Extra Cellular Matrix-Based y Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Resumen

Aquí, se describen cuatro métodos para generar organoides testiculares a partir de células testiculares murinas neonatales primarias, es decir, matriz extracelular (ECM) y entornos de cultivo 2D y 3D libres de ECM. Estas técnicas tienen múltiples aplicaciones de investigación y son especialmente útiles para el estudio del desarrollo testicular y la fisiología in vitro.

Resumen

Los organoides testiculares proporcionan una herramienta para estudiar el desarrollo testicular, espermatogénesis, y la endocrinología in vitro. Se han desarrollado varios métodos para crear organoides testiculares. Muchos de estos métodos se basan en la matriz extracelular (ECM) para promover el ensamblaje de tejido de novo, sin embargo, hay diferencias entre los métodos en términos de morfología biomimética y función de los tejidos. Además, hay pocas comparaciones directas de métodos publicados. Aquí, se hace una comparación directa mediante el estudio de las diferencias en los protocolos de generación de organoides, con los resultados proporcionados. Se describen cuatro métodos de generación arquetípica: (1) 2D sin ECM, (2) ECM 2D, (3) sin ECM 3D y (4) se describe la referencia cultural 3D ECM. Se utilizaron tres puntos de referencia primarios para evaluar la generación de organoides testiculares. Se trata de autoensamble celular, inclusión de los principales tipos celulares (Sertoli, Leydig, germen y células peritubulares), y arquitectura de tejido compartimentada adecuadamente. De los cuatro entornos probados, los cultivos libres de ECM 2D y ECM 3D generaron organoides con morfologías internas más similares a los testículos nativos, incluyendo la compartimentación de novo de los tipos de células tubulares frente a intersticiales, el desarrollo de estructuras similares a los tubulos y una función endocrina establecida a largo plazo. Todos los métodos estudiados utilizaron suspensión de células testiculares murinas primarias no ordenadas y utilizaron recursos de cultivo comúnmente accesibles. Estas técnicas de generación de organoides testiculares proporcionan un conjunto de herramientas altamente accesible y reproducible para iniciativas de investigación en organogénesis testicular y fisiología in vitro.

Introducción

Los organoides testiculares son una técnica pionera para el estudio del desarrollo testicular, la espermatogénesis y la fisiología in vitro^1,2,3,4. Se han explorado varios métodos para la generación de organoides; estos incluyen una variedad de sistemas de cultivo libre de ECM y matriz extracelular (ECM), tanto en orientaciones bidimensionales (2D) como tridimensionales (3D). Diferentes métodos de generación pueden promover estrategias de ensamblaje celular distintas; esto da como resultado un alto nivel de variabilidad morfológica y funcion....

Protocolo

Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad Northwestern, y todos los procedimientos se llevaron a cabo bajo protocolos aprobados por la CICIC.

1. Preparación de soluciones enzimáticas de disociación tisular

1. Utilice dos soluciones enzimáticas diferentes (Solución 1 y Solución 2), ambas realizadas con una solución de medio de cultivo basal (BM).
2. Para preparar BM, añada suero y penicilina-estreptomicina a concentraciones mínimas esenciales de medio a final del 10% y del 1% respectivamente (ver Tabla de materiales para rea....

Resultados

La generación de organoides se consideró infructuosa si las células testiculares no se autoensamblaban dentro de 72 h de cultivo, sin embargo, todos los métodos presentados aquí se ensamblan dentro de las 24 h cuando se utilizan células murinas juveniles (5 dpp). Fallo de la generación de construcción biológica presentada como una continuación de células suspendidas libremente (columna de 0 h en la Figura 1) incluso después del cultivo extendido (72 h). En ausencia de autoensamble de tejido,.......

