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Artículo de método

Cuantificación del virus de la rabia en varias estructuras cerebrales bovinas

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DOI:

10.3791/61429

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22 de mayo de 2021

 ,  ,  , 
1Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA), INIFAP, 2Campus Toluca, Universidad del Valle de México, 3Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro

En este artículo

Resumen

Este protocolo presenta un enfoque basado en qRT-PCR para determinar el número de copia genética de nucleoproteína (N) del virus de la rabia dentro de varias estructuras anatómicas cerebrales bovinas utilizando transcripción in vitro.

Resumen

La rabia paralítica bovina (BPR) es una forma de encefalitis viral que tiene una importancia económica sustancial en toda América Latina, donde representa un riesgo zoonótico importante. Aquí, nuestro objetivo era utilizar un protocolo de laboratorio para determinar el número de copia relativa del genoma del virus de la rabia (RABV) en diferentes estructuras anatómicas cerebrales bovinas utilizando la reacción cuantitativa en cadena de transcripción inversa en tiempo real (qRT-PCR). qRT-PCR cuantifica el número específico de copias genéticas presentes en una muestra basada en la fluorescencia emitida después de la amplificación que es directamente proporcional a la cantidad de ácido nucleico objetivo presente en la muestra. Este método es ventajoso debido a su corta duración, menor riesgo de contaminación y potencial para detectar ácidos nucleicos virales en diferentes muestras más fácilmente en comparación con otras técnicas. Los cerebros de seis animales rabiosos se dividieron en seis estructuras anatómicas, a saber, el cuerno, el cerebelo, la corteza, la medulla, los pons y el tálamo del Ammón. Todos los cerebros fueron identificados como positivos para los antígenos RABV basados en una prueba directa de inmunofluorescencia. También se evaluaron las mismas estructuras anatómicas del cerebro de cuatro bovinos negativos de RABV. El ARN se extrajo de cada estructura y se utilizó para qRT-PCR. Se realizó un ensayo para determinar el número de copias de genes RABV utilizando un gen de nucleoproteína transcrita in vitro. La curva estándar utilizada para cuantificar el ARN viral mostró una eficiencia del 100% y linealidad de 0,99. El análisis reveló que la corteza, la medulla y el tálamo eran las porciones ideales del SNC para su uso en la detección rabv, basándose en la observación de que estas estructuras poseían los niveles más altos de RABV. La especificidad de la prueba fue del 100%. Todas las muestras fueron positivas, no se detectaron falsos positivos. Este método se puede utilizar para detectar RABV en muestras que contienen bajos niveles de RABV durante el diagnóstico de BPR.

Introducción

La rabia puede ser confirmada ante mortem y post mortem por diversas técnicas que permiten la detección de ácidos nucleicos virales en el cerebro, la piel, la orina o la saliva1. La detección del gen de la nucleoproteína del virus de la rabia(N)se utiliza principalmente para el diagnóstico de rabia mediante pruebas moleculares. Este gen también se utiliza para el genotipado viral. La rabia se puede diagnosticar en animales utilizando cualquier porción del cerebro afectado; sin embargo, para excluir la posibilidad de rabia, tejido de al menos dos regiones en el cerebro debe ser probado2. Existen varios métodos de diagnóstico para la detección de la rabia en animales; sin embargo, la prueba directa de inmunofluorescencia sigue siendo la técnica de referencia estándar3. Otras pruebas incluyen pruebas biológicas que incorporan inoculación del ratón, infección en el cultivo de tejidos y reacción en cadena de la polimerasa (PCR)4. Todas estas técnicas son recomendadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) para el diagnóstico de rabia en humanos y animales, respectivamente5.

Las técnicas de detección y amplificación de ácidos nucleicos han revolucionado el diagnóstico de la rabia en los últimos años6 y estas técnicas desempeñan un papel importante en el diagnóstico ante mortem de la rabia humana. Se han evaluado varias pruebas basadas en PCR para complementar las pruebas convencionales para diagnósticos de rabia ante mortem y post mortem 7,8,9,10. La mayoría de los ensayos apuntan al gen de la nucleoproteína viral de la rabia para la amplificación, que es la región más conservada en el genoma viral1,11. En los últimos 20 años, se han desarrollado varios ensayos moleculares para diagnosticar rabv, y algunos de estos ensayos se han utilizado para la caracterización del virus. La mayoría de los ensayos tienen como objetivo detectar genes conservados dentro del genoma viral, más comúnmente mediante el uso de ensayos convencionales o cuantitativos de reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (qRT-PCR)12,13.

