 18 h. Una vez que las células alcancen la confluencia, reemplace los medios con medios completos complementados con 1 g/ml de cicloheximida e incubar durante la noche.
2. Infectar el cultivo de la célula huésped con Ctr mutagenizado
   1. Infectar 5 pozos de la placa inferior de vidrio con 6 x 10⁵ de EBs mutagenizados en 1,5 ml/pozo de hielo frío HBSS. Esto dará lugar a que el MINISTERIO de Salud de 0,3, ya que se espera una tasa de mortalidad del 70 % debido a la mutagénesis.
   2. Infectar el pozo restante con 2 x 10⁵ EBs mutagenizados simulados en 1,5 ml/bien hielo frío HBSS. Sin mutagénesis, esperar menos mortalidad, por lo tanto, un tercio del inóculo se utiliza para alcanzar el MOI de 0,3 euros.
      NOTA: El MOI de 0,3 se asegura de que las células huésped estén infectadas por una sola EB y permite la separación suficiente entre las células infectadas para el aislamiento clonal.
   3. Incubar la placa durante 15 min, con balanceo, a 37oC.
   4. Lavar las células huésped infectadas con HBSS precalificado (37 oC) que contiene 1 mg/ml de heparina seguido inmediatamente de un enjuague con HBSS. Repita el lavado de heparina, enjuagando inmediatamente 2x con HBSS para asegurarse de que se elimina la heparina.
      NOTA: La heparina inhibe y puede revertir las interacciones electrostáticas tempranas entre la célula huésped y los HBS¹³. Los lavados de heparina eliminan los EB que aún no han ingresado en las células huésped, sincronizando la infección. Al lavar las células, hacerlo suavemente para evitar que se des partidar las células de la superficie de los pozos. Las soluciones de HBSS y heparina contienen EMS residual y deben colocarse en un vaso de precipitados que contenga 1 M de NaOH durante 24 horas antes de su eliminación.
   5. Sustituya el HBSS por 4 ml/pozo de material de imagen precalificado (37 oC) (medios completos, cicloheximida de 1 g/ml, HEPES de 20 mM y sin rojo fenol).
   6. Llenar los espacios entre pozos con precalentado (37 oC) desionizado H₂O para ayudar en el control de la temperatura y reducir la evaporación. Incubar la placa a 37oC con 5% de_CO2 durante 10 h.
3. Configuración del microscopio e imágenes
   NOTA: La multiposición multicolor automatizada de imágenes fluorescentes de células vivas se utiliza para recopilar imágenes de lapso de tiempo para identificar mutantes clamidiales que difieren en la dinámica de expresión génica del desarrollo. Este protocolo utiliza el paquete de software de código abierto de la tecnología para el control automatizado del microscopio¹⁴.
   1. Comience la configuración del microscopio 10 h después de la infección. Establezca la incubadora de la etapa del microscopio en 5% de CO_2,37 oC. Coloque la placa inferior de vidrio de 6 pozos infectada en la incubadora del escenario e inserte el termistor de muestra en el interpozo H₂O.
   2. Calibre la etapa XY con el plugin High Content Screening (HCS). Haga clic en Plugins (Plugins) Herramientas de Adquisición ( Acquisition Tools) Generador de sitios HCS en el software de control de microscopios(JoVE61365_screenfile1, JoVE61365_screenfile2).
   3. Seleccione la plantilla de placa de 6 pozos y genere una lista de posiciones de imagen que consta de 12 campos de visión (FOV) por pozo dentro del plugin HCS (JoVE61365_screenfile3, JoVE61365_screenfile4). Abra la Lista de posiciones del escenario y enfoque manualmente y establezca la posición Z inicial para cada FOV utilizando el plugin Stage Control (JoVE61365_screenfile5, JoVE61365_screenfile6). Ajuste las coordenadas XY de cualquier FOV que tenga celdas que falten o que no contengan una monocapa uniforme.
