Cuantificación del virus de la rabia en varias estructuras cerebrales bovinas

Resumen

Este protocolo presenta un enfoque basado en qRT-PCR para determinar el número de copia genética de nucleoproteína (N) del virus de la rabia dentro de varias estructuras anatómicas cerebrales bovinas utilizando transcripción in vitro.

Resumen

La rabia paralítica bovina (BPR) es una forma de encefalitis viral que tiene una importancia económica sustancial en toda América Latina, donde representa un riesgo zoonótico importante. Aquí, nuestro objetivo era utilizar un protocolo de laboratorio para determinar el número de copia relativa del genoma del virus de la rabia (RABV) en diferentes estructuras anatómicas cerebrales bovinas utilizando la reacción cuantitativa en cadena de transcripción inversa en tiempo real (qRT-PCR). qRT-PCR cuantifica el número específico de copias genéticas presentes en una muestra basada en la fluorescencia emitida después de la amplificación que es directamente proporcional a la cantidad de ácido nucleico objetivo presente en la muestra. Este método es ventajoso debido a su corta duración, menor riesgo de contaminación y potencial para detectar ácidos nucleicos virales en diferentes muestras más fácilmente en comparación con otras técnicas. Los cerebros de seis animales rabiosos se dividieron en seis estructuras anatómicas, a saber, el cuerno, el cerebelo, la corteza, la medulla, los pons y el tálamo del Ammón. Todos los cerebros fueron identificados como positivos para los antígenos RABV basados en una prueba directa de inmunofluorescencia. También se evaluaron las mismas estructuras anatómicas del cerebro de cuatro bovinos negativos de RABV. El ARN se extrajo de cada estructura y se utilizó para qRT-PCR. Se realizó un ensayo para determinar el número de copias de genes RABV utilizando un gen de nucleoproteína transcrita in vitro. La curva estándar utilizada para cuantificar el ARN viral mostró una eficiencia del 100% y linealidad de 0,99. El análisis reveló que la corteza, la medulla y el tálamo eran las porciones ideales del SNC para su uso en la detección rabv, basándose en la observación de que estas estructuras poseían los niveles más altos de RABV. La especificidad de la prueba fue del 100%. Todas las muestras fueron positivas, no se detectaron falsos positivos. Este método se puede utilizar para detectar RABV en muestras que contienen bajos niveles de RABV durante el diagnóstico de BPR.

Introducción

La rabia puede ser confirmada ante mortem y post mortem por diversas técnicas que permiten la detección de ácidos nucleicos virales en el cerebro, la piel, la orina o la saliva^1. La detección del gen de la nucleoproteína del virus de la rabia(N)se utiliza principalmente para el diagnóstico de rabia mediante pruebas moleculares. Este gen también se utiliza para el genotipado viral. La rabia se puede diagnosticar en animales utilizando cualquier porción del cerebro afectado; sin embargo, para excluir la posibilidad de rabia, tejido de al menos dos regiones en el cerebro debe ser probado². Existen....

Protocolo

Este estudio fue aprobado y realizado de acuerdo con las recomendaciones para el uso de animales proporcionadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) del Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA).

1. Muestras

1. Utilice diferentes áreas del cerebro diseccionadas de 6 cerebros bovinos diferentes positivo para el análisis RT-PCR.

2. Anticuerpos fluorescentes directos (ADF) para confirmar la rabia

NOTA: La detección del antígeno antirrábico por DFA es un método cualitativo para determinar la presencia de la nucleopro....

Resultados

Los resultados de DFA mostraron positividad del 100%, 100%, 83,3%, 66% y positividad del 50% para RABV en la corteza, tálamo, medulla, pons y cuerno, respectivamente. Estos resultados confirmaron los resultados anteriores, y al menos tres de las estructuras diseccionadas de cada cerebro fueron positivas para RABV. En la Figura 1se muestra una tinción DAF positiva representativa.

La Figura 2 muestra la amplificación de un fragmento del.......

