Análisis de manchas de ARN para la detección y cuantificación de microARN de plantas

Summary

Este método demuestra el uso de la técnica de hibridación del norte para detectar miRNAs a partir del extracto total de ARN.

Abstract

Los microARN (miRNAs) son una clase de ARN pequeños expresados endógenamente, de 21 nt de pequeñas ANas implicadas en la regulación de la expresión génica tanto en plantas como en animales. La mayoría de los miRNAs actúan como interruptores negativos de la expresión génica dirigidos a genes clave. En las plantas, las transcripciones primarias de miRNAs (pri-miRNAs) son generadas por ARN polimerasa II, y forman diferentes longitudes de estructuras estables de bucle de tallo llamadas pre-miRNAs. Una endonucleasa, como Dicer1, procesa los pre-miRNAs en dúplex miRNA-miRNA*. Una de las hebras del dúplex miRNA-miRNA* se selecciona y se carga en la proteína Argonaute 1 o sus homólogos para mediar el escote de los ARNM objetivo. Aunque los miRNAs son moléculas clave de señalización, su detección a menudo se lleva a cabo por métodos basados en PCR menos que óptimos en lugar de un análisis sensible de la mancha del norte. Describimos un método norte simple, fiable y extremadamente sensible que es ideal para la cuantificación de los niveles de miRNA con muy alta sensibilidad, literalmente de cualquier tejido vegetal. Además, este método se puede utilizar para confirmar el tamaño, la estabilidad y la abundancia de miRNAs y sus precursores.

Introduction

El reciente descubrimiento de pequeñas ARN reguladoras, microRNAs, ha liderado la investigación para entenderlos y su papel en plantas y animales¹. Los precursores largos de los miRNAs se procesan en miRNAs maduras de 21 a 24 nt por HYL1 y proteínas específicas similares a los dados^2,,3. Un miRNA de 22 nt puede iniciar el silenciamiento en cascada generando siRNAs secundarios^4. Los estudios han demostrado el papel de los miRNAs y los siRNAs secundarios en el desarrollo, el destino celular y las respuestas de tensión^5,,

Protocol

1. Preparación de un gel de poliacrilamida desnaturalado del 15%

1. Pesar y añadir 4,8 g de urea, añadir 3,75 ml de 40% de acrilamida: bisacrilamida (19:1) solución y 1 ml de 10x TBE pH 8.2 en un tubo estéril de 50 ml.
2. Disolver la urea con un baño de agua a 60 oC en una solución transparente.
3. Mafiar el volumen a 10 ml con agua estéril recién autoclavada y enfríe la mezcla de gel a temperatura ambiente.
4. Preparar solución fresca de persulfato de amonio al 10% (p/v).

2. Montaje de las placas de vidrio y la unidad de electroforesis

1. Lave todo el aparato necesario para la electroforesis de gel ....

Results

En esta demostración, hemos detectado y cuantificado la expresión de miR397 en diferentes tejidos de arroz indica var whiteponni (Figura 1). miR397 es un miRNA de 22 nt y miRNA conservada. La expresión de miR397 se puede detectar en todas las muestras analizadas. Según los datos de secuenciación de próxima generación, la muestra 1 (tejido de plántulas) tiene miR397 a 5 lecturas por millón (rpm). Detectamos su señal cómodamente, indicando que el método es muy sensible y se p.......

Discussion

Este método se puede utilizar ampliamente para la detección y cuantificación de ARN pequeños, incluidos los miRNAs menos abundantes. El protocolo describe principalmente los pasos para desnaturalizar el ARN total en un tampón de carga, la separación del tamaño por electroforesis de gel, la transferencia de ARN a una membrana, la interconexión del ARN en la membrana e hibridar utilizando las sondas oligoeléctricas radiomarcadas deseadas.

El paso crítico para cualquier experimento de hinchazón e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solución de acrilamida-bisacrilamida al 40%	Sigma	A9926
Persulfato de amonio (APS)	BioRad	1610700
Papel secante	whatmann papel secante I	1001-125
Azul de bromofenol	Sigma	B5525-5G
Puntas de carga capilar	BioRad	2239915
Desionizado formamida	Ambion	AM9342
Bloque calefactor	Eppendorff	5350
Hybond N+membrana de nylon	GE	RPN203B
Botella de hibridación	Sigma	Z374792-1EA
Horno de hibridación	Thermo Scientific	1211V79
N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina (TEMED)	Sigma	T7024-25ml
PhosphorImager	GE- Escáner Typhoon	29187194
PhosphorImager pantalla y casete	GE healthcare	GE28-9564-75
Pipetas	Gilson, modelos: P20 y P10	FA10002M, FA10003M
Pipeta de plástico	Falcon	357550
Aparato de gel de poliacrilamida	BioRad	1658003EDU
Sephadex G-25 columna	GE Healthcare	27532501
Speed Vac Concentrador	Thermo Scientific	20-548-130
Spinwin	Tarsons	1010
T4 Polinucleótido quinasa (PNK)	NEB	M0201S
Aparato transblot	BioRad	1703946
ULTRAHyb tampón de hibridación	Ambion	AM8670
Urea	Fischer Scientific	15985
Reticulante	UVP UVP	CL-1000L
Vortex	Tarsons	3020
Baño de agua	NEOLAB	D-8810
Xileno cianol	Sigma	X4126-10G