      NOTA: Debido al tiempo que tarda cada imagen en ser capturada, se puede tomar un número máximo de 72 FOV por intervalo de 30 min.
   4. Utilice una lente objetivo 20x para la toma de imágenes. Esta ampliación permite que se imaginen 8 inclusiones por FOV, al tiempo que proporciona la resolución deseada.
   5. Guarde la lista de posiciones, ya que se utilizará para localizar las inclusiones de interés después del análisis de datos (JoVE61365_screenfile7).
   6. Utilice la opción Enfoque automático en el software de imágenes para establecer el enfoque de las imágenes automatizadas(JoVE61365_screenfile8).
   7. Utilice las siguientes selecciones y valores para producir los resultados de enfoque más coherentes mediante el enfoque automático basado en imágenes en el sistema de selección. En la ventana Propiedades de enfoque automático, seleccione OughtaFocus en el menú desplegable y utilice la siguiente configuración. OughtaFocus-SearchRange_m: 350, OughtaFocus-Tolerance_m: 0.5, OughtaFocusCropFactor: 0.3, OughtaFocus-Exposure: 20, OughtaFocus-FFTLowerCutoff(%): 2.5, OughtaFocus-FFTUpperCutoff(%): 14, OughtaFocus-ShowImages: Yes, OughtaFocus-Maximize: SharpEdges, Oughta-Channel.: DIC.
      NOTA: La reducción de la ventana de imágenes de enfoque automático al disminuir el factor de recorte permite un enfoque automático más coherente. Si selecciona Sí para OughtaFocus-ShowImages, el usuario puede ver la imagen de enfoque automático.
   8. Capturar la cinética del ciclo de desarrollo por imágenes durante 24 h con intervalos de tiempo de 30 min (JoVE61365_screenfile9). La creación de imágenes entre 12-36 HPI garantiza que la clamidia complete el ciclo de desarrollo, pero no anule la célula huésped.
   9. Imagen de las monocapas celulares con una exposición de 250 ms a una intensidad del 4% y del 18% en los canales GFP y RFP, respectivamente (JoVE61365_screenfile10). Detecte la señal Clover (GFP) excitando a 470 nm con un filtro de emisiones de paso de banda de 514/30 nm. Detecte la señal mKate2 (RFP) excitando a 595 nm y con un filtro de emisiones de paso de banda de 641/75 nm.
      NOTA: Minimizar la intensidad de excitación es fundamental para minimizar el fotoblanqueo de fluoróforo y la fototoxicidad a la clamidia. La intensidad mínima de excitación para generar una imagen resuelta con una exposición de 200-300 ms debe determinarse empíricamente en estudios piloto.
   10. Capture varios sectores Z con un rango de enfoque que termina a ambos lados del sector en foco. En este experimento, con un aumento de 20x, esto se logró con 4 rebanadas a pasos de 10 m(JoVE61365_screenfile11).
   11. Seleccione Z relativa para obtener imágenes de varios sectores en la ventana de adquisición. La opción Z relativa utiliza la ubicación del plano Z guardada en la lista de posiciones de imagen como punto de partida para el siguiente intervalo de tiempo. Introduzca los valores de desfase Z adecuados para los canales de imagen de fluorescencia (JoVE61365_screenfile12).
       NOTA: El sistema de enfoque basado en imágenes es imperfecto y durante un período de imagen de 24 h esto conduce a la deriva de enfoque. Se encontró que al capturar planos focales de 3-4 Z para cada punto de tiempo se mantuvo una imagen enfocada. El desplazamiento Z es necesario para corregir las diferencias en los planos focales entre los canales de imagen fluorescentes y el canal DIC. Se necesitará una determinación empírica de este desplazamiento Z.
   12. Guarde las imágenes seleccionando el directorio raíz y nombrando el experimento. Utilice la opción de archivo de pila de imágenes del SManager para guardar imágenes como archivos de pila tiff(JoVE61365_screenfile13).
