Artículo de método
Los marcadores epigenéticos se utilizan para la subtipificación de glóbulos blancos (CMB) mediante la cuantificación de los patrones de metilación del ADN. Este protocolo presenta un método de reacción en cadena de la polimerasa de gotas múltiples (mdPCR) utilizando un dispositivo microfluídico basado en elastómero termoplástico (TPE) para la generación de gotas que permite la cuantificación objetivo precisa y múltiplex específica de metilación de los recuentos diferenciales del CMB.
Se describe un flujo de trabajo de PCR de gotas multiplexadas (mdPCR) y un protocolo detallado para determinar el recuento diferencial de glóbulos blancos basados en epigenéticos (WBC), junto con un dispositivo de generación de gotas microfluídicas de elastómero termoplástico (TPE). Los marcadores epigenéticos se utilizan para la subtipificación del CMB que tiene un importante valor pronóstico en diferentes enfermedades. Esto se logra mediante la cuantificación de los patrones de metilación del ADN de regiones específicas ricas en CG en el genoma (CpG loci). En este artículo, el ADN tratado con bisulfito de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se encapsula en gotas con reactivos mdPCR, incluyendo imprimaciones y sondas fluorescentes de hidrólisis específicas para loci CpG que se correlacionan con subpoblaciones WBC. El enfoque multiplex permite el interrogatorio de muchos loci de CpG sin necesidad de reacciones de mdPCR separadas, lo que permite una determinación paramétrica más precisa de las subpúmedas del CMB mediante el análisis epigenético de sitios de metilación. Esta cuantificación precisa se puede extender a diferentes aplicaciones y destaca los beneficios para el diagnóstico clínico y el pronóstico posterior.
El análisis de la composición de los glóbulos blancos (CMB) se encuentra entre las pruebas de laboratorio solicitadas con mayor frecuencia en diagnóstico hematológico. El recuento diferencial de leucocitos sirve como un indicador para un espectro de enfermedades incluyendo infección, inflamación, anemia, y leucemia, y está bajo investigación como un biomarcador de pronóstico temprano para varias otras condiciones, así. El estándar de oro en la subtipificación del CMB implica inmunostaining y/o citometría de flujo, que requieren costosos anticuerpos fluorescentes propensos a la inestabilidad y a menudo dependen en gran medida de la competencia del operador en la prepar....
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Todos los experimentos realizados en este estudio con muestras humanas fueron aprobados por la Junta de ética del NRC y se realizaron de acuerdo con las políticas de NRC que rigen a los sujetos humanos que siguen las pautas de investigación aplicables y cumplen con las leyes de Quebec, Canadá.
1. Preparación celular
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El dispositivo generador de gotas microfluídicas basado en TPE se fabricó utilizando el protocolo descrito como se muestra en la Figura 1. Se utilizó una máscara de transparencia en la fotolitografía para obtener el maestro del silicio (Si). La litografía suave se realizó para obtener una réplica inversa de PDMS del maestro Si que luego se utilizó para fabricar el molde epoxi. El precursor de epoxi se vertió en el PDMS y se curó para reticularse y endurecerse. Este molde, que representa la r.......
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El protocolo experimental y los métodos presentados permiten el mdPCR interno utilizando un generador de gotas TPE fabricado, un ciclor térmico y un microscopio de fluorescencia. El dispositivo fabricado que utiliza TPE suave a la unión TPE ofrece propiedades de superficie hidrófoba que son uniformes en todas las paredes del canal, de manera que el dispositivo final no requiere ningún tratamiento superficial para su uso posterior como generador de gotas. Este material se ha empleado rutinariamente en plataformas de punto.......
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No hay conflictos que declarar.
Los autores reconocen el apoyo financiero del Consejo Nacional de Investigación de Canadá.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Bio-Rad, Mississauga, ON | TFI0201 | tubo | |
| RAN Biotechnologies, Beverly, MA | 008-FluoroSurfactante | Fluoro-surfactante | |
| Silicon Quest International, Santa Clara, CA | |||
| Oxford Instruments, Abingdon, Reino Unido | Cámara | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MA5-16728 | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-8425-71 | ||
| CellProfiler | Se utiliza para el análisis | ||
| Nikon, Japón | 10x | ||
| (ATCC), Manassas, VA | PCS-800-011 | ||
| Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) | p/n 200-U1 | ||
| Fisher, Canadá | |||
| Vitrocom, NJ, EE. UU | 5015 y 5010 | Tubo | |
| (http://definetherain.org.uk/) | |||
| Hamamatsu, Japón | LC-L1V5 | DEL Fuente | |
| Dolomita | 3200063 | Tubo | |
| Dolomita | 3200302 | Tubo | |
| IDT, Coralville, IA | |||
| Nikon, Melville, NY | Microscopio | ||
| Cytec Industries, Woodland Park, NJ | |||
| EV Group, Schä rding, Austria | |||
| Zymo Research, Irvine, CA | D5030 | ||
| Photron, San Diego, CA | |||
| IDT, Coralville, IA | |||
| Gersteltec, Pully, Suiza | SU-8 photoresist | ||
| Fineline Imaging, Colorado Springs, CO | |||
| Qiagen, Hilden, Alemania | |||
| Imagen J | Se utiliza para evaluar el diámetro | ||
| Anachemia, Montreal, QC | |||
| Excelitas, MA, EE. UU | Lámpara | ||
| Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC | DE1010 | ||
| Hexpol TPE, Å må l, Suecia | Elastómero termoplástico (TPE) | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 13-400-518 | ||
| Nikon, Japón | Se utiliza para la adquisición | ||
| 3M, St Paul, MN | Carrier Oil | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R37605 | Tinción de células vivas fluorescente azul (DAPI) | |
| IDEX Salud & Science, Oak Harbor, WA | P-881 | Accesorios de | |
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 806552 | ||
| Dow Corning, Midland, MI | |||
| ThinkyUSA, CA, EE. UU | ARV 310 | ||
| Ihc world, Maryland, EE. UU. | IW-125-0 | ||
| Zinsser NA, Northridge, CA | 2607808 | ||
| Cetoni GmbH, Korbussen, Alemania | |||
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 484431 | ||
| Bio-Rad, Mississauga, ON | 1861096 | ||
| Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON | |||
| Nikon, Melville, NY | Microscopio | ||
| Nikon, Japón | |||
| Loctite | AA 352 |
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