Microscopía de Fuerza Atómica y Confocal de Escaneo Láser Casi Simultánea (Conpokal) en Células Vivas

Joree  N. Sandin; Surya  P. Aryal; Thomas Wilkop; Christopher  I. Richards; Martha E. Grady

doi:10.3791/61433

Artículo de método

Microscopía de Fuerza Atómica y Confocal de Escaneo Láser Casi Simultánea (Conpokal) en Células Vivas

DOI:

10.3791/61433

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11 de agosto de 2020

Joree N. Sandin¹ , Surya P. Aryal² , Thomas Wilkop³^,⁴ , Christopher I. Richards²^,⁴ , Martha E. Grady¹

¹Department of Mechanical Engineering, University of Kentucky, ²Department of Chemistry, University of Kentucky, ³Department of Physiology, University of Kentucky, ⁴UK Light Microscopy Core, University of Kentucky

En este artículo

Resumen

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Aquí se presenta el protocolo de la técnica Conpokal, que combina la microscopía de fuerza confocal y atómica en una sola plataforma de instrumento. Conpokal proporciona la misma célula, misma región, cerca de imágenes confocales simultáneas y caracterización mecánica de muestras biológicas vivas.

Resumen

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Las técnicas disponibles para la caracterización mecánica a micro y nanoescala han explotado en las últimas décadas. Desde el desarrollo posterior del microscopio electrónico de escaneo y transmisión, hasta la invención de la microscopía de fuerza atómica y los avances en la imagen fluorescente, ha habido ganancias sustanciales en tecnologías que permiten el estudio de materiales pequeños. Conpokal es un acrónimo que combina microscopía confocal con microscopía de fuerza atómica (AFM), donde una sonda "golpea" la superficie. Aunque cada técnica es extremadamente eficaz para la colección de imágenes cualitativas y/o cuantitativas por sí solas, Conpokal proporciona la capacidad de probar con imágenes de fluorescencia mezcladas y caracterización mecánica. Diseñado para imágenes confocales casi simultáneas y sondeo de fuerza atómica, Conpokal facilita la experimentación en muestras microbiológicas en vivo. La visión añadida de la instrumentación emparejada proporciona la co-localización de propiedades mecánicas medidas(por ejemplo,módulo elástico, adherencia, rugosidad de la superficie) por AFM con componentes subcelulares o actividad observable a través de microscopía confocal. Este trabajo proporciona un protocolo paso a paso para el funcionamiento de la microscopía de fuerza atómica y confocal de escaneo láser, simultáneamente, para lograr la misma célula, misma región, imágenes confocales y caracterización mecánica.

Introducción

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Las herramientas de evaluación mecánica a micro o nanoescala a menudo se emplean para descubrir las características de deformación a nivel de célula única o microorganismo, mientras que se emplean herramientas de microscopía de alta resolución separadas para visualizar procesos subcelulares y características estructurales. Conpokal, es la combinación de microscopía confocal de escaneo láser y microscopía de fuerza atómica (AFM) en una sola plataforma instrumental. La técnica Conpokal se implementó por primera vez en un sistema de polímeros no biológicos, donde el objetivo era determinar la adhesión, elasticidad y tensión superficial de superficies duras en contacto con superficies blandas. Las imágenes confocales proporcionaron una representación visual de cómo el polímero se deforma, se adhiere y libera de la sonda dura¹^,². Desde polímeros hasta muestras biológicas, esta técnica ofrece la oportunidad de imágenes confocales de células vivas o microorganismos casi simultáneos y AFM.

Los cambios en la elasticidad celular se han implicado en la patogénesis de muchas enfermedades humanas³ incluyendo trastornos vasculares⁴Malaria⁵^,⁶, anemia de células falciformes⁷Artritis⁸Asma⁹, y el cáncer⁶^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵. Técnicas comunes para medir la mecánica de las células incluyen el uso de cuentas magnéticas¹⁶^,¹⁷, pinzas ópticas¹⁸^,¹⁹, aspiración de micropipeta⁸^,²⁰^,²¹^,²², y AFM¹¹^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶. Desde la aplicación de AFM a las células vivas, se ha adaptado fácilmente para caracterizar la topografía celular²⁷^,²⁸ así como propiedades mecánicas¹¹^,²⁴^,²⁹^,³⁰^,³¹ con precisión a nanoescala. AFM ha sido adaptado para microrheología³²^,³³, modulación de frecuencia³⁴^,³⁵, y creep²⁵^,³⁶^,³⁷ experimentos para estudiar las propiedades viscoelásticas de varias líneas celulares. El uso de un modelo de nanocontacto adecuado es fundamental para la extracción de valores cuantitativos de elasticidad a partir de mediciones de sangría por fuerza producidas por AFM¹^,². Los estudios de AFM que investigan la influencia de los fármacos citoesqueléticos en la elasticidad celular han demostrado que el módulo elástico está muy afectado³⁸. Sobre la base de las mediciones de módulo elástico, muchos investigadores han demostrado que las células cancerosas son más blandas que sus contrapartes no transformadas¹¹^,³⁸^,³⁹. El aumento de la deformabilidad probablemente desempeña un papel prominente en la capacidad de las células cancerosas para hacer metástasis e infiltrarse en los tejidos⁴⁰. Este comportamiento está regulado por modificaciones en la organización citoesquelética de las células³⁸^,⁴¹^,⁴². Además del cáncer, otra clase de enfermedades dependientes mecánicas son las enfermedades respiratorias. Por ejemplo, el síndrome de estrés respiratorio agudo afecta cada año a más y más seres humanos. Se ha demostrado que cuando los pacientes se ponen en ventilación mecánica, con altas concentraciones de oxígeno, su condición puede empeorar⁴³. En una serie de estudios que observan los macrófagos epiteliales alveolares con AFM, los científicos encontraron que la adición de un ambiente rico en oxígeno aumentó la rigidez de las células debido a la formación de actina; un excelente ejemplo del impacto que AFM tiene en nuestra comprensión detallada de la influencia ambiental atmosférica en la función respiratoria a nivel celular y, en última instancia, la curación y la salud humana⁴⁴^,⁴⁵^,⁴⁶. La rigidez celular epitelial durante la migración hacia una herida también se puede evaluar a través de AFM y que se produce una variación en el módulo elástico para indicar la propagación futura de la célula⁴⁷^,⁴⁸. Por lo tanto, existe una necesidad práctica de medir cuantitativamente la mecánica celular para entender cómo las células enfermas difieren de las sanas e interactuar con ellos.