   13. Registre los detalles experimentales en el cuadro Comentarios de adquisiciones de la ventana Adquisición multiD (JoVE61365_screenfile13). es decir, Bueno A1: Control sin tratar. Bueno A2-3 y B1-3: EMS Mutants. Imágenes: 12-36HPI. Inicie la adquisición de imágenes a 12 HPI.
       NOTA: Si utiliza el sistema de control de la función , deje el programa, la configuración experimental y el hardware del microscopio ejecutándose una vez completado el experimento. Los sitios de imágenes se revisarán para el aislamiento de inclusión una vez que se haya completado el análisis de la población mutagenizada.

3. Identificar y aislar la clamidia mutagenizada con fenotipos alterados del desarrollo

1. Creación de una pila de imágenes enfocada
   1. Extraiga la imagen más enfocada de las pilas Z utilizando los datos de imagen guardados que contienen 4 sectores Z por punto de tiempo. Utilice la opción de medición de la curtosis(Analizar ) Medir) en ImageJ/FIJI para identificar automáticamente el sector Z más enfocado (puntuación de kurtosis más alta) y crear una nueva pila de imágenes con solo estas imágenes enfocadas. Una secuencia de comandos de Python se incluye como un archivo adicional (Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py) para automatizar este proceso.
2. Cuantificar la expresión de fluorescencia en inclusiones individuales
   NOTA: Para cuantificar la expresión cinética de los dos reporteros, utilice la aplicación de análisis de imágenes de código abierto ImageJ/FIJI y el plugin Trackmate¹⁵. Trackmate identifica los "puntos" (correspondientes a las inclusiones en este caso) y los sigue a través de una pila de imágenes de lapso de tiempo que registra la ubicación X,Y y la intensidad de la señal para cada inclusión a lo largo del tiempo (JoVE61365_screenfile14). Esta información se guarda como un archivo CSV y se importará en un bloc de notas de Python personalizado para su análisis.
   1. Abra la pila de imágenes reducidas en Z en ImageJ/FIJI con el Importador de biote formatos haciendo clic en Plugins (Plugins) Bio-Formatos (Bio-Formats) Bio-formatos Importador. Seleccione Hyperstack y Compuesto (JoVE61365_screenfile15, JoVE61365_screenfile16).
   2. Restar el fondo de la imagen haciendo clic en Procesar . Restar fondo usando un radio de bola rodante de 50,0 píxeles y mejorar el contraste de la imagen al 0,3% para los píxeles saturados(Proceso ? Mejorar el contraste). Multiplique los valores de la imagen por 10.0( Proceso ? Matemáticas ? Multiplicar) (JoVE61365_screenfile17 - JoVE61365_screenfile22).
   3. En Trackmate (Plugins ? Seguimiento de la estación de seguimiento ( Trackmate), seleccione un diámetro de blob estimado de 48 píxeles (determinado empíricamente en función del tamaño de la inclusión al final de la imagen). Produzca pistas de inclusión no fragmentadas seleccionando una distancia máxima de enlace y una distancia máxima de cierre de hueco de 8,0 píxeles y un espacio máximo de fotogramas de cierre de brecha de 1(JoVE61365_screenfile23 - JoVE61365_screenfile25).
      NOTA: Para mejorar la capacidad de Trackmate para identificar y realizar un seguimiento de las inclusiones a lo largo de todo el ciclo, se crea un canal de imagen independiente añadiendo los canales de graduación euoprom y hctButilizando la función de matemáticas de imagen en ImageJ/FIJI. Trackmate utiliza este canal para identificar y seguir inclusiones a lo largo del tiempo. Los valores fluorescentes de los canales euoprom y hctBse registran en los canales 2 y 3.
   4. Grabar pistas que cumplen una duración mínima continua: Duración de la pista: 20 (JoVE61365_screenfile26). Analice las pistas y guarde los spots en las estadísticas de pista como un archivo CSV(JoVE61365_screenfile27).
