Metilización Específica Multiplex Droplet PCR usando el Dispositivo Generador de Gotas de Polímero para Diagnóstico Hematológico

Summary

Los marcadores epigenéticos se utilizan para la subtipificación de glóbulos blancos (CMB) mediante la cuantificación de los patrones de metilación del ADN. Este protocolo presenta un método de reacción en cadena de la polimerasa de gotas múltiples (mdPCR) utilizando un dispositivo microfluídico basado en elastómero termoplástico (TPE) para la generación de gotas que permite la cuantificación objetivo precisa y múltiplex específica de metilación de los recuentos diferenciales del CMB.

Abstract

Se describe un flujo de trabajo de PCR de gotas multiplexadas (mdPCR) y un protocolo detallado para determinar el recuento diferencial de glóbulos blancos basados en epigenéticos (WBC), junto con un dispositivo de generación de gotas microfluídicas de elastómero termoplástico (TPE). Los marcadores epigenéticos se utilizan para la subtipificación del CMB que tiene un importante valor pronóstico en diferentes enfermedades. Esto se logra mediante la cuantificación de los patrones de metilación del ADN de regiones específicas ricas en CG en el genoma (CpG loci). En este artículo, el ADN tratado con bisulfito de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se encapsula en gotas con reactivos mdPCR, incluyendo imprimaciones y sondas fluorescentes de hidrólisis específicas para loci CpG que se correlacionan con subpoblaciones WBC. El enfoque multiplex permite el interrogatorio de muchos loci de CpG sin necesidad de reacciones de mdPCR separadas, lo que permite una determinación paramétrica más precisa de las subpúmedas del CMB mediante el análisis epigenético de sitios de metilación. Esta cuantificación precisa se puede extender a diferentes aplicaciones y destaca los beneficios para el diagnóstico clínico y el pronóstico posterior.

Introduction

El análisis de la composición de los glóbulos blancos (CMB) se encuentra entre las pruebas de laboratorio solicitadas con mayor frecuencia en diagnóstico hematológico. El recuento diferencial de leucocitos sirve como un indicador para un espectro de enfermedades incluyendo infección, inflamación, anemia, y leucemia, y está bajo investigación como un biomarcador de pronóstico temprano para varias otras condiciones, así. El estándar de oro en la subtipificación del CMB implica inmunostaining y/o citometría de flujo, que requieren costosos anticuerpos fluorescentes propensos a la inestabilidad y a menudo dependen en gran medida de la competencia del operador en la prepar....

Protocol

Todos los experimentos realizados en este estudio con muestras humanas fueron aprobados por la Junta de ética del NRC y se realizaron de acuerdo con las políticas de NRC que rigen a los sujetos humanos que siguen las pautas de investigación aplicables y cumplen con las leyes de Quebec, Canadá.

1. Preparación celular

1. Descongelar las células mononucleares de sangre periférica humana congelada (PBMC) inmediatamente colocando el criovial en un baño de agua a 37 oC durante 5 min.
2. Invierta el criovial dos veces para resuspender suavemente las células y el uso de una pipeta de 1 ml transfiera la suspensión celular a un tubo cón....

Results

El dispositivo generador de gotas microfluídicas basado en TPE se fabricó utilizando el protocolo descrito como se muestra en la Figura 1. Se utilizó una máscara de transparencia en la fotolitografía para obtener el maestro del silicio (Si). La litografía suave se realizó para obtener una réplica inversa de PDMS del maestro Si que luego se utilizó para fabricar el molde epoxi. El precursor de epoxi se vertió en el PDMS y se curó para reticularse y endurecerse. Este molde, que representa la r.......

Discussion

El protocolo experimental y los métodos presentados permiten el mdPCR interno utilizando un generador de gotas TPE fabricado, un ciclor térmico y un microscopio de fluorescencia. El dispositivo fabricado que utiliza TPE suave a la unión TPE ofrece propiedades de superficie hidrófoba que son uniformes en todas las paredes del canal, de manera que el dispositivo final no requiere ningún tratamiento superficial para su uso posterior como generador de gotas. Este material se ha empleado rutinariamente en plataformas de punto.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Rad, Mississauga, ON	TFI0201	tubo
RAN Biotechnologies, Beverly, MA	008-FluoroSurfactante	Fluoro-surfactante
Silicon Quest International, Santa Clara, CA
Oxford Instruments, Abingdon, Reino Unido		Cámara
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MA5-16728
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	22-8425-71
CellProfiler		Se utiliza para el análisis
Nikon, Japón		10x
(ATCC), Manassas, VA	PCS-800-011
Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)	p/n 200-U1
Fisher, Canadá
Vitrocom, NJ, EE. UU	5015 y 5010	Tubo
(http://definetherain.org.uk/)
Hamamatsu, Japón	LC-L1V5	DEL Fuente
Dolomita	3200063	Tubo
Dolomita	3200302	Tubo
IDT, Coralville, IA
Nikon, Melville, NY		Microscopio
Cytec Industries, Woodland Park, NJ
EV Group, Schä rding, Austria
Zymo Research, Irvine, CA	D5030
Photron, San Diego, CA
IDT, Coralville, IA
Gersteltec, Pully, Suiza		SU-8 photoresist
Fineline Imaging, Colorado Springs, CO
Qiagen, Hilden, Alemania
Imagen J		Se utiliza para evaluar el diámetro
Anachemia, Montreal, QC
Excelitas, MA, EE. UU		Lámpara
Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC	DE1010
Hexpol TPE, Å må l, Suecia		Elastómero termoplástico (TPE)
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	13-400-518
Nikon, Japón		Se utiliza para la adquisición
3M, St Paul, MN		Carrier Oil
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	R37605	Tinción de células vivas fluorescente azul (DAPI)
IDEX Salud & Science, Oak Harbor, WA	P-881	Accesorios de
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	806552
Dow Corning, Midland, MI
ThinkyUSA, CA, EE. UU	ARV 310
Ihc world, Maryland, EE. UU.	IW-125-0
Zinsser NA, Northridge, CA	2607808
Cetoni GmbH, Korbussen, Alemania
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	484431
Bio-Rad, Mississauga, ON	1861096
Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON
Nikon, Melville, NY		Microscopio
Nikon, Japón
Loctite	AA 352