AFM también se utiliza para estudiar las propiedades adhesivas y la estructura de la superficie. Un microscopio de fuerza atómica tiene una variedad de modos para recopilar información sobre una muestra utilizando mecánicas de contacto. Para las muestras biológicas vivas, dos de los objetivos principales son obtener valores cuantitativos de propiedades mecánicas(por ejemplo,módulos elásticos, fuerzas adhesivas), así como la altura de la superficie del mapa. Estos modos incluyen el modo de roscado (también conocido como contacto intermitente), que mantiene una amplitud en voladizo constante que se pone en contacto intermitentemente con la superficie de la muestra y el modo de contacto, lo que eleva o baja el voladizo para mantener una desviación constante^49. Los mapas de adhesión se pueden recopilar mediante la asignación de fuerza en el sistema AFM. El voladizo sangra la muestra a una fuerza determinada y luego se retrae. La retracción de resistencia a la fuerza es medida por el detector para generar un gráfico de fuerza-desplazamiento. La fuerza de adhesión es la fuerza máxima medida durante la retracción. La morfología superficial proporciona una vista detallada de la muestra en el nivel micro o nano. El voladizo completa un escaneo ráster a través de la muestra basado en la sangría y la desviación capturadas por el movimiento del voladizo en cada píxel, revelando entidades de tamaño micro y nano. Con AFM, se puede medir el tamaño de pequeñas características como la estructura peptidoglycan^50,la alineación de la cadena de^{polímeros 51,}la flagela^52,lamellipodia⁵³y la filipodia^54. Mientras que la potencia de AFM se encuentra en curvas de desplazamiento de fuerza e imágenes topológicas no ópticas, la microscopía confocal ofrece imágenes detalladas de muestras con etiqueta fluorescente.

La microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) es una técnica dominante para la toma de imágenes de células vivas, células fijas y tejidos^55,^56,^57. CLSM se ha empleado para la imagen biológica desde 1955, es decir,desde sus inicios^58,⁵⁹. Si bien el principio de funcionamiento de los microscopios confocales(es decir,el rechazo de la luz de foco a través de un agujero) ha permanecido en gran medida igual, la implementación técnica se ha vuelto muy diversa^56,^57,^58,^60. Las imágenes confocales se pueden implementar mediante escaneo multipunto, como en un sistema de disco giratorio^61,escaneo de puntos de un solo rayo láser, como en el escaneo en línea^62,o imágenes de la función de propagación de puntos con las reasignaciones de píxeles posteriores a través de un detector de múltiples elementos^57. Los avances recientes que amplían la utilidad de las imágenes confocales incluyen la capacidad de escaneo láser, la exploración por resonancia de alta velocidad y los detectores de alta sensibilidad^63,^64,^65. La ventaja que todos los sistemas confocales tienen sobre los microscopios de campo ancho es la capacidad de realizar secciones ópticas en el eje z con mayor detalle, especialmente en muestras gruesas. Los microscopios Widefield que utilizan la detección basada en cámara recogen la luz que se emite desde el plano focal y, simultáneamente, la luz emitida desde todas partes en la trayectoria de iluminación. Al cerrar el agujero, a costa de reducir la señal, tanto la resolución axial como la lateral se pueden aumentar⁶⁶. En CLSM, las imágenes se construyen píxel por píxel a través de la recopilación de señales de emisión a medida que se escanea un láser de excitación a través de un campo de visión x-y. La colección de varios planos x-y a lo largo del eje z de la muestra se puede utilizar para reconstruir la arquitectura tridimensional de la muestra⁵⁷^,⁶⁷. La microscopía confocal en conjunto con la introducción de proteínas fluorescentes, ha revolucionado nuestra comprensión de la biología celular^68. Por ejemplo, se ha convertido en una herramienta esencial en la neurociencia⁶⁹. El CLSM se utiliza regularmente para observar el tejido despejado, y para obtener imágenes completas del cerebro manchado inmune y la arquitectura de la red neuronal⁷⁰. Esta aplicación ha dado lugar a nuevos conocimientos sobre los contactos sinápticos y la comunicación entre las neuronas y las células gliales en el cerebro⁷¹. Desde células cerebrales hasta vesículas, los protocolos de tinción fluorescente apoyan la inspección y captura de funciones celulares a través de microscopía confocal para avances en técnicas terapéuticas^72,⁷³.

Aunque son herramientas impresionantes y versátiles individualmente, la combinación de microscopía de fuerza confocal y atómica (Conpokal) permite a los investigadores correlacionar de forma única las propiedades celulares/tejidos topográficas y micromecánicas con la observación de varios orgánulos celulares y sus respectivas dinámicas. La instrumentación emparejada permite a los usuarios, esencialmente, "ver" lo que están sondeando; una gran ventaja sobre una técnica por sí sola. Con Conpokal, el mapeo de fuerza a través de AFM se superpone en imágenes confocales para correlacionar la rigidez celular, la adhesión o la morfología con la estructura citoesquelética dentro de la muestra, por ejemplo. El objetivo general del método Conpokal es proporcionar una plataforma para que los investigadores estudien muestras vivas de una manera concisa y eficaz, proporcionando datos de propiedad de imagen y material en una sola plataforma. En este trabajo, demostramos el funcionamiento de Conpokal, incluyendo la selección y preparación adecuada de muestras, la configuración del instrumento, la calibración en voladizo y proporcionamos directrices para la solución de problemas exitosa. Después del protocolo, proporcionamos resultados representativos que incluyen el mapeo exitoso de la altura de las bacterias y células AFM, el mapeo de módulos AFM de bacterias y células, y la imagen confocal de células multietiquetas, a través de la confocal de la misma célula y AFM. Concluimos con una discusión de los pasos críticos del procedimiento Conpokal, recomendaciones de solución de problemas, limitaciones técnicas, significancia y perspectivas futuras para el método.

Protocolo

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1. Preparación de instrumentos, medios de cultivo, platos

Encienda las fuentes de alimentación tanto para el microscopio confocal como para el microscopio de fuerza atómica, así como para cualquier otro instrumento o dispositivo asociado utilizado durante Conpokal. Deje tiempo suficiente para que los instrumentos se equilibren térmicamente y se estabilicen antes de comenzar las mediciones. Típicamente, 1 h es suficiente.
Prepare una placa Limpia, aprobada por el sistema, con fondo de vidrio y llene medio llena, pero no más de dos tercios llena, con solución salina tamponada de fosfato (PBS), o líquido transparente similar. Este plato (denominado "plato de calibración") es independiente de los platos de muestra y se utilizará para localizar y calibrar el voladizo del microscopio de fuerza atómica (AFM).
NOTA: Es importante que el líquido sea transparente y tenga baja autofluorescencia para evitar cualquier interferencia con los espectros de fluorescencia. Se recomienda PBS porque imita el entorno biológico.
Preparar platos de muestra experimentales de tal manera que el líquido asociado haya llenado el plato al menos medio lleno. Si la muestra es fluorescente, asegúrese de que esté cubierta o en un lugar oscuro hasta que sea necesario. Limpie la parte inferior de todos los platos de vidrio con un limpiador de lentes y toallitas para lentes.
Cree carpetas de almacenamiento de datos para los discos duros confocales y AFM en los equipos.