      NOTA: Este proceso se ha automatizado utilizando una secuencia de comandos de Python personalizada que se proporciona en los datos suplementarios (TrackMate_Zreduced_JOVE.py).
3. Identificar pistas de inclusión con perfiles de desarrollo alterados
   NOTA: Identificar inclusiones que contengan Chlamydia con perfiles de desarrollo alterados, cada pista de inclusión se visualizó utilizando el cuaderno de Python. Estas visualizaciones permiten la identificación de inclusiones con perfiles de expresión génica cinética que diferían de la población tratada por simulación. El cuaderno Python utilizado para la identificación de inclusiones con programación de desarrollo alterada se proporciona en los datos suplementarios (EMS_Screen-Markdown).
   1. Importe los datos de seguimiento de inclusión de los archivos CSV de Estadísticas de pistas en el marco de datos Pandas mediante la celda Importar en el bloc de notas de Python EMS_Screen-Markdown.
   2. La línea base corrige cada pista restando el valor mínimo de cada pista del resto de los valores de pista utilizando las celdas de resta de línea base. Guarde los valores resultantes como un archivo de pepinillo mediante la celda Guardar como pepinillo. Esto guardará permanentemente los valores de canal después de la resta de línea base para su posterior recuperación.
      NOTA: La resta de línea base establece la intensidad fluorescente inicial de cada inclusión en cero.
   3. Elimine los rastros de las inclusiones cerca de los bordes del FOV utilizando la celda Bordes de filtro, ya que es posible que sus perfiles fluorescentes no se capturen completamente; estos rastros pueden producir perfiles de desarrollo falsos positivos.
   4. Calibre los valores de fotograma (totalFrames) de los sectores de imagen a los valores de tiempo (startTime, interval) con la celda Calibration Time-lapse utilizando la hora de inicio experimental y el intervalo de tiempo de imagen. Excluya las lecturas de inclusión parcial filtrando los seguimientos que no se extienden durante las últimas 20 horas del experimento (16-36 HPI) mediante la celda Filtro de duración de pista.
   5. Separe las pistas en marcos de datos individuales por condición experimental con la celda Asignar tratamiento. Filtrar para inclusiones que exhiben suficiente crecimiento utilizando la celda Filtro para crecimiento. En la celda Filtro para crecimiento, establezca empíricamente el umbral de intensidad de fluorescencia para el canal de graduación de euocambiando los valores dentro de las dos últimas líneas de código. Esto filtrará la clamidia que no creció.
      NOTA: Tenga cuidado al establecer filtros de umbral, si el filtro es demasiado bajo, las gráficas de dispersión resultantes serán ruidosas, sin embargo, si el filtrado se establece demasiado alto mutantes importantes pueden ser eliminados.
   6. Calcular el porcentaje de mortalidad causada por el SME dividiendo el número de pistas mutagenizadas/bien por el número de pistas/pozos tratados con simulacros. Multiplique el número de pistas tratadas por simulacros por el factor de dilución inicial de 3 para calcular el número de pistas/pozos tratados con simulacros. Utilice las celdas Count Inclusion Tracks y Calculate Percent Mortality para realizar esta tarea.
   7. Calcule el tiempo hasta la expresión semes máxima para los reporteros tempranos y tardíos para cada pista mediante la celda Calcular. Estos valores se utilizarán para comparar poblaciones mutagenizadas y simuladas para identificar mutantes del desarrollo.
   8. Dentro de la celda Half-Max Plot utiliza el paquete de trazado bokeh para visualizar el tiempo a la expresión de medio máximo de cada promotor, graficando el tiempo de graduación de euoa la expresión medio máxima contra la del baile de graduación de hctB. Identifique las inclusiones de la población mutante que se encuentran fuera de la nube de dispersión tratada con simulacros utilizando el explorador de ID de pista interactiva bokeh. Tome nota de las coordenadas FOV y XY de las inclusiones de interés (Figura 2).