La PCR es una técnica diagnóstica altamente sensible que puede detectar el genoma de un patógeno dado dentro de los tejidos, incluso cuando estos tejidos están descompuestos. Utilizando enfoques basados en PCR, se pueden detectar cantidades mínimas de un agente infeccioso en una muestra clínica a través de la amplificación selectiva y repetitiva de una secuencia de nucleótidos de ADN14. qRT-PCR que incorpora sondas fluorescentes (por ejemplo, TaqMan) o tintes de unión al ADN (por ejemplo, SYBR Green) se ha utilizado en ensayos para diagnosticar RABV tanto ante- como post- mortem con alta sensibilidad; sin embargo, este enfoque requiere equipo especializado. Para superar esta limitación, se ha sugerido la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP), basada en su bajo costo, simplicidad y características deseables para la detección de RABV. Este ensayo es particularmente importante, ya que puede utilizarse en los países en desarrollo15.

qRT-PCR se basa en la detección y cuantificación de una molécula, donde los aumentos de señal fluorescente son en proporción directa a la cantidad de producto PCR en una sola reacción. A medida que aumenta el número de copias del objetivo de ácido nucleico, también lo hace la fluorescencia. Los tintes intercalantes no específicos, como el tinte de unión al ADN verde SYBR o las sondas de oligonucleótido específicas de la secuencia que transportan un fluoróforo y un quencher, se utilizan comúnmente para proporcionar la lectura fluorescente en qRT-PCR. Este ensayo ofrece ventajas sobre rt-PCR convencionales que incluyen un tiempo de prueba más corto (2-4 h), menor riesgo de contaminación debido al sistema de tubo cerrado (falta de manipulación post-PCR de productos amplificados), y la capacidad de detectar diferentes objetivos simultáneamente16. qRT-PCR se puede utilizar para diagnosticar la rabia ante mortem a partir de saliva y otras muestras. Este ensayo también se puede utilizar como una prueba universal en tiempo real para la detección de diferentes especies de Lyssavirus o linajes de RABV15. En este enfoque rt-pcr combinado, se utilizan dos reacciones. El primero detecta diferentes linajes genéticos de RABV, y el segundo detecta la especie Lyssavirus. Ambos pasos implican ensayos qRT-PCR, donde el primero utiliza sondas de hibridación y el segundo utiliza tintes15. Debido al gran número de pruebas que han demostrado una detección molecular exitosa de RABV utilizando esta técnica, el actual Manual Terrestre de la OIE (2018) recomienda el uso de PCR para la detección molecular de RABV17.

México es un país con un considerable potencial ganadero. Los estados con mayor producción ganadera contienen regiones tropicales húmedas y regiones secas que están en riesgo de brotes de rabia debido a la presencia del murciélago vampiro Desmodus rotundus, el principal transmisor de la rabia. Por lo tanto, es esencial desarrollar más herramientas para la prevención y control de la rabia paralítica bovina (BPR) en México. Basándose en esto, el objetivo de este estudio era utilizar qRT-PCR cuantitativo para determinar el número de partículas virales en diferentes estructuras anatómicas de cerebros bovinos después de la muerte debido a la infección por rabia.

Seis cerebros obtenidos de bovinos positivos de RABV fueron donados por un laboratorio externo para su uso en el desarrollo del protocolo qRT-PCR descrito a continuación. Las muestras de estructura cerebral bovina fueron transportadas en cadena fría a la instalación BSL-2 del laboratorio CENID-MA del INIFAP y almacenadas a -80 °C hasta su uso. Los cerebros fueron obtenidos de animales de los estados de Campeche, Yucatán y Querétaro. Antes del recibo, varias estructuras fueron diseccionadas del cerebro. Estas estructuras incluían el cuerno del Ammón, cerebelo, corteza, medulla, pons y tálamo18,19. El material genético fue extraído como se describe a continuación. Se confirmó el diagnóstico de RABV utilizando anticuerpos fluorescentes directos (DFA)20. Como control positivo, se utilizaron cerebros de ratón que fueron inoculados con RABV21. Además, se utilizaron cuatro cerebros de ganado negativos de RABV (según lo determinado por DFA) como controles negativos.