2. Selección de células o microorganismos

Para crear una solución de stock de bacterias, inocular Streptococcus mutan bacterias, utilizando un bucle de inoculación, en 15 ml de levadura Todd Hewitt (THY) durante la noche (para fase exponencial) en una incubadora_{de 5% CO2.}
1 h antes de que se complete la incubación durante la noche, cubra los platos experimentales de muestra con 1 ml de solución de poli-l-lisina o lo suficiente para cubrir la porción de vidrio del plato con fondo de vidrio y dejar en el gabinete de bioseguridad durante 1 h. Después de la puesta en forma, aspirar solución de poli-l-lisina y enjuagar los platos 3x con PBS.
Después de 18 – 24 h de incubación bacteriana, inocular THY con 1 ml de suspensión bacteriana hasta que se alcance una densidad óptica de 0.6 – 0.7 (los valores típicos para la inoculación son 3 ml de THY con 1 ml de suspensión bacteriana por plato). Añadir 1 ml de nueva solución bacteriana a cada plato recubierto de poli-l-lisina e incubar durante 1 h. Durante los últimos 10 min, añadir 1 ml de mancha de membrana fluorescente verde (concentración de 1 m) a cada plato.
Enjuague cada plato 3x con PBS. Fije suavemente las bacterias con aproximadamente 1 ml de solución de paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente dentro de un gabinete de bioseguridad. Enjuague cada plato 3x con PBS después de la fijación.
Almacene las células del riñón embrionario humano (HEK) 293 en nitrógeno líquido. Realice un deshielo rápido a un baño de agua de 37 oC antes de encoar.
Añadir 1 ml de solución de matriz de membrana de sótano en medios de cultivo celular a cada plato de muestra celular e incubar (5% CO₂) a 37 oC durante 1 h. Aspirar la solución y lavar los platos con medios de cultivo celular. Plato el número requerido de HEK 293 células(por ejemplo,, 100.000 células por plato de 35 mm) y añadir 2 ml de medios de cultivo celular. A continuación, incubar (5% CO₂₎las células a 37 oC durante 48 h.
Después de 48 h, añadir 2 l de un tinte fluorescente de citoesqueleto de microtúbulo (concentración de 1x) a cada plato de muestra de célula e incubar durante 30 min. Aspirar la solución que contiene el tinte, lavar las células 3x con PBS y añadir 2 ml de medios de cultivo celular.
Añadir 1 l de tinte de membrana plasmática (concentración de 10 m) a los platos de muestra e incubar durante 30 minutos. Lavar la solución que contiene el tinte 3x con PBS y añadir 2 ml de medios de cultivo celular.
Contrarresta el núcleo añadiendo 1 l de un tinte de ácido nucleico (concentración de 10 m) solución a los platos de la muestra e incubar durante 30 min. Lavar la solución que contiene el tinte 3x con PBS y añadir 2 ml de medios de cultivo.

