Aquí se describe un método eficaz sobre cómo producir altas existencias de título virales del virus de la hepatitis E (HEV) para infectar eficientemente las células del hepatoma. Con el método presentado, tanto las partículas virales no envueltas, como las envueltas, pueden ser cosechadas y utilizadas para inocular varias líneas celulares.
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Artículo de método
Un modelo de cultivo celular para producir acciones de virus de la hepatitis E de alto título
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Resumen
Resumen
El virus de la hepatitis E es la principal causa de cirrosis hepática e insuficiencia hepática con una prevalencia creciente en todo el mundo. El virus del ARN de una sola cadena se transmite predominantemente por transfusiones de sangre, condiciones sanitarias inadecuadas y productos alimenticios contaminados. Hasta la fecha, el medicamento fuera de etiqueta ribavirina (RBV) es el tratamiento de elección para muchos pacientes. No obstante, queda por identificar un tratamiento específico para el HEV. Hasta ahora, el conocimiento sobre el ciclo de vida del HEV y la patogénesis se ha visto gravemente obstaculizado debido a la falta de un sistema eficiente de cultivo celular HEV. Un sistema de cultivo celular robusto es esencial para el estudio del ciclo de vida viral que también incluye la patogénesis viral. Con el método descrito aquí se pueden producir títulos virales de hasta 3 x 106 unidad de formación de enfoque/ ml (FFU/ml) de HEV no envolvente y hasta 5 x 104 FFU/ml de HEV envuelto. Usando estas partículas, es posible infectar una variedad de células de diversos orígenes incluyendo células primarias y humanas, así como líneas celulares animales. La producción de partículas HEV infecciosas a partir de plásmidos plantea una fuente infinita, lo que hace que este protocolo sea extremadamente eficiente.
Introducción
La hepatitis E es una enfermedad bastante subestimada con una prevalencia cada vez mayor en todo el mundo. Alrededor de 20 millones de infecciones provocan más de 70.000 muertes al año1. El agente subyacente, el virus de la hepatitis E (HEV), fue reasignado recientemente y ahora se clasifica dentro de la familia Hepeviridae incluyendo los géneros Orthohepevirus y Piscihepevirus. HEV de diversos orígenes se clasifican dentro de la especie Orthohepevirus A-D incluyendo aislados de humanos, cerdos, conejos, ratas, aves y otros mamíferos2. En la actualidad, se han identificado ocho genotipos diferentes (GT) del viru....
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Protocolo
NOTA: Todos los experimentos se realizan bajo la condición BSL-2. Todos los materiales que entren en contacto con el ARN del virus de la Hepatitis E o el virus infeccioso deben enjuagarse correctamente con un 4% de Kohrsolin FF desde un contenedor de residuos dentro de la campana antes de su eliminación.
1. Preparación de Plásmido
- Inocular 200 ml de medio LB que contiene 100 g/ml de ampicilina con Escherichia coli JM109 transformada incorporando una codificación de plásmido para la secuencia HEV gt3 Kernow-C1p6 de longitud completa (pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]54 o pBluescript_SK_HEVp6-G1634R
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Resultados
En este protocolo, describimos la producción de HEVcc infeccioso de alto título. El primer paso es aislar el ADN plásmido (pBluescript_SK_HEVp654 y pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Figura 8a), que luego se linealiza mediante la digestión de restricción y se purifica para la transcripción in vitro (Figura 1). Una linealización exitosa se puede verificar comparando el plásmido-ADN no digerido con el plásmido-ADN digeri.......