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Protocolo

Este estudio fue aprobado y realizado de acuerdo con las recomendaciones para el uso de animales proporcionadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) del Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA).

1. Muestras

  1. Utilice diferentes áreas del cerebro diseccionadas de 6 cerebros bovinos diferentes positivo para el análisis RT-PCR.

2. Anticuerpos fluorescentes directos (ADF) para confirmar la rabia

NOTA: La detección del antígeno antirrábico por DFA es un método cualitativo para determinar la presencia de la nucleoproteína de la rabia utilizando anticuerpos etiquetados con fluoresceína. La prueba se realizó utilizando el protocolo proporcionado por Dean et al. (1966)20, como se describe a continuación.

  1. Haga dos impresiones de cada tejido diseccionado de diferentes estructuras cerebrales en un deslizamiento estéril de aproximadamente 15 mm de diámetro. Utilice un aplicador de madera para untar una porción de aproximadamente 3 mm3 del tejido en el tobogán estéril. Para crear el frotis, presione suavemente el aplicador de madera contra el tobogán manualmente.
  2. Corrija las diapositivas de frotis de muestra sumergiendo las diapositivas en acetona 100% durante 1 h a -20 °C. Después de la incubación, seque los toboganes en un paño seco a 21 °C durante 30 min.
  3. Añadir 50 μL del anticuerpo antinúcleoproteína etiquetado con fluoresceína a cada frotis cerebral a una dilución de 1:10 dispensando a través de una jeringa.
  4. Incubar los toboganes con el conjugado en una cámara húmeda a 37 °C durante 1 h.
  5. Después de la incubación, lave los toboganes dos veces con agua y con PBS para eliminar el exceso de conjugar. Deje que las diapositivas se sequen a 21 °C. Borre cuidadosamente para eliminar el exceso de líquido y luego seque brevemente al aire antes del montaje.
  6. Agregue una gota de 50% de glicerina de fosfato para cubrir la superficie de la sección, y luego cubra con un coverlip. Observe las secciones bajo un microscopio de epifluorescencia a una ampliación de 40x.
    1. Procesar y observar los controles positivos y negativos (control positivo: cerebros de ratón inoculados con RABV; controles negativos: cerebros bovinos negativos rabv) de la misma manera que las muestras.

3. Generar un control positivo para RT-PCR

  1. Obtenga células BHK-21 del banco de germoplasma. Utilice celdas hasta el pasaje70 para replicar la cepa RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth (ERA) usando el pasaje 2.
  2. Mantener y propagar células BHK-21 en botellas que contengan un medio esencial mínimo (MEM) complementado con un 10% de suero de becerro fetal (FCS) a 37 °C en presencia de CO2 (5%) y en condiciones húmedas. Cultivar las células en frascos de cultivo de 25 cm2 hasta que alcancen el 80% de confluencia y luego la subcultura.
  3. Retire el medio de cultivo de las células y lave el frasco con solución salina tamponada de fosfato (PBS). Inocular la cultura con 105 TCID/mL de cepa RABV ERA. Incubar el inoculum viral durante 2 h bajo agitación constante a 37 °C en presencia de CO2 (5%) y en condiciones húmedas.
  4. Retire el medio de infección y agregue mem suplementado con 5% (bovino fetal sérico) SFB. Incubar durante 72 h a 37 °C en presencia de CO2 (5%) en condiciones húmedas.
  5. Cosecha RABV 3 días después de la inoculación cuando las células exhiben efectos citopáticos. Congele las células infectadas y luego descongelarlas a 4 °C para lilas. Recoge el medio de la botella y luego coloca las células en un tubo centrífuga para una centrifugación a 1.050 x g durante 10 min a 4 °C.
  6. Almacene los sobrenadantes de RABV a -80 °C y prepare alícuotas de trabajo para almacenarlos a -70 °C.
  7. Intracerebrally inocula el virus obtenido en el paso anterior en ratones CD1 hembra de 21 días de edad. Utilice una jeringa de 1 ml para inocular 50 μL de soluciones que contengan 106 MICLD50 (dosis letal de cultivo infeccioso del ratón 50 %) dosis en ratones22.

