Artículo de método

Evaluación cuantitativa de PCR en tiempo real de expresiones de microARN en riñón de ratón con obstrucción ureteral unilateral

DOI:

10.3791/61383

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27 de agosto de 2020

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1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Intensive Care Unit, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Describimos un método para evaluar la expresión del microRNA en los riñones de ratones con obstrucción ureteral unilateral (UUO) mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa de transcripción inversa. Este protocolo es adecuado para el estudio de perfiles de expresión de microARN renal en ratones con UUO y en el contexto de otras condiciones patológicas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los microARNas (miRNA) son moléculas de ARN no codificantes de una sola cadena que normalmente regulan la expresión génica a nivel post-transcripción mediante la unión a sitios diana parcialmente complementarios en la región no traducida (UTR) de 3' de ARN mensajero (ARNm), lo que reduce la traducción y estabilidad del ARNm. Se han investigado los perfiles de expresión de miRNA en varios órganos y tejidos de ratones, pero no se han disponibles métodos estándar para la purificación y cuantificación del miRNA en el riñón de ratón. Hemos establecido un método eficaz y fiable para extraer y evaluar la expresión de miRNA en riñón de ratón con fibrosis intersticial renal mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (qRT-PCR). El protocolo requería cinco pasos: (1) creación de ratones falsos y unilaterales de obstrucción ureteral (UUO); (2) extracción de muestras de riñón de los ratones UUO; (3) extracción del ARN total, que incluye miRNA, de las muestras de riñón; (4) síntesis complementaria de ADN (ADNC) con transcripción inversa de miRNA; y (5) qRT-PCR utilizando el ADNc. Usando este protocolo, confirmamos con éxito que en comparación con los controles, la expresión de miRNA-3070-3p se incrementó significativamente y los de miRNA-7218-5p y miRNA-7219-5p se redujeron significativamente en los riñones de un modelo de ratón de fibrosis intersticial renal. Este protocolo se puede utilizar para determinar la expresión de miRNA en los riñones de ratones con UUO.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se ha demostrado que los microRNAs (miRNAs) —los ARN cortos que no codifican que causan la degradación y la inhibición transcripcional del ARN mensajero (ARNM)1— regulan la expresión de varios ARNN que tienen funciones cruciales tanto en la fisiología como en la enfermedad (por ejemplo, inflamación, fibrosis, trastornos metabólicos y cáncer). Por lo tanto, algunos de los miRNAs pueden ser nuevos biomarcadores candidatos y dianas terapéuticas para una variedad de enfermedades2,3,4,5. Aunque se han descrito perfiles de expresión de miRNA en órganos y tejidos de ratón, incluyendo cerebro, corazón, pulmón, hígado y riñón6,7,8,9,10, no ha habido métodos estándar para la extracción y evaluación de miRNAs en riñón de ratón con fibrosis intersticial renal.

Hemos diseñado un protocolo para purificar y detectar de forma fiable las expresiones de miRNAs en los riñones de ratones con fibrosis intersticial renal. El protocolo implica cinco pasos principales, como se indica a continuación. (1) Los ratones macho C57BL/6 de 8 semanas de edad se dividen en grupos de ratones que se someten a una operación falsa (controles) y ratones sometidos a una cirugía que proporciona obstrucción ureteral unilateral (UUO), que está relacionada con la fibrosis intersticial renal. (2) Las muestras de riñón se extraen de los ratones falsos y UUO, se homogeneizan por separado en un homogeneizador de silicio y luego se transfieren a un sistema de trituración de biopolímeros en una columna de giro de microcentrífuga11,12. (3) El ARN total que contiene miRNA se extrae de las muestras de riñón mediante una columna de espín a base de membrana de sílice12,13. (4) Utilizando este ARN total extraído, el ADN complementario (ADNc) se sintetiza a partir del ARN total con el uso de transcriptasa inversa, poli(A) polimerasa, y oligo-dT primer14,15. (5) Las expresiones de los miRNas se evalúan mediante una reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (qRT-PCR) utilizando un tinte intercalante14,15.

Este protocolo se basa en investigaciones que obtuvieron extracciones y evaluaciones significativas de miRNAs en una variedad de tejidos11,12,13,14,15, y el sistema de trituración de biopolímeros utilizado en el protocolo se demostró para purificar arnesón total de alta calidad de los tejidos en 200612. Además, estudios previos han confirmado la exactitud y sensibilidad de los aspectos del protocolo (es decir, la síntesis de ADNc con transcriptasa inversa, poli(A) polimerasa y las imprimaciones oligo-dT del ARN total extraído) para la determinación de la expresión de miRNA por qRT-PCR con un tinte intercalante14,15. Dado que el nuevo protocolo tiene las ventajas de la simplicidad, el ahorro de tiempo y la reducción de errores técnicos, el protocolo se puede utilizar en investigaciones que requieren la identificación precisa y sensible del perfil miRNA en el riñón del ratón. Además, el protocolo podría aplicarse a las investigaciones de muchas condiciones patológicas.