Discusión

Estudios anteriores han demostrado que DFA sólo puede detectar RABV dentro de los siete días posteriores a la lectura de la muestra a temperatura ambiente (21 °C)¹⁴. Por el contrario, este trabajo demostró que la sensibilidad de RT-PCR comienza a disminuir después de que las muestras han estado expuestas a la temperatura ambiente durante 12 días. Por lo tanto, el genoma rabv puede ser detectado por qRT-PCR en muestras expuestas a temperatura ambiente durante un tiempo de hasta 23 días. Esto demues.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cloroformo	SIGMA	C7559	Facilita la recuperación de la fase acuosa de las PCR que han sido recubiertas con aceite mineral.
ADN Limpio & Concentrador-500	Zimo	D4031	El ADN Limpio & El concentrador-500 (DCC-500) está diseñado para la purificación rápida y de gran formato y la concentración de hasta 500 & g de ADN de alta calidad procedente de muestras que incluyen digestiones de endonucleasas de restricción a gran escala y preparaciones de ADN impuro.
Etanol	Amresco	193-500	Purificación de ácidos nucleicos Kit de sistema de
PCR de alta fidelidad FastStart, dNTPack	Roche	3553400001	Enzima de alta fidelidad para la amplificación de productos de PCR evitando cambios aleatorios de base
GelDoc XR	BioRad	XR+	Analiza geles de proteínas y ADN de mayor tamaño
GelRed	Biotium	41003	Se trata de una nueva generación de tinciones en gel de ácidos nucleicos, que poseen nuevas características químicas diseñadas para minimizar la posibilidad de que los tintes interactúen con los ácidos nucleicos de las células vivas.
Gradiente del termociclador iCycler	BioRad	582BR	La temperatura se puede monitorear y controlar mediante el algoritmo del instrumento, la sonda en la muestra o los modos de bloque de muestra
Sondas universales iTaq Kit de un solo paso	BioRad	1725141	Mezcla de reacción para realizar reacciones de PCR en tiempo real utilizando sondas de hibridación tipo TaqMan
Alcohol isopropílico	Amresco	0918-500	Precipitación de ácidos nucleicos
Kit de extracción de gel QIAquick	Qiagen	28706	Los kits QIAquick contienen un conjunto de membrana de sílice para la unión del ADN en tampón con alto contenido de sal y elución con tampón con bajo contenido de sal o agua. El procedimiento de purificación elimina cebadores, nucleótidos, enzimas, aceite mineral, sales, agarosa, bromuro de etidio y otras impurezas de las muestras de ADN
M-MLV Transcriptasa inversa	Invitrogen	28025-021	La transcriptasa inversa del virus de >la leucemia murina de Moloney (M-MLV RT) utiliza ARN o ADN monocatenario en presencia de un cebador para sintetizar una cadena < ADN complementaria.
Espectrofotómetro de microvolumen	NanoDrop 2000	Thermo-Scientific	ND2000
cebador Oligo(dT)18	Invitrogen	SO132	El cebador oligo (dT)18 es un oligonucleótido sintético monocatenario de 18 meros con extremos 5' y 3'-hidroxilo.
Kit de sistemas de producción de ARN a gran escala RiboMAX SP6 y T7	Promega	P1300	reacciones de transcripción in vitro se utilizan para sintetizar cantidades de microgramos de sondas de ARN a partir de plantillas de ADN recombinante. La mayoría de las reacciones de transcripción diseñadas para generar sondas de ARN están optimizadas para maximizar la incorporación de ribonucleótidos radiomarcados en lugar de producir grandes cantidades de ARN
ADN polimerasa Taq	Invitrogen	#EP0402	La ADN polimerasa Taq es una ADN polimerasa altamente termoestable de la bacteria termófila Thermus aquaticus. La enzima cataliza 5' y 3' síntesis de ADN
15596026	El reactivo TRIzol	es	un reactivo completo, listo para usar, diseñado para el aislamiento de ARN total de alta calidad o el aislamiento simultáneo de ARN, ADN y proteínas de una variedad de muestras biológicas.

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