Method Article

Extra Cellular Matrix-Based y Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

DOI:

10.3791/61403

⸱

October 7th, 2020

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, se describen cuatro métodos para generar organoides testiculares a partir de células testiculares murinas neonatales primarias, es decir, matriz extracelular (ECM) y entornos de cultivo 2D y 3D libres de ECM. Estas técnicas tienen múltiples aplicaciones de investigación y son especialmente útiles para el estudio del desarrollo testicular y la fisiología in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los organoides testiculares proporcionan una herramienta para estudiar el desarrollo testicular, espermatogénesis, y la endocrinología in vitro. Se han desarrollado varios métodos para crear organoides testiculares. Muchos de estos métodos se basan en la matriz extracelular (ECM) para promover el ensamblaje de tejido de novo, sin embargo, hay diferencias entre los métodos en términos de morfología biomimética y función de los tejidos. Además, hay pocas comparaciones directas de métodos publicados. Aquí, se hace una comparación directa mediante el estudio de las diferencias en los protocolos de generación de organoides, con los resultados proporcionados. Se describen cuatro métodos de generación arquetípica: (1) 2D sin ECM, (2) ECM 2D, (3) sin ECM 3D y (4) se describe la referencia cultural 3D ECM. Se utilizaron tres puntos de referencia primarios para evaluar la generación de organoides testiculares. Se trata de autoensamble celular, inclusión de los principales tipos celulares (Sertoli, Leydig, germen y células peritubulares), y arquitectura de tejido compartimentada adecuadamente. De los cuatro entornos probados, los cultivos libres de ECM 2D y ECM 3D generaron organoides con morfologías internas más similares a los testículos nativos, incluyendo la compartimentación de novo de los tipos de células tubulares frente a intersticiales, el desarrollo de estructuras similares a los tubulos y una función endocrina establecida a largo plazo. Todos los métodos estudiados utilizaron suspensión de células testiculares murinas primarias no ordenadas y utilizaron recursos de cultivo comúnmente accesibles. Estas técnicas de generación de organoides testiculares proporcionan un conjunto de herramientas altamente accesible y reproducible para iniciativas de investigación en organogénesis testicular y fisiología in vitro.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los organoides testiculares son una técnica pionera para el estudio del desarrollo testicular, la espermatogénesis y la fisiología in vitro1,2,3,4. Se han explorado varios métodos para la generación de organoides; estos incluyen una variedad de sistemas de cultivo libre de ECM y matriz extracelular (ECM), tanto en orientaciones bidimensionales (2D) como tridimensionales (3D). Diferentes métodos de generación pueden promover estrategias de ensamblaje celular distintas; esto da como resultado un alto nivel de variabilidad morfológica y funcional entre los modelos organoides publicados. El propósito de este artículo es discutir el estado actual de los modelos testiculares in vitro, y servir como una plantilla para futuros investigadores, al diseñar experimentos organoides testiculares. Dentro del presente estudio, se definen y caracterizan cuatro arquetipos diferentes del sistema de cultivo en el proceso experimental y el resultado biológico. Estos incluyen: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free, y 3D ECM métodos de referencia cultural. Las estrategias presentadas en el presente documento pretenden ser sencillas, accesibles y altamente reproducibles entre diferentes laboratorios y grupos de investigación.

Históricamente para los testículos, la designación "in vitro", se ha utilizado para varios métodos de cultivo diferentes de tejidos testiculares y células. Estos incluyen métodos de cultivo de tejidos/órganos organotípicos (es decir, cultivo de explantes)5, cultivo aislado de tubulos semíferos6,cultivo celular testicular7, y métodos de morfogénesis de tejido de novo (es decir, construcciones biológicas y organoides)1. Las primeras investigaciones sobre espermatogénesis in vitro se realizaron hace aproximadamente 100 años, con el cultivo de conejo testis explants en 19208,y más tarde en 1937 con explantes de ratón9. Dentro de estos experimentos iniciales se observó que la espermatogonia degeneraba en gran medida a lo largo de la primera semana de cultivo, aunque se identificaron algunas células meiotically diferenciadoras. Reminiscente de estos informes históricos, el cultivo de explant testis fue revivido y optimizado en 2011 para convertirse en una técnica factible para el estudio de los testis10. Desde 2011, el cultivo de explant ha producido espermatozoides competentes para la fertilidad en múltiples informes11,12,13. Sin embargo, debido a la dependencia del cultivo explantado de los túbulos nativos preexistentes, estos avances recientes se describen con mayor precisión como ejemplos de función testicular "ex vivo" y espermatogénesis, función tisular que se mantuvo o se reanudó al extraerse del cuerpo de un organismo. A pesar de su prevalencia en la literatura, el mantenimiento y la diferenciación de células germinales a largo plazo dentro de los explantes testiculares es difícil replicar14,15,16,17,18, especialmente en los períodos de tiempo suficiente para observar completamente la espermatogénesis in vitro (35 días en ratones19 y 74 en humanos20).18 Es intrigante apreciar que muchos de los mismos desafíos experimentados hace 100 años, todavía se experimentan dentro de la espermatogénesis ex vivo hoy en día.