A continuación describimos la determinación de los perfiles de expresión de miRNA en ratones con UUO, que está relacionado con la fibrosis intersticial renal. En los seres humanos, la fibrosis intersticial renal es una característica común e importante tanto de la enfermedad renal crónica como de la enfermedad renal terminal, independientemente de su etiología16,17. Esta fibrosis intersticial renal se asocia con la progresión de la insuficiencia renal, y se caracteriza por el aumento de las expresiones de los componentes de la matriz extracelular en los espacios intersticiales (por ejemplo, colágeno, fibronectina y actina muscular α suave)17,18.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los protocolos experimentales de animales fueron aprobados por el Comité de ética animal de la Universidad Médica de Jichi y se realizaron de acuerdo con las directrices de Uso y Cuidado de Animales Experimentales de la Guía de la Universidad Médica de Jichi para Animales de Laboratorio.

1. La cirugía falsa

  1. Prepare los siguientes elementos: isoflurano, lámina de corcho, crema depilatoria, toallitas de laboratorio, plato de Petri con solución salina tamponada con fosfato (PBS), nylon 4-0, pinzas, tijeras quirúrgicas, hisopos de algodón y ratones macho C57BL/6 de 8 semanas de edad.
  2. Anesthetizar un ratón con 1.5% isoflurano y mantener en 1.5%. Luego, aplica crema depilatoria en el abdomen del ratón. Después de unos minutos, limpie la crema depilatoria con una toallita de laboratorio empapada en PBS.
  3. Inyecte 70% de etanol en el abdomen del ratón y luego coloque el ratón en la lámina de corcho en la posición supina.
  4. Usando tijeras quirúrgicas y pinzas, haz una incisión en la piel en el abdomen y corta el músculo y la membrana peritoneal desde la vejiga hasta el borde inferior izquierdo de las costillas.
  5. Humedezca dos hisopos de algodón con PBS y luego tire de los intestinos cuidadosamente hacia un lado. Coloque los hisopos humedecidos para identificar el riñón izquierdo y el uréter.
  6. Cierre la membrana peritoneal y luego cierre la incisión con nylon 4-0.

2. La cirugía UUO

  1. Prepare los siguientes artículos: isoflurano, lámina de corcho, crema depilatoria, toallitas de laboratorio, plato petri con PBS, seda de 4-0, nylon de 4-0, jeringa de 2,5 ml, hisopos de algodón, pinzas, tijeras quirúrgicas y ratones macho C57BL/6 de 8 semanas de edad.
  2. Anesthetizar un ratón con 1.5% isoflurano y mantener en 1.5%. A continuación, aplique crema depilatoria en el abdomen del ratón. Después de unos minutos, limpie la crema depilatoria con una toallita de laboratorio empapada en PBS.
  3. Inyecte 70% de etanol en el ratón del ratón y luego coloque el ratón en la posición supina en la hoja de corcho.
  4. Usando tijeras quirúrgicas y pinzas, haz una incisión en la piel en el abdomen y corta el músculo y la membrana peritoneal desde la vejiga hasta el borde inferior izquierdo de las costillas.
  5. Coloque la jeringa de 2,5 ml debajo del ratón. Toma dos hisopos de algodón y humedecelos con PBS. Tire de los intestinos cuidadosamente hacia un lado con las pinzas, y coloque los hisopos humedecidos apropiadamente para identificar el uréter izquierdo. Con las pinzas, levante el riñón izquierdo.
  6. Utilice la seda 4-0 para ligar el uréter izquierdo en dos lugares de aproximadamente 1 cm de distancia. Corte el uréter en el punto central de las dos ligaduras, y luego use suturas de nylon 4-0 para cerrar la membrana peritoneal y la incisión.