Discusión

Con la finalización de este protocolo de generación de organoides, el usuario tendrá cuatro técnicas de cultivo diferentes disponibles para ensamblar construcciones testiculares y organoides en entornos libres de ECM o ECM. Es importante destacar que los cuatro métodos permiten al investigador observar no invasivamente el autoensamble organoide a lo largo del tiempo a través de imágenes de lapso de tiempo o grabación de vídeo, y recopilar de forma no invasiva medios condicionados para el análisis de hormonas y citoquinas.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.22 mmm Filtros estériles de medios	Millipore Sigma	scgpu05re	Para medios de filtrado estériles
3 y beta; Anticuerpo primario HSD	Cosmo Bio Co	K0607	Marcador de células de Leydig, dilución 1:500
AlexaFluor 568 α-Ratón	Thermo Fisher Scientific	A-21202	Anticuerpo secundario marcado con fluorescencia
AlexaFluor 568 α-Rabbit	Thermo Fisher Scientific	A10042	Anticuerpo secundario marcado con fluorescencia
Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific	11-095-080	Base de medios de cultivo
Colagenasa I	Worthington Bio LS004197		Para solución de disociación 1
Corning Matrigel Membrane Matrix, sin LDEV	Corning	354234	Matriz extracelular utilizada para la fundición de geles de cultivo ECM 2D y 3D
Countess Contador de células Thermo	Fisher Scientific	C10227	Contador de células automático (máquina hematómetro)
Portaobjetos para cámara de recuento de células Countess	Thermo Fisher Scientific	C10228	Portaobjetos de hemacitómetro para uso con contador automatizado Countess
Anticuerpo primario DDX4	Abcam	138540	Marcador de espermatogonia, dilución 1:500
Desoxirribonucleasa I (2.280 u/mgDW)	Worthington Bio	LS002140	Para solución de disociación 1
DPBS 1X, + CaCl + MgCl	Thermo Fisher Scientific	14040182	Para reconstituir la hialuronidasa
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco +Ca/+Mg	Thermo Fisher Scientific	14040117	PBS
Embryo Grade H2O	MIllipore	Sigma W1503	Para reconstituir la colagenasa I y la dnasa I
Suero fetal bovino	Thermo Fisher Scientific	16000044	Para enfriar soluciones de disocación de enzimas
Folículo hormona estimulante	Abcam	ab51888	Para el cultivo de organoides a largo plazo
Gonadotropina coriónica humana	Millipore Sigma	C1063	Para el cultivo de organoides a largo plazo
Hialuronidasa, de testículos bovinos	Millipore Sigma	H4272	Para solución de disociación 2
Ensayo de inmunoabsorción enzimática de inhibina B	ELISA AL-107	de Ansh Labs Inhibina B
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828-028	Fuente de suero para medios basales
MicroTissues Placa de Petri 3D Micro-mold Spheroids (24-35, matriz 5x7)	Millipore Sigma	Z764051	para la fabricación de organoides sin ECM en 3D
Nunc, sistema de portaobjetos de cámara Lab Tek II, 4 pocillos	Thermo Fisher Scientific	12-565-7	para cultivo de ECM 3D sin ECM 2D
Penicilina/Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15-140-122	Antibiótico para medios de comunicación
Richard-Allan Scientific; Histogel, Gel de procesamiento de muestras	Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012	Para ayudar a la inclusión de parafina en el
anticuerpo primario SOX9	Millipore Sigma	AB5535	Sertoli Marker, dilución 1:500
Tedklad Global Mouse Chow (Criador)	Teklad Global	2920	Alimento para ratones sin fitoestrógenos
Tedklad Global Mouse Chow (Mantenimiento)	Teklad Global	2916	Alimento para ratones sin fitoestrógenos
Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas de testosterona	Calbiotech	TE373S	Kit ELISA de testosterona Solución azul
tripano, 0,4 %	Thermo Fisher Scientific	15250061	Para el recuento de células
αAnticuerpo primario SMA	Millipore Sigma	A2547	Marcador peritubular, dilución 1:500
y beta; Anticuerpo primario de catenina	BD Biosciences	610154	marcador de citoplasma de Sertoli, dilución 1:100

Kit de