Diferentes de los enfoques ex vivo, los organoides testiculares son microtiss ensambladas de novo generadas enteramente in vitro a partir de fuentes celulares (es decir, células testiculares primarias). Los organoides testiculares proporcionan una estrategia creativa para eludir la dependencia histórica del campo del tejido nativo preexistente, y para recapitular la biología testicular completamente in vitro. Hay múltiples requisitos compartidos por la mayoría de los modelos de tejido organoides; estos incluyen (1) morfología o arquitectura de tejido in vivo-mimético, (2) múltiples tipos celulares principales del tejido representado, (3) autoensamble o auto-organización en su generación, y (4) la capacidad de simular algún nivel de la función del tejido representado y la fisiología21,,22,,23,,24. Para los testículos, esto se puede capturar en cuatro señas de identidad principales: (1) la inclusión de los principales tipos de células testiculares, germen, Sertoli, Leydig, células peritubulares y otras células intersticiales, (2) conjunto de tejidos dirigidos por células, (3) tipos de células adecuadamente compartimentadas en compartimentos tubulares separados (germen y sertoli) y regiones intersticiales (todos los demás tipos de células), y (4) cierto grado de función tisular (por ejemplo, secreción de hormonas reproductivas o respuestas de tejidos, y mantenimiento y diferenciación de células germinales). Teniendo en cuenta los desafíos históricos en el mantenimiento de la diferenciación de células germinales ex vivo e in vitro, la recapitulación de arquitecturas testiculares in vivo-miméticas (es decir, estructuras que se asemejan a túbulos seminíferos) con marcadores adicionales que sugieren la simulación de la fisiología testicular (por ejemplo, función endocrina), son hitos prioritarios hacia la generación de organoides que algún día podrían sostener espermatogénesis in vitro.

La mayoría de los métodos organoides testiculares publicados aprovechan el ECM disponible comercialmente (por ejemplo, formulaciones de colágeno o ECM patentadas)25,26,27 o ECM de origen personalizado (es decir, testículos decelularizados hidrogeles derivados de ECM)28,,29,30. El ECM exógeno promueve la formación de tejido de novo proporcionando un andamio de apoyo al ensamblaje para la generación de tejidos. Los métodos de ECM han dado un nivel impresionante de formación de tejidos, incluyendo cierta presencia de células germinales y morfología de los tejidos miméticos25,,28. Sin embargo, los ECM que utilizan no siempre están disponibles universalmente (es decir, hidrogeles descelularizados derivados de ECM), y algunos métodos requieren sofisticadas orientaciones de siembra de gel y células (por ejemplo, gradientes de 3 capas de ECM e impresión 3D)25,,31,,32. Los métodos libres de andamios (por ejemplo, gota colgante y placas de cultivo no adherentes)33,34,35 también han generado organoides robustos y altamente reproducibles sin necesidad de geles ECM o andamios. Sin embargo, la morfología tisular de estos organoides libres de andamios es a menudo diferente a los testículos in vivo, y la mayoría de estos informes incorporan un aditivo ECM bioquímico para promover la formación de tejidos33,,34,36, o alternativamente, dependen de la centrifugación para la agregación de células forzadas y la compactación34,haciéndolos menos ideales para el estudio de la migración dirigida por células y la autoorganización.