      NOTA: Elija las inclusiones candidatas que visualmente estén fuera de la nube de control, ya que la verificación y la evaluación estadística de cada clon se realizarán posteriormente.
   9. Dentro de la celda Trazado animado visualizar los cambios en la cinética de la expresión promotor dinámicamente a través del tiempo mediante la gráfica de las intensidades de expresión de euoprom contra hctBprom utilizando la herramienta de trazado Plotly¹⁶. La función scatter de Plotly se utiliza para animar la expresión génica a lo largo del tiempo (Video 1).
   10. Visualice una instantánea del gráfico animado De parcela en la celda Localizador de inclusión, trazando la expresión de prom de euoy hctBen un punto de tiempo específico (es decir, 28 HPI) utilizando el paquete bokeh (Figura 3). Identifique las inclusiones de la población mutante como se describe en el paso 3.3.8.
       NOTA: Este análisis debe realizarse rápidamente (<4 h) ya que las inclusiones todavía se están expandiendo y comenzarán a anegsar las células huésped 48 h después de la infección.
4. Aislar a los mutantes del desarrollo de inclusiones de interés
   NOTA: Para aislar la clamidia de las inclusiones que se determinó que mostraban una regulación genética alterada, se empleó un micromaniprógrafo con agujas capilares. Las coordenadas Well ID, FOV y X,Y de las inclusiones de interés se determinaron utilizando la visualización de datos en la sección 3.3.
   1. Preparar agujas capilares sosteniendo el centro del tubo capilar en una llama y tirando de ambos extremos del tubo capilar hasta que se haya separado. Cree una abertura en la aguja capilar tirada rompiendo la punta tirada en un portaobjetos del microscopio. Para romper la aguja, coloque la punta cerrada en la porción esmerilada del portaobjetos del microscopio en un ángulo y aplique presión.
      NOTA: Las especificaciones del tubo capilar fueron de 1,0 mm D.O., 0,5 mm de identificación.
   2. Compruebe que la abertura de la aguja es aproximadamente del tamaño de una inclusión bajo un microscopio, objetivo 20x.
   3. Prepull 25-30 agujas capilares para el aislamiento de las inclusiones candidatas (una aguja por inclusión).
   4. Llene el microinyector con aceite mineral asegurándose de que no haya burbujas de aire presentes.
   5. Fije una aguja capilar de vidrio al microinyector y expulse aceite a la punta de la aguja, exciendo cualquier burbuja de aire. Coloque la aguja capilar en medios completos y dibuje los medios hasta la mitad. Llenar la aguja capilar con medios evita la contaminación del aceite en el pozo.
   6. Usando la lista de posiciones guardadas en el sManager del paso 2.3.5, migre al pozo y AL FOV de una inclusión de interés identificada en el cuaderno de visualización de Python.
   7. Utilice el joystick del micromaniprógrafo para localizar la aguja capilar en las coordenadas XY de la inclusión de interés.
   8. Utilice el canal de excitación de 595 nm para visualizar los EB para la extracción y el canal de luz blanca fase/DIC para la visualización de agujas. Maniobrar la aguja capilar a la inclusión, romper la inclusión y luego dibujar los EBs en la aguja capilar utilizando el microinyector.
   9. Expulsar los EBs de la aguja capilar en un solo pozo de la placa de poliestireno de 24 pocillos preparada preparada en el paso 2.1.2. Retire la aguja capilar y sustitúyala con una aguja capilar fresca para la siguiente extracción de inclusión. Repita la sección 3.4 para todas las inclusiones de candidatos.
      NOTA: Para la expansión y para asegurar un título lo suficientemente alto como para la re-imagen, incubar aislados mutantes en una incubadora de 5% co_2,37 oC hasta que la mayoría de las células huésped estén infectadas (1 semana). Los pozos deben ser monitoreados de cerca, ya que diferentes aislados pueden presentar diferentes tasas de crecimiento.