3. Recolección de muestras de riñón

  1. Prepare lo siguiente: tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, isoflurano, lámina de corcho, etanol al 70%, plato Petri con PBS, pinzas y tijeras quirúrgicas.
  2. Anesthetizar un ratón con 1.5% isoflurano y mantener en 1.5%. Inyectar 70% de etanol en su abdomen y poner el ratón en la hoja de corcho en la posición supina.
  3. Usando tijeras quirúrgicas y pinzas, haz una incisión en la piel en el abdomen y corta el músculo y la membrana peritoneal desde la vejiga hasta el borde inferior izquierdo de las costillas.
  4. Levante la membrana peritoneal con las pinzas. Con las tijeras quirúrgicas, haga una incisión lateral en el borde superior de la membrana peritoneal, y continúe la incisión a lo largo del borde más bajo de las costillas.
  5. A continuación, identifique el riñón izquierdo, refluye con PBS hasta que el riñón se vuelva blanco y amarillento para lavar la sangre de los vasos, y retire el riñón cortando la arteria renal izquierda y la vena con las tijeras quirúrgicas. Coloque el riñón en el plato de Petri y lávelo cuidadosamente con PBS.
  6. Cortar el riñón en muestras de 10 mg con las tijeras quirúrgicas y pinzas (10 mg es un tamaño adecuado para el siguiente paso). Coloque cada pieza del riñón en su propio tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y cierre la tapa del tubo.
  7. Transfiera cada tubo de microcentrífuga en nitrógeno líquido y mantenga los tubos a 80 oC para su almacenamiento a largo plazo antes de su uso.

4. Extracción del ARN total de las muestras de riñón

  1. Preparar los siguientes elementos: tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, tubos de microcentrífuga de 2,0 ml, etanol 100%, cloroformo, homogeneizador de silicio, hielo, un mezclador de vórtice, columnas de giro de biopolímero en tubos de recolección de 2,0 ml11,12, columnas de espín ancladas a membrana en tubos de recogida de 2,0 ml12,13, reactivo de lísis a base de fenol/guanidina, tampón de lavado que contiene guanidina y etanol (buffer de lavado 1), tampón de lavado que contiene etanol (tampón de lavado 2) y agua libre de RNase.
  2. Coloque una muestra de riñón de 10 mg en el homogeneizador de silicio. Añadir 700 l del reactivo de lysis a base de fenol/guanidina en el homogeneizador.
  3. Preparar el homogeneizador y luego presionar/torcer lentamente el peste del homogeneizador contra la muestra de riñón para homogeneizar la muestra. Repita el prensado/torsión hasta que la muestra renal se disuelva completamente en el reactivo de lysis a base de fenol/guanidina.
  4. Para homogeneizar aún más la muestra, transfiera el izado homogeneizado (en un tubo de recogida de 2,0 ml) a la columna de espín de biopolímero.
  5. Gire el izado homogeneizado a 14.000 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente (RT), y luego transfiera el izado precipitado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml no utilizado.
  6. Combine el ésato en el tubo con 140 s de cloroformo y luego cierre bien la tapa del tubo. Para mezclar el izado y el cloroformo, invierta el tubo 15 veces.
    NOTA: El cloroformo se puede utilizar sin capucha.
  7. Incubar cada muestra durante 2-3 min a RT y luego girar cada muestra a 12.000 x g durante 15 min a 4oC.
  8. Sin perturbar el precipitado, transfiera el sobrenadante (que normalmente es de 300 l) a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y luego agregue 1,5 veces su volumen (normalmente 450 l) de etanol al 100 %. Vórtice la mezcla durante 5 s.
  9. Cargue 700 l de la muestra en una columna de espín anclada a membrana en un tubo de recogida de 2,0 ml. Cierre la tapa de columna y gire la columna a 15.000 x g durante 15 s. Tire el izado precipitado en el tubo de recogida.
  10. Lave bien la muestra añadiendo 700 ml de tampón de lavado 1 a la columna de centrifugado anclada a la membrana en un tubo de recogida de 2,0 ml. Cierre la tapa de columna y gire la columna a 15.000 x g durante 15 s. Tire el izado precipitado en el tubo de recogida.
  11. Cargue 500 l de tampón de lavado 2 en la columna de espín anclada a membrana en un tubo de recogida de 2,0 ml para eliminar las sales traza. Cierre la tapa de columna y gire la columna a 15.000 x g durante 15 s. Tire el izado precipitado en el tubo de recogida.
    NOTA: Una columna de espín anclada a membrana puede separar el ARN y el ADN.
  12. Realice el paso 4.11 otra vez.
  13. Gire la columna de espín anclada a la membrana en un tubo de recogida de 2,0 ml de nuevo a 15.000 x g durante 1 min. Tire el izado precipitado en el tubo de recogida.
  14. Transfiera la columna de centrifugado anclada a membrana a un nuevo tubo de recogida de 1,5 ml. Disuelva el ARN total añadiendo 30 ml de agua libre de RNase a la columna. Cierre la tapa de la columna y espere 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, gire la columna a 15.000 x g durante 1 min.
  15. Transfiera la cantidad total de muestras que contengan ARN total a un nuevo tubo de microcentrífuga. Ponga cada uno de los tubos sobre hielo y mida la concentración de ARN total por espectrofotometría.
  16. Conservar los tubos con muestras a 80 oC para su almacenamiento a largo plazo antes de su uso.