3. Procedimiento AFM

Abra el software operativo del microscopio de fuerza atómica (AFM) haciendo clic en el icono del software en el ordenador.
Gire o inserte un objetivo de aire de baja ampliación (recomendado 10x o 20x). Una larga distancia de trabajo de 5 mm o más es beneficiosa durante la reducción y calibración de la punta.
Monte la etapa de muestra de celda elegida si aún no está instalada. Para muestras en vivo, utilice un calentador de platos para mantener la muestra a la temperatura deseada.
Cargue el plato Petri limpio y aprobado por el sistema lleno medio lleno de PBS (preparado en el paso 1.2) o un líquido transparente similar (plato de calibración). Si la etapa de la muestra tiene cierres incorporados, utilice estos, de lo contrario, utilice grasa de vacío para estabilizar la muestra.
Seleccione un voladizo AFM adecuado para la recopilación de datos deseada e instálelo siguiendo los pasos que se indican a continuación.
1. Con guantes, monte el chip AFM en el bloque de vidrio utilizando la etapa de montaje de la viruta AFM, pinzas y un destornillador pequeño. Coloque cuidadosamente el chip AFM en el bloque de vidrio y oriente de manera que esté centrado. El voladizo, más una porción muy pequeña del chip AFM, debe estar en la parte visible y no opaca del bloque de montaje.
2. Fije el chip con el destornillador apretando el tornillo hasta que el chip esté ajustado contra el bloque de vidrio. Compruebe que el voladizo AFM está orientado correctamente mediante un microscopio estéreo o un reloj espía de mano. Ajuste según sea necesario. Una vez debidamente orientado, coloque el bloque de vidrio en el cabezal AFM en la orientación adecuada y enciérralo en su lugar.
  NOTA: La orientación del chip AFM dentro del bloque de vidrio es importante para que los láseres del sistema apunten a la parte posterior del voladizo y se reflejen correctamente en el fotodetector. Tenga cuidado de no apretar demasiado los tornillos durante la colocación, ya que este procedimiento podría hacer que el chip AFM, voladizo o punta se rompa.
Usando la opción brightfield del microscopio confocal, localice la parte inferior de la antena de calibración utilizando la perilla de enfoque. Tome nota de esta altura z como el valor donde se encuentra la parte inferior del plato con respecto al objetivo del microscopio.
Utilizando el panel de control del motor del sistema AFM en el ordenador que opera los motores paso a paso z, mueva el voladizo AFM lejos de la muestra hacia arriba 2000 m.
Con ambas manos, coloque suavemente la cabeza AFM con el chip AFM en la etapa de la muestra asegurándose de que cada uno de los puntos verticales de la cabeza de AFM estén firmemente establecidos en sus ranuras designadas en el escenario AFM. Una vez que la cabeza de AFM está en su lugar, vea visualmente lo cerca que está el soporte en voladizo del plato. Si parece estar demasiado cerca, de modo que el cabezal AFM esté en contacto o dentro de 1 mm de la parte superior de la bandeja de muestra, retroceda con los motores paso a paso z antes de bajar la punta AFM hacia la muestra.
Usando la iluminación de campo brillante, baje lentamente el chip AFM a la parte inferior de la placa de vidrio usando el panel de control del motor paso a paso z en el software AFM. Localice los micrómetros manuales que controlan el movimiento x-y o en plano de la cabeza AFM en la plataforma del instrumento. Ajuste la posición del voladizo AFM dentro del campo de visión corrigiendo la cabeza AFM a medida que el voladizo entra en vista.
1. Dado que la ubicación con respecto a la parte inferior del plato es desconocida en este momento, baje con pasos de 100 – 200 m para evitar chocar la punta AFM en el plato Petri. Típicamente, la punta necesita ser bajada 800 – 2000 m. A medida que se baja la punta, observe si una sombra aparece en la vista del software del microscopio, lo que indica que la punta de AFM se está acercando a la parte inferior del plato.
2. Disminuir los incrementos a 20 – 50 m. Asegúrese de ajustar las tablas de búsqueda (LUT) de la imagen de la cámara a medida que la punta se inclina en el plato utilizando el panel LUTs del software confocal. Continúe bajando la punta de AFM usando pequeños pasos hasta que esté principalmente en foco.
3. Asegúrese de que la punta esté lo suficientemente oscura para que la forma general de la misma se pueda ver y centrar en el campo de visión. Asegúrese también de que la punta aparece borrosa, lo que confirma que aún no ha encontrado la parte inferior del plato.
Ajuste el enfoque del microscopio de manera que la punta esté ahora enfocada, teniendo en cuenta la distancia de trabajo del objetivo. Antes de pasar a un objetivo de aumento más alto, utilice la herramienta de medición del microscopio para recoger el ancho y la longitud del voladizo AFM accediendo al panel de herramientas de medición en el software confocal. Tome nota de estas medidas.
NOTA: Es importante no estrellar el objetivo en la parte inferior del plato de muestra, lo que también puede hacer que el plato de muestra entre en contacto con la punta de AFM, lo que puede dañarlo.
Si está presente, retire el filtro de luz láser y asegúrese de que el láser AFM esté encendido, de modo que la luz láser sea visible en la óptica.
1. Usando los diales de alineación láser, mueva el láser al campo de visión y cerca de la punta AFM. Una vez que el láser esté en esta ubicación, reemplace el filtro de luz láser.
2. Usando los diales de alineación láser, coloque el láser en la parte posterior de donde se encuentra la punta AFM en el voladizo. En este punto, el panel de alineación láser debe estar leyendo una señal de suma superior a 0,0 V. Si no se obtiene ninguna señal de suma, ajuste el espejo utilizando el mando de espejo controlado manualmente hasta que se lea una señal de suma superior a 0,0 V en la pantalla.
3. Mueva el láser en pequeñas cantidades en todas las direcciones del voladizo AFM hasta que se alcance la señal de suma máxima, pero la posición está en la punta de AFM. Una vez ajustada la posición del láser, ponga a cero la desviación vertical y lateral utilizando los diales de desviación controlados manualmente.
4. Observe el panel de alineación láser en el software AFM y utilizando las perillas de desviación verticales y laterales en el cabezal AFM, alinee el detector de modo que el objetivo esté centrado (punto rojo en el centro del punto de mira) y no haya desviación vertical o lateral.
Abra la ventana de calibración en el software AFM. Introduzca toda la información específica del experimento. Antes de calibrar, apague la fuente de luz del microscopio confocal y cierre la carcasa AFM, si corresponde, para amortiguar cualquier ruido potencial proveniente de la luz de la habitación o de las vibraciones de la habitación. A continuación, pulse el botón de calibración para permitir automáticamente que el sistema calibra la punta. Una vez completada la calibración, la rigidez del voladizo (N/m) y su sensibilidad (nm/V) se proporcionarán dentro del panel de calibración. Tenga en cuenta estos para su análisis posterior.
Retirar el voladizo AFM al menos 2000 m con los motores paso a paso. Saque la cabeza AFM del escenario y retire la antena de calibración. Gire o inserte el objetivo deseado. Retirar el objetivo 10% de la distancia de trabajo si el sistema está programado para mantener el mismo plano focal entre objetivos. Si se trata de un objetivo de aceite, coloque una gota de aceite de inmersión en el ojo del objetivo.
NOTA: La retracción del objetivo reduce la probabilidad de que el objetivo entre en contacto con el plato de muestra durante la colocación.
Para mantener el plato de muestra de forma segura en su lugar, utilice un hisopo de algodón para aplicar pequeños toques de grasa al vacío alrededor del borde del anillo de muestra dentro de la etapa de la muestra, o utilice clips de muestra. Cargue cuidadosamente el plato de muestra en la etapa de muestra.
Una vez colocada la muestra, gírela varias veces para asegurar un buen sellado del plato al portacuchillas a través de la grasa. Elevar el objetivo hasta el fondo del plato hasta que el aceite se mecha sobre el ojo del objetivo.
Usando el microscopio, sin la cabeza de AFM en el escenario, enfoque el sistema de imágenes para que la muestra esté enfocada. Tenga en cuenta esta altura z como referencia.
Sustituya cuidadosamente la cabeza AFM en la plataforma.
Usando los motores paso a paso z, baje la punta hacia la muestra. A medida que se baja la punta de AFM, ajuste las tablas de búsqueda (LUT) en la imagen de campo brillante según sea necesario. Baje la punta hasta que esté casi afilada. Usando los micrómetros de posición de punta AFM operados manualmente, mueva el cabezal AFM para que la punta AFM esté en el centro o a la izquierda centrada en el campo de visión.
NOTA: Dado que la altura z del AFM se observó antes en el paso 3.6, se pueden tomar pasos más grandes para bajar la punta AFM, sin embargo, la grasa se ha añadido a la parte inferior del plato y potencialmente aceite al objetivo, por lo que este valor es sólo para referencia. Se recomienda tomar pasos de 50 – 100 m y ajustar más pequeño a medida que la punta entra en foco
Reajuste la posición del láser utilizando los micrómetros manuales en el cabezal AFM. Si es necesario, cero las desviaciones verticales y laterales ajustando las perillas respectivas y recalibrar el voladizo AFM en el plato de muestra.
NOTA: Si el voladizo se calibra en un medio diferente de la muestra, debe recalibrarse en el medio de escaneado para tener en cuenta un posible cambio en el índice de refracción. Además, el láser puede derivar de la parte posterior del voladizo debido al ruido o a los cambios de temperatura. Reajuste únicamente el láser y vuelva a calibrar si es necesario y en el plato de muestra por encima del sustrato de vidrio si utiliza calibración sin contacto. Si utiliza la calibración de contacto, vuelva a calibrar el interior de la placa de calibración utilizando el medio de muestra.
Para lograr imágenes de microscopio confocal de alta calidad, sustituya el filtro de luz atenuante actual por el filtro que bloquea toda la luz láser AFM. Este filtro de luz garantiza que no haya interferencias de la luz brillante del láser AFM.
Usando el botón de comando de aproximación automatizada, normalmente denotado por una flecha hacia abajo, baje la punta a la parte inferior de la placa de muestra. Establezca el tamaño/área del escaneo, la resolución, el punto de consigna, la longitud z y el tiempo de píxel (o utilice los valores calibrados/propagados) en el panel de control de imágenes y comience a escanear.
Una vez completada la exploración, levante el chip AFM de 50 a 100 m antes de navegar a una nueva posición de medición en el plato de muestra. Una vez que se encuentra una nueva ubicación, acérquese al cristal y comience a escanear de nuevo siguiendo los pasos 3.21 y 3.22.
Seleccione la opción Guardar automáticamente o guarde manualmente cada archivo generado de cada análisis individual haciendo clic en Guardar.