Los cuatro métodos de generación de organoides presentados en este manuscrito incluyen estrategias tanto dependientes de ECM como estrategias independientes, cada una de las dos utilizando una simple siembra celular que permite la observación del autoensamble organoide impulsado por células. Las cuatro técnicas se pueden realizar desde las mismas suspensiones celulares o pueden hacer uso de poblaciones personalizadas y enriquecidas de tipo celular. Una fuerza de estos métodos es la capacidad de observar organoides autoensamblados en tiempo real, y comparar directamente cómo las estructuras testiculares se autoensamblan entre diferentes microambientes de cultivo. Las diferencias fenotípicas entre estos cuatro métodos de cultivo deben ser consideradas por su impacto en la cuestión de investigación o sujeto del investigador. Cada método produce construcciones biológicas u organoides dentro de 24 h o menos. En conclusión, los métodos presentados aquí proporcionan un conjunto de herramientas de técnicas de ensamblaje organoides para el estudio del ensamblaje organoide testicular, desarrollo de tejidos y fisiología testicular in vitro.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad Northwestern, y todos los procedimientos se llevaron a cabo bajo protocolos aprobados por la CICIC.

1. Preparación de soluciones enzimáticas de disociación tisular

  1. Utilice dos soluciones enzimáticas diferentes (Solución 1 y Solución 2), ambas realizadas con una solución de medio de cultivo basal (BM).
  2. Para preparar BM, añada suero y penicilina-estreptomicina a concentraciones mínimas esenciales de medio a final del 10% y del 1% respectivamente (ver Tabla de materiales para reactivos específicos). A continuación, el filtro estéril del BM a través de un filtro de 0,22 m. Antes de su uso con células, preequilebra BM estéril a un pH neutro dispensando en un plato de cultivo y colocándolo dentro de una incubadora humidificada de 5% deCO2 a 37oC durante un mínimo de 1 h.
    NOTA: BM se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 semana, después de lo cual se debe hacer BM fresco.
  3. Para preparar la colagenasa I soluciones de stock, primero disolver 100 mg de colagenasa I en 1 ml de embrión estéril grado H2O (concentración final 10% m/v), invertir o remolino para disolver, y almacenar 20 l alícuotas a -20 oC para su uso posterior. Las alícuotas deben descongelarse una sola vez.
  4. Para preparar soluciones de stock de desoxirribonucleasa I (DNase I), añada 20 mg de DNase I en 1 ml de embrión estéril grado H2O (concentración final 2% m/v), invertir o girar para disolver (no vórtice), y almacenar 20 l alícuotas a -20 oC para su uso posterior. Las alícuotas deben descongelarse una sola vez.
  5. Para soluciones de hialuronidasa, añadir 30 mg en 1 ml de solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS; concentración final 3% m/v hialuronidasa en PBS que contenga Ca++/Mg++), invertir o girar para disolver, y almacenar 100 alícuotas alícuotas a -20 oC para su uso posterior. Las alícuotas se pueden descongelar y volver a congelar varias veces sin pérdida de actividad enzimática.
  6. Para preparar la disociación Solución 1, añadir 10 l de colagenasa I y 10 l DNase I en 1 ml de BM estéril, preequilibrada (Concentraciones finales: 1 mg/ml de colagenasa I y 5 g/ml de DNase I). Triturar suavemente con una pipeta para mezclar la solución, y precalentó a 37 oC antes de su uso con el tejido.
    NOTA: La solución 2 se prepara añadiendo 33 l de hialuronidasa (preadvertida a 37 oC) por 1 ml de la solución 1 (a una concentración final de 1 mg/ml). Esto ocurre a mitad de la vía a través de la disociación enzimática del tejido testículo en el paso 2.5 a continuación.

2. Disociación de tejido Testis

NOTA: Todos los ratones fueron alojados en jaulas de polipropileno y provistos de alimentos y agua ad libitum. Los animales fueron alimentados con comida irradiada que no contiene fitoestrógenos. Los ratones JUVENILEs CD-1, 5 días después del parto (dpp), se utilizaron para todos los experimentos y se anestesiaron antes de la eutanasia y la recolección de tejidos, dentro de una cámara de anestesia unida a un vaporizador de isoflurano (2,5 L/min en O2). Los ratones fueron confirmados para anestesia completa a través de la ausencia de una respuesta a la punción del dedo del pie, después de lo cual los ratones fueron eutanasiados por decapitación.