5. Síntesis de ADNc con la transcripción inversa del ARN total

NOTA: Se publicaron las directrices MIQE (Minimum Information for the Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) para fomentar mejores prácticas experimentales y ayudar a obtener resultados fiables e inequívocos19. En este protocolo, el cDNA se sintetiza a partir de 1,0 g de ARN total purificado en un procedimiento de dos pasos utilizando transcriptasa inversa, poli(A) polimerasa y imprimación oligo-dT.

  1. Preparar los siguientes: tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, tubos de tiras de ocho pozos con tapas, la tapa de cada tubo de ocho tiras, agua destilada, hielo, un kit de transcriptasa inversa (ver la Tabla de Materiales)14,15 en estado fundido, un ciclo térmico y un mezclador de vórtice.
  2. Inicie el ciclor térmico.
  3. Preparar una solución de mezcla maestra: Añadir 2,0 ml de mezcla de transcriptasa inversa (incluida en el kit) y 2,0 l de mezcla de ácido nucleico de 10x en 4,0 ml de tampón de alta especificación de 5x (para obtener un total de 8,0 l de mezcla maestra por tubo).
  4. Coloque 8,0 ml de la solución de mezcla maestra en cada tubo de un tubo de tira de ocho pocódimos.
  5. Ajuste la densidad total de ARN. Para aislar 1,0 g de ARN total de las muestras de riñón en 12 ml de agua libre de RNase, transfiera la cantidad adecuada de ARN total al agua destilada, utilizando los datos de densidad medidos como se describe en el paso 4.15.
    NOTA: Si hay alguna contaminación del ADN, el ADN contaminado se coamplificará en el qRT-PCR.
  6. Coloque una alícuota de 12 ml de ARN total en cada tubo y cierre la tapa del tubo. Centrifugar el tubo durante 15 x.
  7. Colocar el tubo en el ciclor térmico e incubar la muestra durante 60 min a 37 oC. A continuación, incubar inmediatamente la muestra durante 5 min a 95oC para la síntesis de ADNC.
  8. Una vez completada la incubación, transfiera el ADNc a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y diluya el ADNn a diez veces (1:10) con agua destilada. Vórtice y centrifugar el tubo durante 5 s.
  9. Almacene temporalmente el ADNC diluido sobre hielo y mueva las muestras a 80 oC para su almacenamiento a largo plazo antes de su uso.

6. qRT-PCR de miRNA

NOTA: Utilizamos el método intercalador para realizar el qRT-PCR de miRNA. Los primeros para ARN son U6 pequeños nucleares 2 (RNU6-2), miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p, y miRNA-7219-5p se utilizaron.

  1. Prepare lo siguiente: tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, un mezclador de vórtice, una placa de reacción de 96 pozos para el qRT-PCR, una película adhesiva para la placa de reacción de 96 pozos, un aplicador de película adhesiva, un rotor centrífuga de 96 pozos, imprimaciones específicas de miRNA, un instrumento PCR en tiempo real y un kit de PCR basado en tinte verde (ver la Tabla de Materiales)14,15 que contiene 2x PCR mezcla maestra y 10x universal.
  2. Después de mezclarlos en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, vórtice los siguientes elementos: 6,25 l de agua destilada, 1,25 l de cada imprimación de miRNA de 5 mL disuelta en agua libre de nucleasas, 12,5 l de mezcla maestra de PCR de 2× y 2,5 L de imprimación universal.
  3. Prepare el ADNC sintetizado como se describe en el paso 5 y derrita. Vórtice y centrifugar el ADNc durante 5 s.
  4. Coloque una alícuota de 22,5 l del reactivo (creado como se describe en el paso 6.2) en cada pocóy que esté en la placa de 96 pocillos.
  5. Coloque una alícuota de 2,5 l de ADNc en cada pocód en la placa.
  6. Usando el aplicador de película adhesiva, asegure la película adhesiva firmemente en la placa de 96 pozos. Centrifugar la placa con el rotor centrífugo de 96 pozos a 1.000 x g durante 30 s para ajustar las reacciones en la parte inferior de cada pozo.