4. Extracción de ARN

NOTA: El ARN total se extrajo directamente de cerebros bovinos utilizando un método de extracción orgánica de acuerdo con el siguiente protocolo.

  1. Utilice 100 mg de tejido cerebral de cada estructura anatómica para extraer ARN total utilizando un reactivo disponible comercialmente que contiene isoticianato de guanidium.
  2. Homogeneizar manualmente un total de 100 mg de tejido de cada estructura en 1 ml del reactivo de isotiocyanato de guanidium mediante vórtice utilizando un homogeneizador Dounce con un pequeño pestle dentro del microtubo durante 15 s a máxima velocidad.
  3. Incubar las muestras en hielo durante 5 min, y luego añadir 200 μL de cloroformo. Mezcle las muestras vigorosamente durante 15 s, incubar en hielo durante 2 a 3 minutos y luego centrífuga a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
  4. Transfiera la fase acuosa a un tubo limpio y agregue 500 μL de alcohol isopropílico. Incubar las muestras durante 15 min a 21 °C.
  5. Centrífuga las muestras a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante acuoso por pipeteo. El ARN aislado estará presente como pellet en el tubo.
  6. A continuación, lave el pellet de ARN con 1 ml de etanol al 75% por pipeteo y centrífuga a 7500 x g durante 5 minutos a 4 °C.
  7. Decantar el sobrenadante y secar al aire el pellet de ARN a temperatura ambiente (21 °C). A continuación, diluya el pellet en 50 μL de agua libre de nucleasa.
  8. Determine la concentración y la calidad del ARN a 260 nm utilizando un espectrofotómetro. Almacene el ARN a -80 °C hasta su uso.
  9. Retire el ADN de las muestras de ARN por digestión con DNase I. Añadir 2 U de DNase I por 1 μg de ARN extraído en el paso anterior. A continuación, agregue 5 μL de búfer de reacción de 10x y luego incuba a 37 °C durante 30 min. Inactivar la DNase I añadiendo 1 μL de EDTA a la mezcla seguida de incubación durante 10 min a 65 °C.

5. síntesis de cDNA y PCR

  1. Sintetizar cDNA de primera fila usando oligo dT y transcriptasa inversa. Por cada 1 μg de ARN, agregue 1 μL de oligo DT (500 μg/mL), 1 μL de mezcla dNTP de 10 mM y agua destilada sin nucleasa a un volumen final de 12 μL. Incubar la mezcla a 65 °C durante 5 min.
  2. Enfríe la mezcla de reacción a 4 °C. Centrífuga el tubo durante 30 s a 1.050 x g,y luego agregue 4 μL de amortiguador de reacción, 2 μL 0,1 M TDT y 1 μL de inhibidor de la ribonucleasa (40 U/μL).
  3. Incubar la mezcla de reacción a 37 °C durante 2 min, y luego añadir 1 μL de transcriptasa inversa (200 U). A continuación, incubar la mezcla de reacción durante 50 min a 37 °C, y luego inactivar la reacción a 70 °C durante 15 min.
  4. Almacene el cDNA a -20 °C antes de su uso.
    NOTA: Para verificar la calidad del cDNA sintetizado, realice la amplificación de un fragmento de 761 bp del gen RABV N antes de realizar la síntesis in vitro. Utilice el protocolo descrito por Loza-Rubio et al.11 como se describe en el paso 5.5 a continuación.
  5. Realice PCR utilizando taq DNA polymerasa en las siguientes condiciones. Realice la reacción configurada de la siguiente manera: 10x tampón Taq que contiene 20 mM MgCl2,0,2 mM dNTPs, 1 U Taq polimerasa, 10 μM de cada imprimación (SuEli+: 5′ cgtrgaycaatatgagtaca 3′ y SuEli-: 5′ caggctcraacattcttctta 3′), 2,5 μL de cDNA, y agua ultrapura a un volumen final de 50 μL.
  6. Realice la amplificación en un termociclo utilizando las siguientes condiciones de ciclismo: 95 ° C durante 3 min; 35 ciclos de 95 ° C para 30 s, 60 ° C para 30 s, y 72 ° C durante 1 min; un ciclo de 72 °C durante 7 min.
  7. Evaluar la presencia de los productos PCR de 761 bp utilizando un gel de agarose del 1%.

