Análisis de fenotipo esquelético de un modelo de ratón de eliminación condicional de Stat3

Summary

Este protocolo describe un método canónico para entender los genes críticos que controlan la actividad osteoclasta in vivo. Este método utiliza un modelo de ratón transgénico y algunas técnicas canónicas para analizar el fenotipo esquelético.

Abstract

Los modelos transgénicos del ratón son potentes para entender los genes críticos que controlan la diferenciación y la actividad del osteoclast, y para estudiar mecanismos y tratamientos farmacéuticos de la osteoporosis. Los ratones de catepsina K (Ctsk)-Cre han sido ampliamente utilizados para estudios funcionales de osteoclastos. El transductor de señales y activador de la transcripción 3 (STAT3) es relevante en la homeostasis ósea, pero su papel en los osteoclastos in vivo sigue estando mal definido. Para proporcionar la evidencia in vivo de que STAT3 participa en la diferenciación de osteoclastos y el metabolismo óseo, se generó un modelo de ratón de deleción Stat3 osteoclasta específico(Stat3 ^{fl / fl;} Ctsk-Cre) y analizó su fenotipo esquelético. La exploración de Micro-CT y la reconstrucción 3D implicaron la masa creciente del hueso en los ratones condicionales del golpe de gracia. La coloración de H&E, la coloración doble roja de la caleína y del alizarin, y la coloración ácida tartrato-resistente de la fosfatasa (TRAMPA) fueron realizadas para detectar metabolismo del hueso. En definitiva, este protocolo describe algunos métodos y técnicas canónicas para analizar el fenotipo esquelético y estudiar los genes críticos que controlan la actividad osteoclasta in vivo.

Introduction

El hueso esquelético es el principal órgano de carga del cuerpo humano y está bajo la presión del entorno interno y externo durante la marcha y el ejercicio¹. A lo largo de la vida, los huesos pasan continuamente por la auto-renovación, que es equilibrada por osteoblastos y osteoclastos. El proceso de los osteoclastos que limpian los huesos viejos y los osteoblastos que forman el hueso nuevo mantiene la homeostasis y la función mecánica del sistema esquelético^2. La alteración en el equilibrio puede inducir enfermedades metabólicas óseas, como la osteoporosis. La osteoporosis, que es causada por el exceso de actividad ost....

Protocol

Todos los métodos relacionados con los animales descritos aquí fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina de la Universidad Jiaotong de Shanghai.

1. Cría de ratones de deleción Stat3 específicos de osteoclasto

NOTA: Stat3^{fl /fl} ratones se obtuvieron comercialmente. Los ratones Ctsk-Cre fueron proporcionados por S. Kato (Universidad de Tokio, Tokio, Japón^12). Los ratones fueron criados y mantenidos bajo condiciones libres de patógenos específicos (SPF) en la instalación animal inst....

Results

Usando el actual protocolo, los ratones específicos osteoclast de la canceladura Stat3 fueron generados para estudiar la influencia de la canceladura STAT3 en la diferenciación osteoclasta. Los ratones Stat3^Ctsk y sus compañeros de camada de tipo salvaje (WT) fueron criados y mantenidos después del genotipado. Los macrófagos de médula ósea se aislaron y cultivaron en osteoclastos, y se demostró la deleción de STAT3en ratones Stat3^Ctsk

Discussion

Los modelos de ratón genéticamente modificados se utilizan comúnmente para estudiar el mecanismo y el tratamiento farmacéutico de las enfermedades humanas¹³. Los ratones Ctsk-Cre han sido ampliamente utilizados para estudios funcionales de osteoclastos⁶. El actual estudio describió los protocolos de los métodos para analizar fenotipo esquelético y para estudiar los genes críticos que controlaban actividad osteoclasta in vivo.

El análisis.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solución de paraformaldehído al 4%	Sangon biotech Co., Ltd.
Acetona	Shanghai Reactivo Experimental Co., Ltd.
Alizarina	Sigma-Aldrich	A5533
Solución de amoníaco	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.
Calceína	Sigma-Aldrich	C0875
Ctsk-Cre ratones			un regalo de S. Kato, Universidad de Tokio, Tokio, Japón Ciencias de
Microscopía Electrónica	DDSA	13710
DeCa RapidlyDescalcificador	Pro-Cure	DX1100
DMP-30	Ciencias de Microscopía Electrónica	13600
EDTA	Shanghai Reactivo Experimental Co., Ltd.	60-00-4
EMBED 812 RESINA	Microscopía electrónica Sciences	14900
microscopio de fluorescencia	Olympus	IX73
Solución de hematoxilina	Beyotime Biotechanology	C0107
Micro-CT	Scanco Medical AG	μ CT 80
NaHCO3	Shanghai Reactivo experimental Co., Ltd.
Bálsamo neutro	Sangon biotech Co., Ltd.
NMA	Ciencias de Microscopía Electrónica	19000
Parafina	Sangon biotech Co., Ltd.
micrótomo rotatorio	Leica	RM2265
Stat3fl/fl	ratones GemPharmatech Co., Ltd	D000527
TRAP kit de tinción	Sigma-Aldrich	387A
xileno	Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.	1330-20-7