Los métodos modificados para la carga de placas de extracción de ADN de alto rendimiento reducen el potencial de contaminación

Summary

Los métodos actuales para la carga de placas de 96 pozos para extracciones de ADN pueden ser propensos a la contaminación. Detallamos un nuevo método para cargar placas de 96 pozos que reduce el riesgo de contaminación cruzada entre pozos. Nuestro método ayudará a otros investigadores a capitalizar la eficiencia de las técnicas de extracción de ADN de alto rendimiento y minimizar el riesgo de contaminación.

Abstract

Las técnicas de secuenciación de ADN de alto rendimiento han contribuido sustancialmente a los avances en nuestra comprensión de las relaciones entre las comunidades microbianas, las características del huésped y las funciones más amplias del ecosistema. Con este rápido aumento en la amplitud y profundidad de las capacidades de secuenciación han llegado métodos para extraer, amplificar, analizar e interpretar el ADN ambiental con éxito con la máxima eficiencia. Desafortunadamente, realizar extracciones de ADN rápidamente puede venir a costa de aumentar el riesgo de contaminación entre las muestras. En particular, las extracciones de alto rendimiento que se basan en muestras contenidas en una placa de 96 pozos ofrecen un método relativamente rápido, en comparación con las extracciones de un solo tubo, pero también aumentan las oportunidades de contaminación cruzada bien a pozo. Para minimizar el riesgo de contaminación cruzada entre muestras, conservando al mismo tiempo los beneficios de las técnicas de extracción de alto rendimiento, desarrollamos un nuevo método para cargar muestras ambientales en placas de 96 pozos. Usamos películas de sellado de PCR perforables para cubrir cada placa mientras cargamos muestras y agregamos muestras primero a los tubos de PCR antes de moverlas a pozos; juntos, estas prácticas reducen el riesgo de deriva de la muestra y la doble carga no intencionada de pozos. El método descrito en este artículo proporciona a los investigadores un enfoque para maximizar las técnicas de extracción de alto rendimiento disponibles y, al mismo tiempo, reducir el riesgo de contaminación cruzada inherente a las placas de 96 pozos. Proporcionamos un esquema detallado paso a paso de cómo pasar de la recolección de muestras a la extracción de ADN, minimizando al mismo tiempo el riesgo de contaminación cruzada no deseada.

Introduction

Los recientes avances en la secuenciación de alto rendimiento de las comunidades microbianas están proporcionando una profundidad de secuenciación sin precedentes y, en consecuencia, una visión poco preciada del funcionamiento y la diversidad del microbioma de la Tierra¹. A medida que aumenta la capacidad de multiplexar más y más muestras en un solo carril de secuenciación, la extracción de ADN de un solo tubo tiene el potencial de convertirse en un paso de limitación de velocidad en la generación de datos ecológicos. Sin embargo, los nuevos métodos en extracciones de ADN de alto rendimiento prometen el procesamiento de grandes cantidades de muestras ambientales con mayor eficiencia de la que ha sido posible^{anteriormente 2}. Estos métodos a menudo implican el uso de placas de 96 pozos en lugar de tubos individuales, aumentando así el número posible de extracciones que pueden ocurrir simultáneamente. Como tal, la practicidad y eficiencia de los métodos de extracción de alto rendimiento son evidentes y se han implementado para el procesamiento de muestras ambientales que van desde el suelo^3,4 y los tejidos vegetales^3,5 a la materia fecal humana².

Si bien estos métodos pueden acelerar drásticamente el procesamiento de muestras y la extracción de ADN, el paso inicial de cargar el suelo y otras muestras ecológicas en placas de 96 pozos es susceptible a la contaminación de la muestra cruzada. Este tipo de contaminación a pozo puede ocurrir durante las extracciones de ADN^6,7,8, y los pozos son particularmente vulnerables en este primer paso antes de que las muestras se suspenden en una solución tampón. 9 demuestran un⁹ método para cargar suelos de rizosfera en placas de 96 pozos utilizando embudos y cubiertas de tiras de PCR de 8 pozos, pero si bien su método es un enfoque más controlado para las placas de carga, todavía proporciona una amplia oportunidad para la contaminación de los pozos vecinos al cargar cada muestra. Además, los pozos abiertos permiten la posibilidad de que un investigador distraído coloque una muestra en el pozo incorrecto o agregue una muestra a un pozo que ya se ha cargado. Además, una variedad de tipos de muestras resultan ser poco adecuadas para la carga con este método; las muestras húmedas a menudo se pegan a los embudos y las muestras secas "saltan" entre los pozos debido a la electricidad estática.

Para reducir las oportunidades de contaminación entre pozos en el primer paso de las extracciones de ADN de alto rendimiento, desarrollamos un nuevo enfoque para cargar muestras de suelo en placas de 96 pozos. Nuestros métodos protegen los pozos de la exposición ambiental y nos impiden cargar accidentalmente varias muestras en un pozo (doble carga). Creemos que el método reportado a continuación ofrece la promesa de reducir el potencial de contaminación y como tal proporciona un medio más controlado para cargar placas de 96 pozos para la extracción posterior del ADN.