6. Transcripción in vitro

NOTA: La transcripción in vitro genera ARNM de un gen objetivo. Utilice un par de imprimación que amplíe el gen COMPLETO RABV N y uno que se utilice como control positivo para el ensayo qRT-PCR. Estas imprimaciones están diseñadas para amplificar el gen RABV N completo y para añadir un promotor que reconozca la polimerasa T7 (TAATACGACTCACTATAG).

  1. Para amplificar todo el gen N RABV, utilice las imprimaciones Trans-Nrab forward (5ʹ gatgagtcactcgaatatgtctt 3ʹ) y reversa (5ʹ caataatacgactcactatagggatggatgccgacaagatt 3ʹ) y un kit de PCR de alta fidelidad.
    1. Para cada reacción, prepare una mezcla maestra de PCR añadiendo a un búfer de reacción de tubo PCR limpio 10x, 2 mM DMSO, 25 mM MgCl2,10 mM dNTPs, 10 μM de cada imprimación, 0,5 U de polimerasa de alta fidelidad, 1,5 μL de cDNA (preparado en el paso 5) y agua ultrapura a un volumen final de 50 μL.
    2. Utilice un termociclo establecido en las siguientes condiciones de amplificación: 94 °C durante 1 min; 4 ciclos de 94 °C durante 1 min, 40 °C durante 1 min y 72 °C durante 2 min; 35 ciclos de 94 °C durante 1 min, 60 °C durante 1 min y 72 °C durante 2 min; extensión final de 72 °C durante 2 min.
  2. Para utilizar el producto PCR como plantilla para la síntesis in vitro y eliminar componentes de la reacción enzimática del paso 6.1.2, purifique el producto PCR utilizando un kit concentrador basado en columnas de acuerdo con las instrucciones del fabricante y, a continuación, cuantifique utilizando un espectrofotómetro.
  3. Para la síntesis de ARN, utilice un kit de transcripción in vitro con la siguiente mezcla de reacción: 5 μL T7 Transcripción 5x buffer, 1.9 μL de cada nucleótido de trifosfato, 10 μg de ADN purificado rabv N DNA VP2, y 2.5 μL de la mezcla enzimática. A continuación, incubar la mezcla a 37 °C durante 4 h. A continuación, añadir 1 μL de 1 U/μg RNase-Free DNase a la mezcla de reacción e incubar durante 15 min a 37 °C para eliminar la contaminación del ADN.
  4. Purifique el ARN transcrito in vitro y concentre el arne y luego concéntrelo usando fenol:cloroformo:alcohol isoamilo (25:24:1).
  5. Resuspend el pellet de ARN purificado en 70 μL de Tampón TE, y luego almacenar a -80 °C hasta su uso.
  6. Repita el protocolo PCR desde el paso 6.1 hasta obtener aproximadamente 5 μg de producto PCR. Después de la purificación y concentración, el ARNM del gen N transcrito in vitro estará presente a una concentración de 4.711 μg/μL.
  7. Confirme que el ARNm transcrito in vitro corresponde al gen N siguiendo el paso 5 de este protocolo y utilícelo como un control positivo para la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real (qRT-PCR).

7. Reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa en tiempo real (qRT-PCR)

  1. Para qRT-PCR, utilice una transcripción de ARNm in vitro que codifica el gen N completo como un control positivo junto con un kit comercial qRT-PCR de un solo paso utilizando sondas de hibridación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice la sonda y las imprimaciones descritas por Carneiro et al. (2010)23 para detectar una región conservada del gen RABV N (BRDesrot-Rev: 5′ aaactcaagagaaggccaacca 3′, BRDesrot-Fwd: 5′ cgtactgatgtggaagggaattg 3′, y BRDesrot-Probe: 5′-FAM-acaagggaccctactgtttcagagcatgc-3′-BHQ).
  2. Utilice las siguientes condiciones de ciclismo térmico: 1 ciclo de 50 °C durante 10 min y 95 °C durante 2 min; 40 ciclos de 95 °C para 15 s y 50 °C durante 30 s.