4. Procedimiento confocal

Abra el software operativo confocal. Asegúrese de que todos los periféricos, fuentes de luz y controladores asociados estén encendidos y funcionando normalmente.
Gire o inserte un objetivo de baja ampliación (10x o 20x) para ver la muestra. Asegúrese de que el objetivo está a una distancia de trabajo segura de donde estará el plato de muestra y, si es necesario, retroceda el objetivo para evitar cualquier posible colisión del objetivo con la muestra. Con un hisopo de algodón, ensalda la grasa al vacío alrededor del borde del anillo de la placa de muestra. Si utiliza un objetivo de aceite, coloque una sola gota de aceite de inmersión en la lente frontal del objetivo
Coloque la muestra deseada en la etapa de la muestra. Gire la muestra unas cuantas veces para asegurarse de que la grasa al vacío ha generado una unión ajustada a la plaquita de la etapa de la muestra o emplear clips de muestra. Si utiliza un objetivo de aceite, elevar el objetivo a la parte inferior del plato para que el aceite sólo se mecha sobre el fondo de vidrio. Para evitar el blanqueo excesivo, minimice la iluminación ambiental.
Usando modos de campo brillante o epifluorescencia a través de la cámara o los oculares, localice la muestra y utilice la perilla de enfoque, concéntrese en un área de interés que contenga varias celdas o una sola celda. A menudo, el campo de visión dentro del microscopio óptico será mayor que la ventana de escaneo x-y en el sistema AFM (100 x 100 m). Realice ajustes de la posición de AFM dentro del campo de visión confocal utilizando el panel de control del motor en el software AFM para que el escaneo AFM y la óptica confocal estén imagingando las mismas características.
NOTA: Dentro del campo de visión, normalmente hay solo unas pocas celdas, por lo que es más fácil determinar qué celda se desea sondear. A medida que se lleva a cabo AFM, la célula se hace visible en el software AFM y, a partir de ahí, el usuario puede identificar regiones específicas de interés para sondear.
Si lo desea, capture imágenes en campo brillante o epifluorescencia utilizando una cámara o modos CLSM basados en la etiqueta de la muestra, los botones de enfoque y los botones de captura en el software del microscopio.
Con el software del microscopio, seleccione la opción o abra el panel para habilitar las capacidades confocales(por ejemplo,láseres y parámetros posteriores). Esta opción se observa normalmente por los valores de longitud de onda de la línea láser.
Seleccione las líneas láser adecuadas para los tintes que se utilizan para manchar las muestras. Active una o varias líneas láser para excitar e imaginar esas entidades en la muestra.
Establezca la ganancia en un valor que optimice la fluorescencia de las muestras pero limite la cantidad de ruido. Un valor inicial típico es una ganancia de 70.
Ajuste la potencia del láser para evitar píxeles saturados, pero maximice el rango dinámico. Un rango de arranque típico para la potencia láser es 1 – 3 %.
Establezca el tamaño del agujero en 1 unidad Airy para maximizar la resolución de la sección óptica. Si la muestra es tenue y la potencia del láser ya es alta, abra el agujero para aumentar la señal a costa de disminuir la resolución del eje z.
Ajuste el tiempo de permanencia de píxeles(es decir,la velocidad de escaneo). Comience con un tiempo de permanencia de 2 s y, si es necesario, ajuste para reflejar el brillo de la muestra. Elija el tamaño de píxel/tamaño de escaneado para el objetivo seleccionado dejando que el instrumento lo calcule a través del botón de opción Nyquist y el número elegido de píxeles en la imagen.
NOTA: Los tiempos de permanencia más largos en muestras más gruesas pueden provocar un blanqueamiento excesivo cuando se recogen pilas z.
Seleccione la opción Escanear en el software del instrumento e inicie la recopilación de datos.
NOTA: Si el instrumento tiene varios láseres, cada uno se puede optimizar de forma independiente y, a continuación, se ejecuta simultáneamente para imágenes multi fluorescente.
Utilice el mando de enfoque para acercar y alejar y localizar el campo de visión óptimo en la muestra.
Capture imágenes utilizando el botón Capturar del sistema y guarde todos los formatos de archivo necesarios de la muestra en una ubicación/carpeta deseada en el disco duro del equipo o en el disco duro externo local.
Continúe ajustando la ganancia, la potencia del láser, el tamaño del agujero, la frecuencia de muestreo y otros valores en consecuencia para optimizar la imagen. El índice de saturación de píxeles se puede activar para comprobar si los píxeles están sobresaturados. Si esta sobresaturación está presente, la ganancia y la potencia del láser se pueden reajustar para eliminar los píxeles saturados. Utilice los LUT como guía para realizar ajustes específicos.
Si es posible, utilice la frecuencia de muestreo Nyquist del sistema, que se muestra en el software como un panel o botón, para asegurarse de que las imágenes se recopilan con la resolución máxima obtenible.
Active la herramienta de recopilación de volúmenes z o pila de imágenes del sistema confocal. Usando una opción de abajo a arriba, con una sola línea láser, específicamente la línea láser que ilumina una característica en la muestra más clara, establezca los planos de inicio y fin para el volumen a medir.
Utilice el espaciado sugerido entre planos en la pila z, que se calcula para cumplir con los criterios de muestreo Nyquist para la mejor resolución axial que permite el instrumento y la línea láser usada.
Cuando se utilizan varias líneas láser, utilice la longitud de onda más corta para calcular el espaciado. Cuando finalice la adquisición, guarde el archivo en la carpeta adecuada.
Alternativamente, si existe un conocimiento a priori del grosor de la muestra, defina el volumen seleccionando el plano medio, el que aparece más brillante y nítido. En esta situación, establezca la parte superior en la mitad del espesor de la muestra por encima del plano medio y la parte inferior a la mitad del espesor por debajo del plano medio.
Una vez completada la recolección de muestras en este campo de visión, o la muestra se ha blanqueado, utilice la etapa motorizada o controlada manualmente para encontrar otro lugar de interés en la muestra y repita los pasos para la recopilación de imágenes.

5. Procedimiento de limpieza

Asegúrese de que todos los archivos de datos, tanto del CLSM como del AFM, se guarden en las ubicaciones adecuadas.
Retirar el chip AFM utilizando los motores paso a paso z al menos 2000 m o la distancia que se recorrió para llegar a la superficie de la muestra. Retire la cabeza AFM del escenario y colóquela cuidadosamente en su lugar de descanso.
Retirar el objetivo del microscopio para que esté lejos de la muestra. Si se utiliza un objetivo de aceite, el objetivo debe retirarse lo suficiente como para que ya no haya contacto entre el objetivo y el sustrato de la muestra.
Con guantes, retire la muestra y limpie la grasa y el aceite, si corresponde, de la parte inferior del plato de muestra. Adquiera un plato nuevo, limpio y vacío de Petri y llénelo con una solución de etanol del 70% de media a tres cuartas partes. Colóquelo en el portacuchillas y reemplace el cabezal AFM para permitir que el chip AFM se empape en la solución de etanol durante 5 minutos.
Mientras el chip AFM está empapado, se recomienda comenzar a copiar los datos del experimento en un disco duro externo. Después de la inmersión del chip AFM en solución de etanol durante al menos 5 minutos, retire la cabeza de AFM y colóquela en su lugar de descanso.
Con guantes, retire el soporte de viruta AFM y colóquelo en la estación de montaje. Retire con cuidado el chip AFM con pinzas con empuñaduras de goma. Coloque la punta usada de nuevo en la ubicación de la caja de la que proviene del eje orientado para denotar que se ha utilizado. Para futuras referencias, tenga en cuenta qué punta se utilizó en el experimento.
Saque el plato De Petri lleno de la solución de etanol del sistema y deseche el líquido y el plato. Con guantes, limpiador de lentes y toallitas de lente, limpie suavemente el aceite del objetivo del microscopio siguiendo los protocolos estándar. Limpie el portacuchillas quitando cualquier grasa. Deseche todos los materiales de desecho de acuerdo con los protocolos de bioseguridad y devuelva las herramientas a sus ubicaciones conocidas.
Finalice la recopilación de datos desde los equipos y apáguelos. Apague todos los instrumentos, accesorios, periféricos u otros dispositivos utilizados para el experimento.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La técnica de Conpokal se representa esquemáticamente en la Figura 1A y una imagen de la configuración se muestra en la Figura 1B. Con el fin de co-localizar con precisión las estructuras biológicas a través de la microscopía confocal con las mismas estructuras en AFM, la alineación de los dos sistemas durante la instalación es crítica. Seleccione fabricantes de confocal y AFM de buena reputación que estén familiarizados con los requisitos espaciales de cada uno. Además, la implementación exitosa de la técnica se basa en buenos procedimientos de tinción, inmovilización de la estructura biológica y la elección apropiada de la punta AFM. La altura de las células vivas a menudo presenta un desafío para las imágenes AFM. Un escaneo AFM sobre una célula HEK viva se muestra en la Figura 2A. La altura de esta celda HEK en particular era de alrededor de 10 m, demostrada por el escaneo de línea en verde (Figura 2B). Una punta AFM con un desplazamiento cero (la punta está en el extremo del voladizo) o la altura de la punta mayor que la altura de la celda(por ejemplo,la altura de la punta ≥ 10 m) producirá una imagen altamente resuelta de las celdas individuales. Un ejemplo de un escaneo deficiente debido a la elección incorrecta de la punta AFM se incluye en la Figura 2C. En esta imagen, los píxeles negros aparecieron en el vértice de la celda indicando que el piezo AFM está fuera del rango debido a una gran altura de celda. El extremo del voladizo AFM apareció en la imagen (un cuadrado redondeado) debido al desplazamiento de la punta combinado con una altura de punta insuficiente en comparación con la altura de la celda. Estos artefactos en la imagen AFM indican que se debe elegir una punta AFM diferente para poner en imagen la celda.