Protocol

1. Banco de laboratorio y preparación de herramientas para cargar una placa de 96 pozos

1. Despeje la parte superior del banco al nebar la niebla con el 70% de etanol. Limpie y deje secar al aire antes de rociar la parte superior del banco con 10% de lejía. Limpie la parte superior del banco.
2. Esterilice la micro-scoopula, la espátula y las tijeras quirúrgicas (curvadas) sumergiéndose en etanol al 95% y luego exponga a una llama. Sumerja cada uno en 10% de lejía y deje secar al aire antes de usarlo.
   NOTA: Las herramientas deben esterilizarse entre cada muestra.

2. Submuestreo y preparación de muestras

1. Esterilice los guantes con etanol antes del submuestreo.
2. Homogeneizar las muestras de suelo a fondo antes de la submuestreo.
3. Con herramientas esterilizadas, cargue un tubo centrífugo de 2 ml etiquetado con la muestra hasta aproximadamente la mitad de lleno.
4. Repita el paso 2.2 hasta que las 95 muestras hayan sido submuestradas en tubos centrífugos de 2 ml etiquetados. El^pozo 96 debe utilizarse como una extracción en blanco.
   NOTA: Los pasos 2.3 y 2.4 se realizan para minimizar el espacio de almacenamiento necesario y evitar el muestreo excesivo o doble.
5. Almacene tubos de submuestra de 2 ml sobre hielo hasta que se cargue la placa.
6. Etiqueta 96 tubos de PCR estériles de 200 l de tapa plana A1-u2012A12, B1-u2012B12, .... H1-u2012H12. Coloque estos tubos en orden en un bastidor de 96 pozos.
7. Asigne un identificador de muestra con una ubicación de pozo (A1-u2012H12) y regístrelo.

3. Preparación de placas

1. Retire la cubierta de goma de la placa de 96 pozos (Figura 1A–1C) y colóquela en una bolsa de plástico estéril (ver Tabla de materiales). Selle la bolsa de plástico para evitar la contaminación.
2. Cubra la placa de 96 pozos con película de sellado (Figura 1D–1E); por ejemplo, utilice una película de sellado perforable precortado (véase la Tabla de materiales). Asegurar el sello rodando con un rodillo de goma.
   NOTA: Las alfombrillas de silicona perforables podrían ofrecer potencialmente una opción reutilizable, proporcionando una limpieza adecuada entre los usos, pero las esteras de silicona que probamos se dividen fácilmente a lo largo de las perforaciones y no ofrecerían la misma protección a las siguientes placas.
3. Coloque la placa en el frigorífico (4oC) para mantener la mente fresca.

4. Transferencia de subsesc muestras

NOTA: Consulte el paso 4.13 para ver las modificaciones cuando la muestra de suelo es muy pequeña.

1. Coloque 24 de las subsondas de 2 ml en un bloque de hielo para almacenamiento en frío.
2. Usando el nombre de la muestra y la hoja de ubicación del pozo, elija el tubo de PCR de tapa plana de 200 l correcto.
3. Tome un tubo de submuestra de 2 ml y un vórtice durante 5 s para garantizar la homogeneización.
4. El uso de herramientas esterilizadas con llama y lejía se carga 200 ml de la primera muestra en el tubo de PCR de tapa plana correcto (Figura 1F).
5. Repita los pasos 4.2-u20124.4 hasta que se hayan cargado las 24 muestras. A continuación, vaya al paso 4.6.
6. Con una toallita de papel sumergida en lejía, limpie el exterior del tubo de PCR de tapa plana de 200 l.
7. Invierta el tubo y toque en el banco para mover la muestra a la parte superior del tubo. Con tijeras blanqueadas y esterilizadas con llama, sujete la parte inferior del tubo PCR para crear una abertura para que la muestra caiga en la placa de 96 pozos(Figura 1G).
8. Localice el pozo correcto en una placa de 96 pozos y pase el tubo a través de la placa con el extremo cortado hacia arriba hasta llegar a ese pozo. Incline ligeramente la placa para facilitar la punción de la película de sellado perforable precortado, y sólo cuando el tubo está directamente por encima del pozo correcto cuidadosamente invertirlo para que la punta cortada encaje en el pozo. Usando herramientas esterilizadas, toque la parte superior del tubo PCR hasta que todo el suelo haya caído del tubo en el pozo. Deje el tubo dentro del pozo con la tapa cerrada (Figura 1H–1J).
9. Retire un tubo pcR de 200 l de tapa plana a la vez y agregue 750 ml de solución de perlas a ese pozo(Figura 1K). Empuje el tubo de PCR de tapa plana de 200 l hasta el pozo y marque la parte superior con sharpie para indicar que este pozo se ha cargado. Repita esto para cada muestra.
10. Una vez que se hayan cargado las 24 muestras y añadido la solución de perlas, retire los tubos de submuestra de 2 ml y sustitúyalos por 24 tubos sin muestrear.
11. Repita los pasos 4.1-u20124.10 hasta que los 95 pozos se hayan cargado con la muestra o en blanco y solución de perlas. Retire los tubos sin pasarlos sobre pozos abiertos(Figura 1L).
12. Retire cuidadosamente la película perforable y reemplace la cubierta de goma para proteger la placa hasta el inicio de la extracción(Figura 1M–1O).
13. Para cantidades muy pequeñas de tierra que también son de grano fino, agregue 750 s de solución de perlas al tubo de muestra y utilice una punta de pipeta de diámetro ancho para transferir todo el contenido al pozo adecuado. Coloque el tubo PCR en la abertura para evitar la doble carga.
    NOTA: Tenga cuidado al implementar esta modificación, ya que la materia orgánica de partículas o pequeños fragmentos de roca más grandes que el agujero de la punta de la pipeta pueden obstruir la pipeta y dificultar la transferencia de la suspensión de la muestra.
14. Según sea necesario, congele a -20 oC y almacene las placas cargadas con la solución de la muestra y el cordón hasta la extracción planificada.

