Uso De Las Neuronas Del Hipocampo Cultivadas Primarias Para Estudiar El Ensamblaje De Los Segmentos Iniciales Axón

Resumen

Aquí, se describe un protocolo para estudiar cuantitativamente el montaje y la estructura de los segmentos iniciales de axones (AIS) de las neuronas del hipocampo que carecen de AIS pre-montado debido a la ausencia de una anquiria gigante-G.

Resumen

Los segmentos iniciales de axones neuronales (AIS) son sitios de iniciación de potenciales de acción y han sido ampliamente estudiados por su estructura molecular, ensamblaje y plasticidad dependiente de la actividad. Ankyrin-G gigante, el organizador principal de AIS, asocia directamente con el voltaje membrana-que atraviesa el sodio bloqueado (VSVG) y los canales del potasio (KCNQ2/3), así como el neurofascin 186 del kDa, una molécula de la adherencia de célula de L1CAM. Ankyrin-G gigante también ata a y recluta las moléculas citoplásmicas de AIS incluyendo beta-4-spectrin, y las proteínas microtubule-obligatoria, EB1/EB3 y Ndel1. Ankyrin-G gigante es suficiente rescatar la formación de AIS en neuronas deficientes de ankyrin-G. Ankyrin-G también incluye una isoforma más pequeña de 190 kDa situada en las espinas dendríticas en vez del AIS, que es incapaz de apuntar al AIS o de rescatar el AIS en neuronas ankyrin-G-deficientes. Aquí, se describe un protocolo utilizando neuronas del hipocampo cultivadas de ANK3-E22/23-flox ratones, que, cuando se transfecta con Cre-BFP exhiben la pérdida de toda la isoforma de la anquirina-G y deteriorar la formación de AIS. Combinado un sistema modificado de glía de Banker / neurona co-cultivo, hemos desarrollado un método para transfectar ankyrin-G neuronas nulas con un 480 kDa ankyrin-G-GFP plásmido, que es suficiente para rescatar la formación de AIS. Además, empleamos un método de cuantificación, desarrollado por Salzer y sus colegas para hacer frente a la variación en la distancia AIS de los cuerpos celulares neuronales que se produce en los cultivos de neuronas del hipocampo. Este protocolo permite realizar estudios cuantitativos del ensamblaje de novo y del comportamiento dinámico del AIS.

Introducción

El segmento inicial del axón se encuentra en el axón proximal en la mayoría de las neuronas vertebradas. Funcionalmente, AIS es donde se inician los potenciales de acción debido a la alta densidad de canales de sodio bloqueados por voltaje en esta región. Los AIS de algunas neuronas excitatorias también son atacados por interneuronas inhibitorias a través de la formación de sinapsis GABAérgicas^1,2,3. Por lo tanto, AIS es un sitio crítico para integrar la señalización celular y modular la excitabilidad de las neuronas. AIS es normalmente 20-60 μm de longitud y situado dentro d....

Protocolo

NOTA: Este método de cultivo de neuronas del hipocampo de ratones postnatales de 0 días ANK3-E22/23^f/f está adaptado del sistema de co-cultivo de glía/neurona de Gary Banker. Por lo tanto, es fundamental realizar todos los pasos después de la disección en una campana limpia utilizando herramientas esterilizadas. Este protocolo tarda hasta 1 mes. El flujo de trabajo se muestra en la figura 3. El protocolo sigue las pautas animales de la Universidad de Duke.

1. Preparación de cubrebocas y platos de chapado neuronal

1. Al menos una semana antes del día de cultivo, cargue los cubrebocas e....

Resultados

Un conjunto completo de experimentos debe incluir la transfección de Cre-BFP solamente como control negativo, Cre-BFP más la co-transfección de ankyrin-G de 480 kDa como control positivo y una condición no transfectada como control de la técnica. En el control sólo de Cre-BFP, las neuronas transfectadas carecen de la acumulación de marcadores AIS, incluyendo anquirina-G (ankG), beta4-espectrina (β4), neurofascina (Nf) y canales de sodio bloqueados por voltaje (VSVG) (Figura 4A)

Discusión

El montaje de AIS está organizado por 480 kDa ankyrin-G. Sin embargo, la anquirona-G tiene isoformas más cortas que pueden apuntar al AIS de las neuronas de tipo salvaje, lo que puede conducir a la dificultad en la interpretación de los análisis de estructura-función del ensamblaje de AIS. Aquí presentamos un método utilizando neuronas de ratones ANK3-E22/23-flox que permite el estudio del ensamblaje de novo del AIS. Al transfectar con Cre-BFP a 3 div, eliminamos todas las isoformas endógenas de la anq.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10xHBSS	Thermo Fisher Scientific	14065-056
18mm cubreobjetos (1.5D)	Fisher Scientific	12-545-84-1D
190kDa ankyrin-G-GFP	Addgene	#31059
2.5% Tripsina sin rojo fenol	Thermo Fisher Scientific	14065-056
480kDa ankyrin-G-GFP	hecho en laboratorio	Proporcionar a pedido
ANK3-E22/23f/f ratones	JAX	Nº de inventario: 029797	B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;
B27 Complemento alimenticio sin sérum	Thermo Fisher Scientific	A3582801
Ácido bórico	Sigma-Aldrich	B6768
Filtro de células con malla de 70 mm	BD Biosciences	352350
Cubreobjetos cerámicos	Thomas Scientific	8542E40
Cre-BFP	Addgene	#128174
D-Glucosa	Sigma-Aldrich	G7021
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995073
Suplemento GlutaMAX-I	Thermo Fisher Scientific	A1286001
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668030
MEM con Earle' Sales de S y L-glutamina	Thermo Fisher Scientific	11095-080
Medio Neurobasal	Thermo Fisher Scientific	21103-049
Ácido nítrico 70%	Sigma-Aldrich	225711
Opti-MEM I Medio de suero reducido	Thermo Fisher Scientific	31985062
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	P6148
Penicilina-estreptomicina	Thermo Fisher Scientific 15140122
Clorhidrato de poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	26124-78-7
Hidróxido de potasio	Sigma-Aldrich	1310-58-3