5. Cosecha de aislados mutantes
   1. En hielo, interrumpa la monocapa infectada raspando con una punta de micropipeta de 1 ml. Transfiera los medios, los desechos celulares y la clamidia liberada en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   2. Chuladia de pellets por centrifugación durante 30 min a 4oC, >14.000 x g. Retire el sobrenadante y el pellet resuspendido en 75 ml de hielo frío 1x AAP. Aliquot en tres tubos de microcentrífuga de tapa de tornillo de 1,5 ml. Conservar a -80oC.

4. Verificación de fenotipos de aislamiento mutado

1. Cultivo de células anfitrionas para diagnósticos por imágenes de aislados mutagenizados
   1. Semilla una placa inferior de vidrio de 96 pozos con 1,6 x 10⁴ células Cos-7 (ATCC) por pozo en 100 ml de medios completos. Incubar a 5% CO₂, 37oC. Las células deben alcanzar la confluencia en aproximadamente 24 h. Después de que las células sean confluentes, reemplace los medios con medios completos complementados con cicloheximida de 1 g/ml, incubar durante la noche.
2. Infectar células con aislados candidatos para la verificación fenotípica
   1. Descongelar clones mutantes y clamidia de tipo salvaje sobre hielo.
   2. En la placa de 96 pozos preparada, realice una dilución serial doble de aislados mutantes, utilizando una columna por aislado (11 columnas). Comience con una dilución inicial de 1:20 en 100 l de HBSS.
      NOTA: La dilución en serie de clamidia se realiza para garantizar que las muestras mutantes se muestren en un MOI < 1.
   3. Infectar la columna restante (12o) con el tipo de comodín Chlamydia en MOI 0,5.
      NOTA: El tipo de jabacia chlamydia se utiliza como control para la comparación contra aislados mutagenizados.
   4. Incubar durante 15 min meciéndose a 37oC.
   5. Lavar las células huésped infectadas con HBSS precalificado (37 oC) con 1 mg/ml de heparina y HBSS según se especifica en la sección 2.2.
   6. Reemplazar con 200 l por poctil de material de imagen precalificado (37 oC).
   7. Llene los espacios entre pozos con H₂O precalificado (37 oC).
   8. Incubar a 5% de CO₂, 37oC durante 10 h.
3. Configuración del microscopio
   NOTA: Consulte la sección 2.3 para la configuración del microscopio, esta sección solo contendrá las modificaciones de configuración necesarias.
   1. Seleccione la plantilla de placa de 96 pozos del plugin HCS.
   2. Empíricamente determinan los pozos correspondientes a un MOI < 1 para cada aislado mutante. La expresión de trébol bajo control del promotor de euo es observable a 10 HPI haciendo posible la visualización temprana de las inclusiones (Figura 1B).
   3. Seleccione tres pozos por aislado mutante que correspondan a un MOI < 1 y genere una lista de posición de imagen que consta de dos FOV por pozo.
      NOTA: Solo se pueden tomar 72 imágenes por intervalo de tiempo debido a restricciones de hardware, esto equivale a tres diluciones (pozos) por cepa utilizando dos sitios de imágenes por pozo si se toman imágenes de 12 muestras.
   4. Registre el ciclo de desarrollo de cada aislado mutante durante 36 h a intervalos de tiempo de 30 minutos a partir de 12 HPI.
   5. Registre los detalles experimentales en el cuadro Comentarios de adquisiciones. es decir, Bueno ABC1: control de tipos salvajes. Bueno ABC2: Cepa mutante 1, ABC3: Cepa mutante 2, etc... Imágenes: 12-48 HPI.