Se requiere un etiquetado eficiente en la tinción de fluorescencia junto con la sonda correcta para la toma de imágenes de células vivas para este método. Realizamos una imagen confocal de tres colores que se muestra en la Figura 3A con una mancha nuclear (azul fluorescente), una mancha de microtúbulo (verde fluorescente) y una mancha de membrana lipofílica (rojo fluorescente). Estas sondas de células vivas se eligieron debido a su superposición espectral limitada y su compatibilidad con cubos de filtro estándar. También hemos incluido la imagen óptica de campo brillante en la Figura 3B.

A partir de AFM, el análisis de las hendiduras de punta junto con un modelo nanomecánico, produce un mapa de módulos de la superficie. Un ejemplo de un mapa de módulo construido utilizando un ajuste del modelo Hertz y un perfil parabólico (radio de 8 nm) para la forma de la punta se muestra superpuesdo a la reconstrucción 3D de la forma de celda en la Figura 4A (que es la misma dos celdas que se muestran en la Figura 3). La proyección 3D correspondiente de la pila z confocal láser se muestra en la Figura 4B.

El método también es apropiado para estructuras biológicas más pequeñas, incluidas bacterias individuales cuyas características micro y nanoscópicas son difíciles de resolver mediante microscopía de luz. Un estudio en vivo utiliza la técnica Conpokal para explorar los mecanismos mecánicos dentro de la pared celular que influyen en la resistencia a los antibióticos en Streptococcus mutans.⁷⁴ La manipulación de los componentes de la pared celular dio lugar a cambios en la morfología y la resistencia a los antibióticos. Conpokal facilita la recopilación de datos en vivo, en solución y en solución(por ejemplo,morfología de superficie, módulo elástico, resistencia a la adhesión y rugosidad de la superficie) en muestras de la misma célula para acoplar propiedades mecánicas con la presencia o ausencia de componentes de pared celular. Figura 5A,B incluye una exploración AFM y un mapa de módulo medido de una bacteria Streptococcus mutans. Se logró una mejor resolución a esta escala con AFM que con la microscopía confocal tradicional.

La Figura 6 contiene una imagen confocal de una colonia de Enterococcus faecalis teñida con una mancha verde de estructura celular fluorescente, que se une a la pared celular. La Figura 5 y la Figura 6 demuestran la aplicabilidad de la técnica Conpokal a los microbios además de las células eucariotas.

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Figura 1: La configuración de Conpokal.
(A) Esquema de la técnica Conpokal. (B) Imagen de la configuración del instrumento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Microscopía de fuerza atómica de células vivas.
(A) Imagen AFM de dos celdas HEK. (B) Perfil de altura (línea verde en A) de una celda HEK que indica que la altura de la celda es bastante grande a 10 m. (C) Imagen AFM deficiente de una célula de astrocitos donde el piezo AFM está fuera del rango en el ápice de la célula y hay evidencia de imágenes inversas del extremo voladizo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Microscopía confocal y de campo brillante de células vivas.
(A) Microscopía confocal de escaneo láser de células HEK vivas manchadas con una mancha nuclear (azul fluorescente), una mancha de microtúbulo (verde fluorescente) y una mancha de membrana lipofílica (rojo fluorescente). (B) Imagen óptica de campo brillante correspondiente. Las barras de escala son de 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Comparación de representaciones 3D de AFM y microscopía confocal de células HEK vivas.
(A) Mapa de módulo construido utilizando un ajuste del modelo Hertz y un perfil parabólico (radio de 8 nm) para la forma de la punta superpuesta en la reconstrucción 3D de la celda de AFM. (B) La proyección 3D correspondiente de la pila z confocal láser con una mancha nuclear (azul fluorescente), una mancha de microtúbulo (verde fluorescente) y una mancha de membrana lipofílica (rojo fluorescente). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: AFM de muestra de bacterias.
(A) AFM scan y (B) mapa de módulo medido de una bacteria Streptococcus mutans. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Microscopía confocal de muestra de bacterias.
Imagen confocal de una colonia de Enterococcus faecalis con mancha de membrana fluorescente verde. La barra de escala es de 5 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conpokal es una técnica avanzada y eficaz para recopilar imágenes de alta calidad y propiedades mecánicas in situ de biomateriales vivos en un entorno líquido. La capacidad de recopilar imágenes de morfología y topografía excepcionales combinadas con propiedades mecánicas de muestras en vivo se extiende más allá de las técnicas típicas de microscopía de electrones y luz. Por separado, un microscopio confocal proporciona capacidades de confocal de sonido brillante, epifluorescencia y escaneo láser para lograr imágenes fluorescentes detalladas y de alta calidad de muestras. Un AFM proporciona caracterización mecánica, pero sin óptica auxiliar se hace difícil navegar por la muestra. Con los dos sistemas combinados, un usuario puede recopilar imágenes y propiedades mecánicas de la misma celda exactamente durante el experimento, lo que es una gran ventaja sobre dos instrumentos separados. El propósito de este manuscrito es informar y guiar a los usuarios sobre las amplias capacidades del sistema combinado Conpokal para el futuro de la biología, la ingeniería y la salud. El protocolo contempla la preparación de instrumentos, medios de cultivo, platos, selección de microorganismos, procedimiento AFM, procedimiento confocal y limpieza. Los pasos más críticos para una sesión exitosa en vivo, en solución, Conpokal son la inmovilización de muestras, la selección juiciosa de puntas y la ejecución de manchas en vivo. La sección de discusión de este manuscrito profundizará en las recomendaciones culturales, consejos de solución de problemas y directrices operativas, y el trabajo futuro para la técnica Depokal. Las recomendaciones de cultura abarcarán la orientación sobre el cultivo de muestras, la inmovilización y la tinción. Los consejos y directrices de AFM, confocal y Conpokal discutirán la selección y calibración de puntas, la resolución, las limitaciones y el funcionamiento casi simultáneo. El trabajo futuro incluye las perspectivas y el potencial de las posibles vías de investigación.