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Discusión
A partir de la preparación del plásmido, los rendimientos del ADN deben superar los 150 ng/L para poder realizar una linealización múltiple desde el mismo stock de plásmido, lo que minimiza el riesgo de mutagénesis inducida por bacterias de secuencias genomas cruciales. Además, es importante comprobar el resumen de restricción para la linealización completa del plásmido por electroforesis de gel(Figura 8b). La falta de ADN plásmido linealizado induciría la amplificación del círculo rodante h.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Estamos agradecidos a Suzanne Emerson por el clon del virus de la hepatitis E p6. Suero hiperinmune de conejo específico de HEV fue amablemente proporcionado por Rainer Ulrich, Instituto Friedrich Loeffler, Alemania. Además, agradecemos a todos los miembros del Departamento de Virología Molecular y Médica de la Universidad del Ruhr Bochum por su apoyo y discusión. Las figuras 1-7 se generaron con BioRender.com.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,45 y micro; m mesh | Sarstedt | 83.1826 | Cosecha Virus extracelular |
| 4 % Histofix | CarlRoth | P087.4 | Inmunofluorescencia |
| Ácido acético | CarlRoth | 6755.1 | Solución de trabajo de colágeno |
| Amicon Ultra-15 | Merck Millipore | UFC910024 | Recolección de virus |
| Ampicilina | Sigma-Aldrich | A1593 | Selección de transformados bacterias |
| ATP | Roche | 11140965001 | in vitro transcripción y electroporación |
| BioRender | BioRender | Generación | |
| de figuras CaCl2 | Roth | 5239.2 | Cytomix |
| Collagen R solución 0,4 % estéril | Serva | 47256.01 | Solución de trabajo |
| de colágeno CTP | Roche | 11140922001 | in vitro |
| transcripción Cuvette | Biorad | 165-2088 | Electroporación |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | Inmunofluorescencia |
| DMEM | gibco | 41965-039 | ADN de cultivo celular |
| Promega | M6101 | in vitro | |
| transcripción TDT | Promega | incluido en P2077 | in vitro |
| EGTA | Roth | 3054.3 | Cytomix |
| Escherichia coli JM109 | Promega | L2005 | Transformación |
| Suero fetal bovino | gibco | 10270106 | Cultivo celular |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | Inmunofluorescencia |
| GenePulser Xcell Sistema de Electroporación | BioRad | 1652660 | Electroporación |
| Gentamicina | gibco 15710049 | Cultivo celular | |
| GTP | Roche | 11140957001 | in vitro transcripción |
| H2O | Braun | 184238001 | Inmunofluorescencia |
| Hepes | Invitrogen | 15630-03 | Cytomix |
| Suero de caballo | gibco | 16050122 | Inmunofluorescencia |
| K2HPO4 | Roth | P749.1 | Cytomix |
| KCL | Roth | 6781.3 | Cytomix |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | Cytomix |
| L-Glutamin | gibco | 25030081 | cultivo celular |
| L-Glutatión reducido | Sigma-Aldrich | G4251-5G | Cytomix |
| MEM | gibco | 31095-029 | Cultivo celular |
| MEM NEAA (100×) | gibco | 11140-035 | Cultivo celular |
| MgCl2 | Roth | 2189.2 | Cytomix |
| Microvolumen Espectrofotómetro UV-Vis NanoDrop One | Thermo Fisher | ND-ONE-W | Concentración de ADN/ARN |
| MluI | enzima NEB | R0198L | Linealización |
| Tampón NEB | NEB | incluido en R0198L | Linealización |
| Kit de plásmido NucleoSpin | Macherey & Nagel | 740588.250 | Preparación de plásmidos |
| NucleoSpin RNA Clean-up Kit | Macherey & Nagel | 740948.250 | Purificación de ARN |
| PBS | gibco | 70011051 | Cultivo celular |
| Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 Cultivo celular | |
| Codificación de plásmidos de longitud completa del genoma HEV (p6_G1634R) | Todt et.al | Producción de virus | |
| Codificación de plásmidos de longitud completa del genoma HEV (p6_WT) | Shukla et al. | Nº de acceso al GenBank JQ679013 | Producción de virus |
| Anticuerpo primario 1E6 | LS-Bio | C67675 | Inmunofluorescencia |
| Anticuerpo primario 8282 | Rainer Ulrich, Instituto Friedrich Loeffler, Alemania | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | extracción de ADN |
| Ribo m7G Cap Analog | Promega | P1711 | in vitro transcripción |
| RNasa ausente | CarlRoth | A998.3 | Purificación |
| ARN RNasina (inhibidor de RNasa) | Promega | N2515 | in vitro |
| transcripción Anticuerpo secundario burro anti-ratón 488 | Thermo Fisher | A-21202 | Inmunofluorescencia |
| Anticuerpo secundario cabra anti-conejo 488 | Thermo Fisher | A-11008 | Inmunofluorescencia |
| Pyruvat sódico | Gibco 11360070 | Cultivo celular | |
| T7 ARN polimerasa | Promega | Transcripción P2077 | in vitro |
| Tampón de transcripción | Promega | incluido en P2077 | in vitro |
| transcripción Triton X-100 | CarlRoth | 3051.3 | Inmunofluorescencia |
| Tripsina-EDTA (0,5 %) | gibco | 15400054 | Cultivo |
| celular de IgG ultrabaja | gibco | 1921005PJ | Cultivo celular |
| UTP | Roche | 11140949001 | in vitro |
Referencias
- Wedemeyer, H., Pischke, S., Manns, M. P. Pathogenesis and treatment of hepatitis e virus infection. Gastroenterology. 142 (6), 1388-1397 (2012).
- Smith, D. B., et al. Proposed reference sequences for hepatitis E virus subtypes. The Journal of General Virology
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Reimpresiones y permisos