  1. Anesthetizar ratones en una cámara de isoflurano, asegurar la anestesia a través de un pinchazo del dedo del pie, y luego decapitar el ratón usando una tijera afilada. Coloque el ratón eutanizado supino en una estera de disección y esterilizar el abdomen con 70% de etanol. Tienda de la piel de la parte inferior del abdomen con fórceps y abrir el abdomen con tijeras.
  2. Localice los testículos en las regiones inguinales inferiores izquierda y derecha del abdomen. Cortar sus conexiones a los vasos deferentes y cualquier tejido conectivo de anclaje, a continuación, levantar todo el testículo (con epidídimo todavía unido) del animal. Coloque los testículos en un plato de Petri de BM preequilibrado.
  3. Bajo un microscopio de disección y dentro de un campo estéril, haga una pequeña incisión en la tunica albuginea en un extremo de cada testículo con una pequeña tijera de microdisección o rasgando suavemente usando dos fórceps finos.
    1. Luego, mientras sostiene los testículos desde el extremo opuesto de la incisión, apriete suavemente los testículos con fórceps finos y empuje en un suave movimiento de barrido hacia el agujero en la tunica; esto liberará el tejido testicular como una pieza cohesiva.
  4. Cortar los testículos en trozos más pequeños (≤ 2 mm3) y colocarlos en 1 ml de la solución de disociación precalentada (37 oC) 1.
    1. Incubar a 37oC durante 10 min.
    2. Para más de 10 testículos, aumente el volumen total de la solución de disociación en 1 ml, asegurando un mínimo de 1 ml de solución de disociación por cada 10 testículos (por ejemplo, 2 ml para 20 testículos, 3 ml para 30 testículos, etc.).
    3. Triturar suavemente las piezas de testis 50 veces (50x) en la solución 1 utilizando una pipeta P1000. Asegúrese de que los túbulos se separan entre sí y del tejido intersticial en este punto. Si quedan grumos, incubar durante 5 minutos adicionales y triturar una vez más (50x).
  5. Añadir 33 l de solución de hialuronidasa (precalentada a 37oC, a partir del paso 1.5) por 1 ml de mezcla de disociación de solución 1 (que contenga el tejido testicular parcialmente disociado y los túbulos). Después de añadir hialuronidasa, esto se llama solución 2.
    1. Triturar (50x) con un P1000 e incubar a 37oC durante 5 min.
    2. Triturar (50x) con una pipeta P200.
    3. Asegúrese de que en este punto no haya túbulos visibles ni grupos de células. Si los grumos persisten, incubar hasta 5 minutos más, con una trituración adicional con una pipeta P200 (50x).
  6. Aprieta las enzimas de disociación añadiendo suero bovino fetal (FBS) al 10% del volumen total de la solución 2. Triturar varias veces usando una pipeta P200 para asegurar que no queden grumos, y filtrar a través de un colador celular de 40 m para producir una suspensión de una sola célula.
  7. Centrifugar las células a 100 x g durante 7 min, desechar el sobrenadante y resuspender las células en BM fresco.
  8. Cuente las concentraciones celulares totales y viables utilizando la exclusión azul tripano en un hemocitoómetro. Añadir 10 l de 1:1 diluido, suspensión celular: solución azul tripano, en la cámara de conteo de celdas del hemocitómetro (ver Tabla de materiales).
    1. Re-centrifugar las células a 100 x g durante 7 min y resuspend en BM fresco.
      NOTA: Utilice únicamente celdas viables para calcular la concentración y el número de células. Utilice únicamente suspensiones celulares de ≥ 80% de viabilidad para generar organoides.
    2. Preparar la suspensión de una sola célula en las concentraciones celulares como se describe para aliquot 280,000 células dados los volúmenes utilizados en los pasos específicos del protocolo a continuación en la sección 3: 2D ECM-Free – 0.56 x 106 células/mL, 2D ECM – 0,56 x 106 células/ml, 3D sin ECM – 4,66 x 106 celdas/ml, 3D ECM – 2,8 x 106 celdas/ml.
      NOTA: Todos los experimentos de cultivo presentados aquí comienzan con 280.000 células sembradas por cultivo. Estos números se comparan con los datos representativos de la Figura 1, la Figura 2, la Figura 3 y la Figura 4.