El protocolo cubre el cultivo, el sondeo y la toma de imágenes de muestras de células vivas y de bacterias fijas. Un desafío presente al realizar AFM en líquido se debe a la obstrucción del movimiento en voladizo debido al obstáculo de la muestra y la resistencia hidrodinámica. Si la muestra no está bien adheridas al sustrato, existe la posibilidad de ensuciar el voladizo por secciones de la muestra flotando en el líquido. En ese caso, las mediciones se ven comprometidas ya que son una suposición de adherencia elástica y propiedades micromecánicas de la muestra. Las células HEK no fueron tratadas con fijador, sin embargo, S. mutans y E. faecalis requieren inmovilización adicional, similar a otras células procarióticas. Las bacterias elegidas mostraron un movimiento activo que dificultaba el sondeo celular y la toma de imágenes, por lo tanto, las muestras se fijaron suavemente, químicamente para promover la inmovilización. Existen alternativas a la fijación química, como las membranas filtrantes que atrapan físicamente las células individuales en los poros^75.

La selección de puntas también es un componente crítico para la configuración y el funcionamiento del AFM. Cuando se buscan propiedades mecánicas basadas en la deformación del biomaterial, se debe tener en cuenta la rigidez en voladizo y la compatibilidad de rigidez del material, que es una tarea no trivial. El objetivo principal es combinar mejor la rigidez del material con la rigidez del voladizo seleccionado. Si el voladizo es mucho más suave que la muestra, estará sujeto a demasiada desviación. Si el voladizo es más rígido que la muestra, es posible que el detector AFM no pueda capturar estas pequeñas desviaciones. Se recomienda que al seleccionar un voladizo AFM adecuado, para elegir en función de la aplicación experimental. Para recopilar imágenes detalladas en modo de contacto intermitente, las puntas AFM dentro de un rango de 0.1 - 0.3 N/m para rigidez y radio de punta dentro de 5 nm – 100 nm son eficaces para la toma de imágenes de células vivas. Se recomiendan pequeñas puntas cónicas. Las puntas afiladas proporcionan un área de contacto pequeña y la capacidad de sangrar más ayudando a recopilar pequeños detalles y características en la morfología de la muestra⁷⁶. Sin embargo, las puntas afiladas también pueden ser problemáticas, ya que son propensas a puntuar muestras cuando los ajustes(por ejemplo,punto de ajuste, tiempo de píxel, velocidad de aproximación) requieren demasiada sangría o la sangría es demasiado rápida. Para evitar efectos de alta tasa de deformación unitaria, endurecimiento de la tensión local cerca de una punta afilada, o simplemente para controlar el área de contacto y la velocidad de aproximación, muchos optan por utilizar espectroscopia de fuerza con una punta coloidal para medir un módulo elástico.

Se recomiendan las puntas de AFM dentro de un rango de 0.01 - 1.0 N/m para rigidez y radio de punta dentro de 1 – 5 m para medir los módulos elásticos de las células vivas. Los tamaños de punta grandes, típicamente coloides de vidrio, proporcionan un área de contacto conocida y es poco probable que perforen la célula mientras están en contacto. Los voladizos rectangulares se prefieren en lugar de triangulares porque durante la calibración, el método de libre de contactos se puede utilizar para la geometría rectangular en comparación con la calibración basada en contacto para geometrías triangulares. Además, debido a la delicada naturaleza de las puntas AFM, se recomienda que el operador implemente pinzas con puntas de goma para reducir el potencial de dañar el delicado chip AFM o el bloque de montaje. Otros parámetros a tener en cuenta incluyen la velocidad de aproximación de la punta AFM y la cantidad de sangría en la muestra. Una buena directriz es mantener la sangría a alrededor del 10% del espesor (o altura) de la muestra y elegir una velocidad que impida una resistencia hidrodinámica potencial experimentada por el voladizo^38.

Los intrincados instrumentos experimentales suelen venir con obstáculos que requieren solución de problemas en la configuración, calibración y operación del instrumento. El bloqueo de la punta O voladizo de AFM en el sustrato de la muestra o de la muestra es un error común para los nuevos usuarios. Para evitar este problema, el protocolo sugiere respaldar el voladizo hacia fuera 2000 m. Este paso garantiza que la punta no entre en contacto con la parte inferior del plato si el usuario anterior olvidó retirar la punta al limpiar después de la experimentación. Sin embargo, se eligió la distancia de 2000 m para el portavajillas seleccionado utilizado en este protocolo. Una gama diferente, más grande o más pequeña, puede necesitar ser seleccionada dependiendo del estilo de soporte del plato que se está utilizando. Durante la alineación del láser y el detector, el protocolo menciona el ajuste de una perilla de espejo para maximizar la señal de suma. Es posible que no haya una perilla de ajuste de espejo en todos los AMM. Si está presente, sin embargo, una manera de manipular el instrumento para solucionar problemas de una señal de suma baja es ajustar la perilla del espejo, utilizado para tener en cuenta el medio en el que se llevará a cabo el escaneo; líquido(por ejemplo,agua, medios, PBS) o aire. Debido a la diferencia en el índice de refracción para la luz a través del aire y a través del líquido, la perilla del espejo puede necesitar ser ajustada. La sensibilidad máxima de flexión del voladizo AFM estará en la ubicación de la punta AFM, por lo tanto, la luz láser, que devuelve la posición de flexión a través de su colocación en un fotodiodo, debe estar ubicada en la ubicación de la punta AFM. Dependiendo de la punta AFM elegida, el valor de la señal de suma podría variar de 0,3 a 3,0 V. Un recubrimiento posterior en el voladizo AFM como Cr-Au o Al aumentará la señal de suma y la sensibilidad de la medición.

La geometría de la punta es pertinente al completar la calibración de la punta durante el funcionamiento de AFM. Se ha observado un buen acuerdo entre la calibración sin contacto y de contacto. Si el voladizo AFM elegido no es rectangular, será necesario realizar la calibración de contacto. Tenga en cuenta que el medio en el que se calibra la punta debe ser el mismo que el medio de muestra. Si esos fluidos difieren, el usuario debe recalibrar. Cuando se utilizan las puntas AFM en líquido, la frecuencia medida por el sistema debe ser de un cuarto a un tercio de la frecuencia de resonancia natural denotada por el fabricante. Una buena manera de comprobar que el sistema calibrado la punta correctamente es verificar los valores dentro del archivo de ruido térmico que se genera. Asegúrese de que este archivo se guarda en la carpeta adecuada. Si el sistema tiene problemas para calibrar o los valores no probables salen, recalibrar o ajustar ligeramente la posición del láser y luego recalibrar.