   6. Inicie la adquisición de imágenes a 12 HPI.

5. Análisis de datos para la verificación de aislados

1. Cree pilas de imágenes enfocadas y cuantifique la expresión de fluorescencia en inclusiones individuales
   1. Generar trazas de intensidad fluorescente para cada inclusión como se especifica en la sección 3.1 - 3.2.
2. Verificar los aislados mutagenizados de Ctr
   NOTA: Para verificar los perfiles de desarrollo alterados de los aislados mutantes, sus perfiles de expresión se comparan con el perfil de expresión de tipo comodín mediante el bloc de notas de Python. El cuaderno de Python utilizado para la verificación de clones mutantes con programación de desarrollo alterada se proporciona en los datos suplementarios (clone_check-Markdown).
   1. Importe y filtre los datos de seguimiento de inclusión en el bloc de notas de Python clone_check-Markdown como se hace en la sección 3.3.
   2. Calcule la media y la desviación estándar (ETS) de las trazas de cada población de control de aislamiento y tipo de comodín utilizando la celda Calcular media y ETS.
   3. Con la gráfica de celda Graph Iso vs WT, el error medio y estándar de la media (SEM) de cada clon mutante contra el control de tipo salvaje para determinar si la cinética de expresión mutante es divergente de la muestra de tipo salvaje (Figura 4).
   4. Determinar si la población mutante aislada es clonal trazando los rastros mutantes y comparándolos con trazas de inclusión de tipo salvaje utilizando una gráfica de dispersión como se hace en la sección 3.3 (pasos 3.3.7-3.3.10) (Figura 2, Figura 3). Si el aislado es una población mixta, la parcela mostrará una población superpuesta con tipo salvaje y una segunda población distinta fuera de la nube de dispersión de tipo salvaje. Si la población se ve mixta, el mutante puede volver a aislarse utilizando el procedimiento original descrito en la sección 3.4.
      NOTA: Para determinar si el perfil de desarrollo de un aislado es estadísticamente diferente del tipo comodín, las curvas de cada aislado deben compararse con el tipo comodín utilizando ANOVA.

Resultados

La mutagénesis directa del SME de nuestra cepa clamidia promotor-reportero dio lugar a una reducción del 75% en la infectividad. Usando el protocolo de imágenes de células en vivo descrito, se tomaron imágenes de 600 inclusiones y se realizaron un seguimiento durante un período de 24 horas. La cinética de expresión fluorescente de ambos reporteros en cada inclusión se visualizó mediante scripts de bloc de notas de Python personalizados. Se implementaron dos enfoques de visualización para identificar la clamidia ...

Discusión

La disección de los mecanismos que controlan el ciclo de desarrollo de la clamidia se ha visto obstaculizada por las limitaciones de las herramientas genéticas actualmente disponibles. Empleando a nuestro promotor-reportero Chlamydia en conjunto con la microscopía automatizada de células vivas, se construyó un sistema que permite monitorear el desarrollo de tipo celular en inclusiones individuales durante un período de 24 horas. Este sistema, en combinación con la mutagénesis química y el aislamiento de inclusió...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de poliestireno de 24 pocillos	Corning	3524	Crecimiento de cultivos celulares para la reinfección de aislados Placas con fondo de vidrio de
6 pocillos	Cellvis	P06-1.5H-N	Crecimiento de cultivos celulares para la obtención
de imágenes Placas con fondo de vidrio de 96 pocillos	Nunc	165305	Crecimiento de cultivos celulares para la obtención de imágenes
Unidad de CO2	de línea audaz Unidad de CO2 de OKO Labs	UNIDAD de CO2 BL	Incubadora de etapa Control de CO2
Línea en negrita Unidad	T OKO Labs	H301-T-UNIT-BL-PLUS	Control de temperatura de la incubadora
etapa Tubos capilares de vidrio de borosilicato	Sutter Instrument	B1005010	Tubos capilares Filtro de emisiones de
paso de banda BrightLine (514/30nm)	Semrock	FF01-514/30-25	Cubo de filtro fluoescente
Filtro de emisiones de paso de banda BrightLine (641/75nm)	Semrock	FF02-641/ 75-25	Cubo de filtro fluorescente
CellTram Vario	Eppendorf	5196000030	Microinyector
Chlamydia trachmatis serovar L2	ATCC	VR-577	Chlamydia trachomatis
CIP-1 medios internos		NA	Axenic media. IPB suplementado con 1% de FBS, 25 μ M aminoácidos, 0,5 mM G6P, 1,0 mM ATP, 0,5 mM DTT y 50 μ M GTP, UTP y CTP. (Omsland, A. 2012) hecho internamente.