3. Preparación de platos de cultivo organoides y siembra de células

NOTA: Para garantizar un ECM homogéneo, precongelar las alícuotas congeladas de ECM durante la noche antes de la experimentación. Las alícuotas de ECM deben sumergirse dentro de un cubo de hielo dentro de un refrigerador o sala fría de 4 oC para garantizar un aumento lento y gradual de la temperatura. Todo ECM se utiliza en una dilución final 1:1 en BM para cultivo. Mantener el ECM descongelado y el ECM diluido 1:1 sobre hielo hasta inmediatamente antes de su uso, de lo contrario el ECM podría polimerizarse prematuramente.

  1. Para el cultivo libre de ECM 2D, no es necesaria ninguna preparación especial, las suspensiones de una sola célula de placa (500 l de 0,56 x 106 células/ml en BM) directamente sobre los portaobjetos de cámara de 4 pocillos, y colocarlas en una incubadora de 35 oC para el cultivo.
    NOTA: Las células deben adherirse a la parte inferior del plato de cultivo dentro de las primeras 24 horas de cultivo y pueden exhibir algunos pequeños grupos celulares 3D dentro de este mismo tiempo.
  2. Para el cultivo de ECM 2D, dispensar 100 l de medio de matriz sótano extracelular diluido 1:1 en un portaobjetos de cámara de 4 pocilnos, asegurando que el gel cubra la totalidad de la parte inferior del plato.
    1. Colocar el portaobjetos de la cámara en una incubadora de 35 oC durante un mínimo de 30 minutos para permitir que el ECM se polimerice en un gel.
    2. Agregue la suspensión celular (500 l de 0,56 x 106 células/ml en BM) directamente en la parte superior del gel 2D una vez que se haya polimerizado.
      NOTA: Las celdas deben agruparse para formar pequeños clústeres 3D dentro de las primeras 24 horas de cultivo.
  3. Para el cultivo libre de ECM 3D, prepare inserciones de platos de agarosa 3D Petri antes de comenzar el cultivo celular.
    1. En primer lugar, autoclave 1,5 g de polvo de agarosa en un vaso de precipitados de 100 ml, luego añadir 75 ml de agua estéril, destilada y microondas para producir agarosa fundida al 2% para la fundición de platos 3D Petri.
    2. Dentro de un espacio de trabajo estéril, dispensar agarrose fundida en el molde de la placa 3D Petri hasta que el menisco esté nivelado con los lados del molde.
    3. Deje que la agarosa se enfríe y solidifique. Cuando sea sólido, gire el molde al revés y flexione suavemente repetidamente hasta que el plato de Petri 3D de agarosa se libere del molde.
      NOTA: En este punto, se pueden preparar muchos platos de agarosa 3D Petri y guardarlos en H2O estéril o DPBS a 4 oC durante más de un mes.
    4. Antes de cultivar, coloque los platos de agarosa 3D Petri en un plato de cultivo de 24 pozos, y cúbralos con 1 ml de BM. Deje que los platos de Petri 3D se equilibren en BM durante al menos 30 minutos dentro de una incubadora de cultivo de 37oC. Deseche el BM y repita el equilibrio una vez más con 1 ml de BM fresco. Después del equilibrio de los platos 3D Petri en BM, aparecerán del mismo color que el BM (es decir, rosa).
    5. Para prepararse para la siembra celular, retire todo el BM del pozo y dispensar 200 l de BM fresco alrededor, pero no dentro del hueco central de la placa 3D Petri. Además, recoja cualquier BM restante del interior del hueco de la siembra de celdas centrales de la plaquita micropocillos.
    6. Dispensar la suspensión de una sola célula (4,66 células/ml en 60 ml de BM) en el hueco central de la placa de agarosa 3D Petri. Limpie suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar las células y garantizar una suspensión de una sola célula al comienzo del cultivo.
    7. Colocar en una incubadora humidificada de 35oC para el cultivo. Al día siguiente, retire los 200 l de BM de alrededor de la plaquita micropocillos y sustitúyalos por 1 ml de BM fresco. Esto llevará el nivel de líquido por encima del plano de la plaquita, sumergiendo todo el cultivo.
    8. Retire/agregue lentamente y cuidadosamente medios desde fuera de la placa de agarosa 3D Petri. Los organoides deben haberse compactado durante la noche, lo que les permite descansar en la parte inferior y permitir que los cambios en los medios dejen los organoides sin perturbaciones.
  4. Para el cultivo de ECM 3D, preparar una suspensión de una sola célula combinando, en partes iguales, la suspensión celular en BM con ECM frío y predescongelado (concentración final de 2,8 x 106 células/ml).
    1. Dispensar inmediatamente la mezcla celular-ECM en un portaobjetos de 4 pozos, asegurando que la mezcla cubra toda la parte inferior de la placa.
    2. Coloque los portaobjetos de la cámara a 35 oC en una incubadora y deje que su contenido se polimerice. Esto debe tomar al menos 30 min. Después de la polimerización, agregue 500 l de BM en la parte superior del cultivo.
      NOTA: Las celdas deben haberse agrupado para formar pequeños agregados 3D dentro de las primeras 24 horas de referencia cultural.