5. Comparación de los métodos de carga de placas

NOTA: Para verificar nuestro novedoso método para la carga de placas de extracción de ADN de 96 pozos, dividimos una sola placa de 96 pozos en tres secciones. Utilizamos tres métodos diferentes de carga de placas para comparar el potencial de carga involuntaria del suelo y la contaminación cruzada. Los tres métodos que utilizamos fueron los métodos descritos en McPherson et al.⁹, el protocolo de carga predeterminado¹⁰de Qiagen y el protocolo que describimos en esta publicación.

1. Carga de tierra en la placa
   1. Seccione una placa de 96 pozos en tres bloques de cuatro columnas. Cargue cada bloque utilizando uno de los tres métodos mencionados anteriormente.
   2. Cargue el suelo en cada otro pozo para que la muestra y los pozos en blanco se tambalee. Esta disposición permite la máxima oportunidad para la carga involuntaria de muestras y la contaminación cruzada.
   3. Congele la placa de 96 pozos a -20 oC hasta la extracción de ADN.
2. Extracción de ADN
   1. Extraiga ADN según el protocolo de extracción de placas de 96 pozos¹⁰del fabricante.
   2. Conservar los extractos de ADN a -20 oC hasta su posterior análisis.
3. Cuantificación del ADN en pozos en blanco
   1. Descongelar extractos de ADN a temperatura ambiente, vórtice y girar hacia abajo usando un spinner de placa.
   2. Mida y registre las concentraciones de ADN de pozos en blanco utilizando un espectrofotómetro.
   3. Utilice la prueba post-hoc de ANVOA y Tukey para analizar las diferencias en la concentración media de ADN en pozos en blanco.
      NOTA: Se notificaron diferencias significativas en el valor de 0,05.

Results

Este novedoso método se utilizó con éxito para cargar placas de extracción de ADN de 96 pozos. La comparación de los métodos de carga de placas mostró que nuestro método tenía la concentración de ADN más baja en los pozos en blanco. La concentración de ADN en los pozos en blanco fue significativamente menor que el método propuesto mi McPherson et al.⁹ (p < 0.05), aunque las concentraciones de ADN en nuestro método no eran estadísticamente diferentes del método predeterminado Qiagen (

Discussion

Este método reduce las oportunidades de contaminación cruzada bien a pozo mientras se cargan placas de extracción de muestras de alto rendimiento y ofrece un medio más controlado para cargar placas de 96 pozos más allá de las estrategias de carga de placas existentes^9,,10. La contaminación entre pozos puede ser más generalizada en extracciones de placas de 96 pozos que en extracciones de un solo tubo, especialmente cuando se^{automatizan 6}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
WhirlPak	Nasco	B01065
de 2 mL de	Fisherbrand	05-408-129
200 y micro; L tubos de micro-PCR	Thermo Scientific	AB 2000
Kit de extracción de ADN PowerSoil de 96 pocillos	Qiagen	12955-4	Usamos un kit de extracción de suelo, pero cualquier kit de formato de 96 pocillos funcionaría.
Bloque de hielo para tubos de centrífuga de 2 mL	Cualquier		bloque de hielo hecho para tubos de 2 mL funcionará
Bloque de hielo para 200 µ L tubos de micro-PCR	Cualquiera	Cualquiera	Cualquier bloque de hielo hecho para 200 y micro; Los tubos en L funcionarán
Micro scoopula	Cualquiera	Cualquiera Película
de sellado perforable precortada	Excel Scientific	XPS25
Espátula	Cualquiera	Cualquier
tijeras quirúrgicas	Cualquier	Cualquiera