Células Cos-7 (ATCC)	ATCC	CRL-1651	Célula de riñón de mono verde africano (células huésped)
Cicloheximida	MP Biomedicals		194527 Inhibidor del crecimiento de la célula huésped
Metanosulfonato de etilo, 99%	Acros Organics	AC205260100	mutágeno
Fetal Plex	Gemini Bio-Products	100-602	Suplemento para medios de crecimiento base
Fiji/ImageJ	https://imagej.net/Fiji	NA	Software de análisis de imágenes Open Sourse. https://imagej.net/Fiji
Incubadora de CO2 Galaxy 170	S Eppendorf	CO1700100X	Incubación de cultivos
celulares gblocks (variantes fluorescentes de FP: Clover y mKate2)	Integrated DNA Technologies	NA	gblock ORFs de Ctr optimizado para la clonación en p2TK2SW2
Gentamicina 10mg/ml	Gibco	15710-064	Antibiótico para medios de crecimiento
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)	Corning	21-020-CM	Enjuague de las células huésped
Heparina sódica	Amersham Life Science	16920	inhibe y revierte las interacciones electrostáticas tempranas entre la célula huésped y los EB
HEPES 1M	GE Life Sciences	SH30237.01	Tampón de pH para medios de crecimiento
InjectMan	Eppendorf	5179 000.018	Micromanipulador
Jupyter Notebook	https://jupyter.org/	NA	Visualización de trazas de inclusión. https://jupyter.org/
Lambda 10-3	Sutter Instrument	LB10-3 Controlador de	rueda de filtros
Oko Touch OKO	Labs	Oko Touch	Interface para controlar la línea Bold T y la unidad de CO2
Etapa XY anterior	Anterior	H107	Etapa de microscopio XY motorizada
Centrífuga PrismR	Labnet	C2500-R	Microcentrífuga con control de temperatura
Problot Horno de hibridación	Labnet	H1200A	Incubadora oscilante para infección por clamidia
Proscan II	Anterior	H30V4	XYZ Controlador de etapa de microscopio
Purificador Clase 2 Gabinete de bioseguridad	Labconco	362804	Trabajo de cultivo celular
RPMI-1640 (sin rojo fenol)	Gibco	11835-030 Medios de	crecimiento base para la obtención de imágenes
RPMI-1640 (rojo de fenol)	GE Life Sciences	SH30027.01	Medios de crecimiento base
scopeLED de excitación LED (470nm, 595nm)	scopeLED	F140	Luz de excitación
Desmembrador sónico modelo 500	Fisher Scientific	15-338-550	Sonicador, pellet de clamidia resuspendente
Incubadora de etapa	OKO Labs	H301-K-FRAME	Cámara de incubación de placa de pocillo de racimo
tampón de sacarosa-fosfato-glutamato 1X (SPG)	Tampón		almacenamiento interno de clamidia NA. (10 mM de fosfato sódico [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM de sacarosa, 0,50 mM de ácido L-glutámico; pH 7,4)
Matraces T-75	Thermo Scientific	156499	Crecimiento de cultivos celulares
Microscopio invertido TE 300	Microscopio	Nikon	16724
THOR LED	Labs	LEDD1B	Luz blanca
Tripsina	Corning	25-052-CI	Desaloja las células huésped del matraz para sembrarlas en placas
Zyla sCMOS	Andor	Cámara de imágenes ZYLA-5.5-USB3
y micro; Paquete	software de control de microscopio automatizado	https://github.com/micro-manager/micro-manager	NA