7. Ciclismo PCR

  1. Inicie el sistema pcR en tiempo real y coloque la placa creada como se describe en el paso 6.6. en el sistema de PCR en tiempo real. Establezca las propiedades del experimento a continuación; identificar el nombre del experimento. Seleccione lo siguiente: "96-well (0.2 mL)" como el tipo de experimento del sistema, "Tc comparativo (-TC)" como método de cuantificación, "SYBR Green Reagents" como los reactivos para detectar la secuencia de destino, y "estándar" como la ejecución del sistema.
  2. Asigne un nombre a la muestra y al miRNA de destino y, a continuación, asigne un nombre a la muestra y al MIRNA de destino en cada pozo. Las muestras deben asignarse por duplicado para obtener los datos adecuados para la confirmación de los resultados. Seleccione una muestra de referencia y un control endógeno y seleccione "ninguno" para el tinte que se utilizará como referencia pasiva. Asegúrese de establecer la transcriptasa inversa negativa y el control no de plantilla para la expresión de miRNA con el fin de eliminar la contaminación cruzada de los reactivos.
  3. Asegúrese de que el ajuste del volumen de reacción es de "20 l" y las condiciones de ciclo de PCR se establecen a 95 oC durante 15 min, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 94 oC durante 15 s, recocido a 55 oC durante 30 s, y extensión a 70 oC durante 30 s.
  4. Una vez completado el proceso qRT-PCR, utilice el programa de software del sistema para analizar los datos qRT-PCR. Asegúrese de que la línea de umbral seleccionada automáticamente por el programa de software sea adecuada para cada pozo.
  5. Compruebe el valor del ciclo de umbral (CT) del control endógeno y del miRNA objetivo analizado en cada muestra. El valor ct viene determinado por la intersección de la curva de amplificación y la línea de umbral. En el presente estudio, utilizamos RNU6-2 como un control endógeno para el nivel de expresión de MIRNA objetivo, y usamos el método de CT para determinar el nivel de expresión relativa de cada miRNA20objetivo.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un modelo de ratón UUO fue creado por ligadura ureteral izquierda como se describe21 en ratones macho de 8 semanas de edad que pesan 20-25 g. Los uréteres estaban completamente obstruidos por doble ligadura con 4-0 suturas de seda. Se administró un analgésico (meloxicam 5 mg/kg, inyección subcutánea) antes de la cirugía y también diariamente los 2 días posteriores a la cirugía. A los 8 días posteriores a la cirugía, los riñones se recogieron, enjuagaron con PBS, se diseccionaron y almacenaron en n...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo descrito anteriormente con qRT-PCR determinó con éxito los niveles de expresión de los miRNAs de destino. La evaluación de los miRNAs extraídos es importante cuando se trata de obtener datos significativos de qRT-PCR, y con el fin de confirmar la calidad de los miRNAs antes de realizar el qRT-PCR, la relación de absorbancia a 260 nm a la que a 280 nm debe comprobarse con un espectrofotómetro. Si no se puede obtener una sola amplificación de PCR de la longitud esperada y la temperatura de fusión o una curva d...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Michelle Goody, PhD, del Grupo Edanz (https://en-author-services.edanzgroup.com/) por editar un borrador de este manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Qiagen79216Tampón de lavado 2
Qiagen1067933Tampón de lavado 1
Tokyo Laboratory Animals ScienceNo asignado
Thermo Fisher Scientific4316813 Placa de reacción de 96 pocillos
QiagenMS000017015'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3'Qiagen
MS000651415'-UUACACUCCAGUGGUGUGGGGU-3'Qiagen
MS00068067 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3'Qiagen
MS000680815'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3'Qiagen
217004Giro anclado a membrana columna en un tubo de recolección de 2,0 mL
Instrumento de PCR en tiempo real
9968-32
Thermo Fisher Scientific 4311971 Película adhesiva para placa de reacción de 96 pocillos Qiagen 218161 Kit de transcriptasa inversa Qiagen 218073 Kit de PCR a base de colorante verde Qiagen 79654 Columnas de centrifugación de biopolímeros en un tubo colector de 2,0 mL Qiagen 79306 Reactivo de lisis a base de fenol/guanidina Thermo Fisher Scientific 4472380 Thermo Fisher Scientific 4472380 Software de instrumento de PCR en tiempo real Qiagen 129112 Qiagen MS00033740 No divulgado Takara Bio 9790B Homogeneizador de silicio ASKUL GA04SW COMO UNO ER1004NA45-KF2,62 -

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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