Describimos un método para evaluar la expresión del microRNA en los riñones de ratones con obstrucción ureteral unilateral (UUO) mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa de transcripción inversa. Este protocolo es adecuado para el estudio de perfiles de expresión de microARN renal en ratones con UUO y en el contexto de otras condiciones patológicas.
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Artículo de método
Evaluación cuantitativa de PCR en tiempo real de expresiones de microARN en riñón de ratón con obstrucción ureteral unilateral
En este artículo
Resumen
Resumen
Los microARNas (miRNA) son moléculas de ARN no codificantes de una sola cadena que normalmente regulan la expresión génica a nivel post-transcripción mediante la unión a sitios diana parcialmente complementarios en la región no traducida (UTR) de 3' de ARN mensajero (ARNm), lo que reduce la traducción y estabilidad del ARNm. Se han investigado los perfiles de expresión de miRNA en varios órganos y tejidos de ratones, pero no se han disponibles métodos estándar para la purificación y cuantificación del miRNA en el riñón de ratón. Hemos establecido un método eficaz y fiable para extraer y evaluar la expresión de miRNA en riñón de ratón con fibrosis intersticial renal mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (qRT-PCR). El protocolo requería cinco pasos: (1) creación de ratones falsos y unilaterales de obstrucción ureteral (UUO); (2) extracción de muestras de riñón de los ratones UUO; (3) extracción del ARN total, que incluye miRNA, de las muestras de riñón; (4) síntesis complementaria de ADN (ADNC) con transcripción inversa de miRNA; y (5) qRT-PCR utilizando el ADNc. Usando este protocolo, confirmamos con éxito que en comparación con los controles, la expresión de miRNA-3070-3p se incrementó significativamente y los de miRNA-7218-5p y miRNA-7219-5p se redujeron significativamente en los riñones de un modelo de ratón de fibrosis intersticial renal. Este protocolo se puede utilizar para determinar la expresión de miRNA en los riñones de ratones con UUO.
Introducción
Se ha demostrado que los microRNAs (miRNAs) —los ARN cortos que no codifican que causan la degradación y la inhibición transcripcional del ARN mensajero (ARNM)1— regulan la expresión de varios ARNN que tienen funciones cruciales tanto en la fisiología como en la enfermedad (por ejemplo, inflamación, fibrosis, trastornos metabólicos y cáncer). Por lo tanto, algunos de los miRNAs pueden ser nuevos biomarcadores candidatos y dianas terapéuticas para una variedad de enfermedades2,3,4,5. Aunque se han descrito perfiles de ....
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Protocolo
Todos los protocolos experimentales de animales fueron aprobados por el Comité de ética animal de la Universidad Médica de Jichi y se realizaron de acuerdo con las directrices de Uso y Cuidado de Animales Experimentales de la Guía de la Universidad Médica de Jichi para Animales de Laboratorio.
1. La cirugía falsa
- Prepare los siguientes elementos: isoflurano, lámina de corcho, crema depilatoria, toallitas de laboratorio, plato de Petri con solución salina tamponada con fosfato (PBS), nylon 4-0, pinzas, tijeras quirúrgicas, hisopos de algodón y ratones macho C57BL/6 de 8 semanas de edad.
- Anesthetizar un ratón con 1.5% isof....
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Resultados
Un modelo de ratón UUO fue creado por ligadura ureteral izquierda como se describe21 en ratones macho de 8 semanas de edad que pesan 20-25 g. Los uréteres estaban completamente obstruidos por doble ligadura con 4-0 suturas de seda. Se administró un analgésico (meloxicam 5 mg/kg, inyección subcutánea) antes de la cirugía y también diariamente los 2 días posteriores a la cirugía. A los 8 días posteriores a la cirugía, los riñones se recogieron, enjuagaron con PBS, se diseccionaron y almacenaron en n.......
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Discusión
El protocolo descrito anteriormente con qRT-PCR determinó con éxito los niveles de expresión de los miRNAs de destino. La evaluación de los miRNAs extraídos es importante cuando se trata de obtener datos significativos de qRT-PCR, y con el fin de confirmar la calidad de los miRNAs antes de realizar el qRT-PCR, la relación de absorbancia a 260 nm a la que a 280 nm debe comprobarse con un espectrofotómetro. Si no se puede obtener una sola amplificación de PCR de la longitud esperada y la temperatura de fusión o una curva d.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a Michelle Goody, PhD, del Grupo Edanz (https://en-author-services.edanzgroup.com/) por editar un borrador de este manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Qiagen | 79216 | Tampón de lavado 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Tampón de lavado 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | No asignado | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 Placa de reacción de 96 pocillos | ||
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3'Qiagen | |
| MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUGGGGU-3'Qiagen | ||
| MS00068067 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3'Qiagen | |||
| MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3'Qiagen | ||
| 217004 | Giro anclado a membrana columna en un tubo de recolección de 2,0 mL | ||
| Instrumento de PCR en tiempo real | |||
| 9968-32 |
Referencias
- Liu, B., et al. Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation. Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).
- Rottiers, V., Naar, A. M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders.....
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Reimpresiones y permisos