8. Curva de calibración o curva estándar

  1. Realice diluciones en serie del ARNm transcrito in vitro canalizando en serie 1 μg/μL de ARNm en tubos hasta que se obtengan seis diluciones de decuple. Prepare tubos a un volumen de 100 μL en triplicato para su uso en la creación de la curva estándar. Realice qRT-PCR como se describe en el paso 7.
  2. Realice qRT-PCR en un termociclo con un rotor procesando las diversas muestras cerebrales simultáneamente con las reacciones en ejecución para crear la curva estándar y utilizar controles positivos, controles negativos y sobrenautas aislados del cultivo celular.
  3. Para evaluar el límite de detección, eficacia de la prueba y sensibilidad de la prueba, utilice una curva estándar en triplicado en las mismas condiciones.

9. qRT-PCR de muestras biológicas

  1. Para la detección del gen RABV N, utilice el ARN a partir de muestras de campo, controles positivos, controles negativos y sobrenatantes de cultivo celular para realizar qRT-PCR utilizando el kit de PCR descrito en el paso 7.
  2. Para determinar el número de copias del genoma rabv presentes en las muestras cerebrales bovinas, obtenga datos de Tc de la curva estándar y muestras biológicas y de las interpoladas desde la ecuación de la curva de calibración.

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Resultados

Los resultados de DFA mostraron positividad del 100%, 100%, 83,3%, 66% y positividad del 50% para RABV en la corteza, tálamo, medulla, pons y cuerno, respectivamente. Estos resultados confirmaron los resultados anteriores, y al menos tres de las estructuras diseccionadas de cada cerebro fueron positivas para RABV. En la Figura 1se muestra una tinción DAF positiva representativa.

La Figura 2 muestra la amplificación de un fragmento del...

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Discusión

Estudios anteriores han demostrado que DFA sólo puede detectar RABV dentro de los siete días posteriores a la lectura de la muestra a temperatura ambiente (21 °C)14. Por el contrario, este trabajo demostró que la sensibilidad de RT-PCR comienza a disminuir después de que las muestras han estado expuestas a la temperatura ambiente durante 12 días. Por lo tanto, el genoma rabv puede ser detectado por qRT-PCR en muestras expuestas a temperatura ambiente durante un tiempo de hasta 23 días. Esto demues...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas, Forestales y Ganaderas (INIFAP). Agradecemos a Jerzayn Fraustro Esquivel su colaboración en el desarrollo del video asociado a este documento.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CloroformoSIGMAC7559Facilita la recuperación de la fase acuosa de las PCR que han sido recubiertas con aceite mineral.
ADN Limpio & Concentrador-500ZimoD4031El ADN Limpio & El concentrador-500 (DCC-500) está diseñado para la purificación rápida y de gran formato y la concentración de hasta 500 & g de ADN de alta calidad procedente de muestras que incluyen digestiones de endonucleasas de restricción a gran escala y preparaciones de ADN impuro.
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M-MLV Transcriptasa inversaInvitrogen28025-021La transcriptasa inversa del virus de >la leucemia murina de Moloney (M-MLV RT) utiliza ARN o ADN monocatenario en presencia de un cebador para sintetizar una cadena < ADN complementaria.
Espectrofotómetro de microvolumenNanoDrop 2000Thermo-ScientificND2000
cebador Oligo(dT)18InvitrogenSO132El cebador oligo (dT)18 es un oligonucleótido sintético monocatenario de 18 meros con extremos 5' y 3'-hidroxilo.
Kit de sistemas de producción de ARN a gran escala RiboMAX SP6 y T7PromegaP1300reacciones de transcripción in vitro se utilizan para sintetizar cantidades de microgramos de sondas de ARN a partir de plantillas de ADN recombinante. La mayoría de las reacciones de transcripción diseñadas para generar sondas de ARN están optimizadas para maximizar la incorporación de ribonucleótidos radiomarcados en lugar de producir grandes cantidades de ARN
ADN polimerasa TaqInvitrogen#EP0402La ADN polimerasa Taq es una ADN polimerasa altamente termoestable de la bacteria termófila Thermus aquaticus. La enzima cataliza 5' y 3' síntesis de ADN
 
15596026El reactivo TRIzolesun reactivo completo, listo para usar, diseñado para el aislamiento de ARN total de alta calidad o el aislamiento simultáneo de ARN, ADN y proteínas de una variedad de muestras biológicas.
Las

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