4. Mantenimiento organoide

  1. Cultivo de todos los tipos de modelos organoides a 35 oC. Para todos los tipos de cultivo, intercambie la mitad de sus medios con BM fresco cada 2 días. Para asegurarse de que los organoides no se recogen accidentalmente durante el intercambio de medios, siempre recoja los medios lentamente desde una esquina de la placa deslizante de la cámara, y desde un punto externo fuera de los platos de Petri 3D agarosa. Todos los medios se pueden almacenar a -20 oC para su uso con inmunoensayos u otros análisis posteriores (es decir, cuantificación de hormonas reproductivas secretadas o citoquinas).
  2. Después de 7 días en cultivo, utilice BM que contiene la hormona estimulante del folículo (concentración final 20 mIU/ml) y gonadotropina coriónica humana (concentración final 4,5 UI/ml). Esto se aplica a todos los tipos de cultivo organoide.
  3. Imagen rutinaria de todos los cultivos organoides (es decir, imágenes de lapso de tiempo) para caracterizar la formación de organoides y cuantificar las métricas de autoensamble, desarrollo y crecimiento a lo largo del tiempo.

5. Colección organoide

NOTA: Todos los organoides se pueden fijar con un 4% de paraformaldehído en PBS para el inmunoetiquetado aguas abajo y los análisis histológicos. Fijar durante 2 h a temperatura ambiente con rotación, o durante la noche a 4 oC.

  1. Para cultivos libres de ECM 2D, primero enjuague la muestra con PBS fresco y, a continuación, agregue fijador directamente en la parte superior de las construcciones adheridas.
  2. Para los métodos de cultivo ECM (2D y 3D), enjuague una vez con PBS y, a continuación, agregue fijador directamente en la parte superior de la muestra ECM-organoid (para fijar el gel ECM y organoides juntos), o alternativamente, pipetee suavemente los organoides hacia arriba y hacia abajo para liberarlos del ECM circundante, y transfiera a un tubo separado para su fijación.
  3. Para el cultivo libre de ECM 3D, pipetee suavemente los organoides hacia arriba y hacia abajo dentro del recreo central de la placa de agarosa 3D Petri; esto eliminará los organoides facilitando su fácil recolección con una pipeta. A continuación, transfiera organoides a un tubo separado para su fijación.
  4. Antes de procesar en parafina, incorporar muchos organoides (≥ 20) dentro de un pequeño volumen (30 l) de gel de procesamiento de tejido; esto ayuda a orientar y concentrar organoides en un área pequeña dentro de bloques de parafina, facilitando la observación al seccionar y facilitar la identificación visual dentro de secciones de parafina.
    NOTA: Los organoides pueden ser difíciles de identificar después de la incrustación y sección de parafina sobre un microtoma.

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Results

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La generación de organoides se consideró infructuosa si las células testiculares no se autoensamblaban dentro de 72 h de cultivo, sin embargo, todos los métodos presentados aquí se ensamblan dentro de las 24 h cuando se utilizan células murinas juveniles (5 dpp). Fallo de la generación de construcción biológica presentada como una continuación de células suspendidas libremente (columna de 0 h en la Figura 1) incluso después del cultivo extendido (72 h). En ausencia de autoensamble de tejido,...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Con la finalización de este protocolo de generación de organoides, el usuario tendrá cuatro técnicas de cultivo diferentes disponibles para ensamblar construcciones testiculares y organoides en entornos libres de ECM o ECM. Es importante destacar que los cuatro métodos permiten al investigador observar no invasivamente el autoensamble organoide a lo largo del tiempo a través de imágenes de lapso de tiempo o grabación de vídeo, y recopilar de forma no invasiva medios condicionados para el análisis de hormonas y citoquinas...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano (NICHD) F31 HD089693, el Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental / Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 y 4UH3ES029073-03, y el Profesor Memorial de Thomas J. Watkin.

Los autores quieren agradecer a Eric W. Roth por su ayuda con la microscopía electrónica de transmisión. Este trabajo hizo uso de las instalaciones de BioCryo del Centro NUANCE de la Universidad Northwestern, que ha recibido el apoyo del Recurso Experimental de Nanotecnología Suave e Híbrida (SHyNE) (NSF ECCS-1542205); el programa MRSEC (NSF DMR-1720139) en el Centro de Investigación de Materiales; el Instituto Internacional de Nanotecnología (IIN); y el estado de Illinois, a través del IIN. También hizo uso del equipo CryoCluster, que ha recibido apoyo del programa de RMN (NSF DMR-1229693). Los gráficos de la Figura 1 se diseñaron con BioRender.com.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 mmm Filtros estériles de mediosMillipore Sigmascgpu05rePara medios de filtrado estériles
3 y beta; Anticuerpo primario HSDCosmo Bio CoK0607Marcador de células de Leydig, dilución 1:500
AlexaFluor 568 α-RatónThermo Fisher ScientificA-21202Anticuerpo secundario marcado con fluorescencia
AlexaFluor 568 α-RabbitThermo Fisher ScientificA10042Anticuerpo secundario marcado con fluorescencia
Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific11-095-080Base de medios de cultivo
Colagenasa IWorthington Bio LS004197Para solución de disociación 1
Corning Matrigel Membrane Matrix, sin LDEVCorning354234Matriz extracelular utilizada para la fundición de geles de cultivo ECM 2D y 3D
Countess Contador de células ThermoFisher ScientificC10227Contador de células automático (máquina hematómetro)
Portaobjetos para cámara de recuento de células CountessThermo Fisher ScientificC10228Portaobjetos de hemacitómetro para uso con contador automatizado Countess
Anticuerpo primario DDX4Abcam138540Marcador de espermatogonia, dilución 1:500
Desoxirribonucleasa I (2.280 u/mgDW)Worthington BioLS002140Para solución de disociación 1
DPBS 1X, + CaCl + MgClThermo Fisher Scientific14040182Para reconstituir la hialuronidasa
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco +Ca/+MgThermo Fisher Scientific14040117PBS
Embryo Grade H2OMIlliporeSigma W1503Para reconstituir la colagenasa I y la dnasa I
Suero fetal bovinoThermo Fisher Scientific16000044Para enfriar soluciones de disocación de enzimas
Folículo hormona estimulanteAbcamab51888Para el cultivo de organoides a largo plazo
Gonadotropina coriónica humanaMillipore SigmaC1063Para el cultivo de organoides a largo plazo
Hialuronidasa, de testículos bovinosMillipore SigmaH4272Para solución de disociación 2
Ensayo de inmunoabsorción enzimática de inhibina BELISA AL-107de Ansh Labs Inhibina B
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828-028Fuente de suero para medios basales
MicroTissues Placa de Petri 3D Micro-mold Spheroids (24-35, matriz 5x7)Millipore SigmaZ764051para la fabricación de organoides sin ECM en 3D
Nunc, sistema de portaobjetos de cámara Lab Tek II, 4 pocillosThermo Fisher Scientific12-565-7para cultivo de ECM 3D sin ECM 2D
Penicilina/EstreptomicinaThermo Fisher Scientific15-140-122Antibiótico para medios de comunicación
Richard-Allan Scientific; Histogel, Gel de procesamiento de muestrasThermo Fisher ScientificHG-4000-012Para ayudar a la inclusión de parafina en el
anticuerpo primario SOX9Millipore SigmaAB5535Sertoli Marker, dilución 1:500
Tedklad Global Mouse Chow (Criador)Teklad Global2920Alimento para ratones sin fitoestrógenos
Tedklad Global Mouse Chow (Mantenimiento)Teklad Global2916Alimento para ratones sin fitoestrógenos
Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas de testosteronaCalbiotechTE373SKit ELISA de testosterona Solución azul
tripano, 0,4 %Thermo Fisher Scientific15250061Para el recuento de células
αAnticuerpo primario SMAMillipore SigmaA2547Marcador peritubular, dilución 1:500
y beta; Anticuerpo primario de cateninaBD Biosciences610154marcador de citoplasma de Sertoli, dilución 1:100
Kit de

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