Otra causa de la señal de suma deficiente puede deberse a la alineación en voladizo AFM. Cuando el chip AFM se monta en el bloque de vidrio, es esencial que la punta del voladizo permanezca dentro de la pequeña ventana láser (área de vidrio liso). Si el chip está demasiado hacia adelante, el ángulo en el que el voladizo descansa naturalmente puede causar un problema con la reflexión fuera del voladizo, faltando el fotodetector y resultando en una señal de suma deficiente. Si el chip está demasiado atrás, el láser no podrá reflejarse en la parte posterior del voladizo, causando una mala señal de suma. Por estas razones, es posible que sea necesario ajustar el chip AFM montado. Además, se produce otro problema que se puede encontrar con la altura de la muestra. El instrumento AFM utilizado en este protocolo tiene un rango máximo de piezo z (altura) de 15 m. Si un usuario descubre que el software no puede recopilar los datos de altura y forzar mapas en un píxel determinado, aparecerá una caja negra que indica que el sistema está fuera del rango (Figura 2C). Una manera de causar problemas para resolver este problema es establecer la altura piezoeléctrica en un valor más bajo, como 2 o 3 m, por lo que la mayor parte del rango de 15 m se compromete a mapear la altura prevista de la celda. Esta técnica debería, en la mayoría de los experimentos relacionados con células o bacterias, solucionar el problema asociado con el rango z.

Los experimentalistas que requieren un rango z extendido para muestras altas con alturas superiores a 10 – 15 m pueden necesitar seguir un módulo adicional en el AFM. Los fabricantes de AFM tienen esta opción disponible a costos adicionales para la mayoría de los sistemas. Al ampliar el rango z, el experimentalista tiene la disponibilidad para escanear muestras que se consideran altas a microescala con pocos problemas para los valores fuera del rango o la modificación del motor piezoeléctrico AFM. Aunque estos módulos cuestan extra, algunos, dependiendo del fabricante, pueden ofrecer una altura adicional, hasta 100 m en la dirección z. Confocal todavía es posible con muestras más altas si el usuario tiene una larga distancia de trabajo, objetivo de alta ampliación o está dispuesto a utilizar un objetivo de aire, tal vez un 20x o 40x. Al reducir el aumento objetivo del microscopio, la distancia de trabajo aumenta, ganando distancia para ver el ápice de una muestra más alta. Esta modificación a un objetivo de aumento inferior sacrificará la resolución. En la configuración de Conpokal a la que se hace referencia en este manuscrito, el objetivo TIRF (fluorescencia de reflexión interna total) de 60x tiene una distancia de trabajo de casi 100 m más allá del cubreobjetos del plato de muestra con fondo de vidrio.

Con respecto al microscopio confocal mencionado en este manuscrito, se discuten algunas estipulaciones importantes. El sistema confocal utilizado para la producción de las figuras en este manuscrito implementó un objetivo de aceite TIRF 60x con una apertura numérica de 1.49. Las líneas láser a 405 nm, 488 nm y 561 nm longitudes de onda de excitación se utilizaron para la toma de imágenes de muestras de células vivas, que se muestran en la Figura 3 y la Figura 4. El límite de difracción del microscopio confocal se puede determinar mediante la ecuación resolución de Abbe, resolución de Abbe (x, y) , en la que es la longitud de onda de excitación para Alexa 488, a 488 nm, y NA es la abertura numérica para el condensador confocal, que es 0,3. Por lo tanto, se determina una resolución axial de 272 nm. Para las imágenes de epifluorescencia, se consideran dos casos para determinar la resolución en la que el agujero se establece en una unidad ventisca (AU) y 0,5 UA. En este último caso, el agujero se cierra de tal manera que se produce una pérdida significativa de luz, pero la resolución aumenta. El software confocal calcula resoluciones nativas laterales nativas y axiales a 170 nm y 290 nm para el agujero en 0,5 UA, y 200 nm y 370 nm para el agujero en 1 UA, respectivamente. Las aberraciones esféricas introducidas en el sistema se pueden contabilizar a través de un proceso de desconvolución para aumentar el contraste y la resolución en las imágenes del microscopio. Debido a las limitaciones de difracción inherentes a los microscopios confocales, la imagen confocal de la colonia de bacterias en la Figura 6 carece de la resolución coincidente para el detalle visto en el escaneo AFM de bacterias en la Figura 5. AFM proporciona acceso a características y detalles a nanoescala que son difíciles de capturar con un microscopio confocal. Sin embargo, dependiendo de la resolución de fluorescencia requerida necesaria, la Figura 5 y la Figura 6 demuestran la aplicabilidad de la técnica Conpokal a los microbios además de las células eucariotas.

Una ventaja de utilizar un microscopio confocal permite al operador recopilar imágenes 3D de regiones específicas en una muestra con detalles afilados. Estas imágenes se correlacionan con el AFM al ver la superficie que se sondeó a través de la imagen AFM y un escaneo confocal de la misma región. Dado que el microscopio está invertido, una imagen de epifluorescencia recopila información de luz del lado opuesto de la muestra que fue sondeada. El agujero dentro del sistema confocal ayuda a limitar a un solo plano desde una cierta distancia mientras filtra la luz que proviene del resto de la muestra o incluso de la habitación. Esencialmente, el agujero ayuda a aislar la luz que regresa del único plano de interés en la muestra. Típicamente, este plano de interés debe contener marcadores de fluoróforo fuertes porque, para los sistemas confocales invertidos, la detección de moléculas únicas se limitaría a microscopios confocales de mayor resolución. La iluminación de epifluorescencia es menos deseable debido al hecho de que en el modo de imagen de epifluorescencia, cualquier luz de la muestra que se refleja en el objetivo se recoge y se utiliza para generar la imagen, por lo tanto, imposible aislar un solo plano. Las técnicas confocales proporcionan una imagen de plano único más aislada de la entidad de muestra en cuestión debido al agujero^77. Si, por ejemplo, el ápice de una célula eucariota es sondeado por AFM, esa misma superficie se puede aislar con las capacidades confocales de escaneo láser del microscopio, en lugar de con el modo de imagen de epifluorescencia. Se recomienda monitorear la salud/forma de las células durante la adquisición de datos a través de imágenes simultáneamente en modo de contraste de interferencia diferencial con la ayuda del detector de luz transmitido y la línea láser de 488 nm. Al capturar una pila z de la muestra, para el procedimiento detallado anteriormente, sólo se ajusta la ganancia del detector. Cualquier cambio morfológico en las células durante la medición, que no es necesariamente visible en los canales fluorescentes, indica que los artefactos se introducen en la medición.

El espaciado ideal entre planos se puede obtener siguiendo la recomendación de software para la longitud de onda más corta utilizada en la técnica de imagen. La resolución nativa y la relación señal-ruido en los volúmenes de imagen se pueden mejorar eficazmente mediante el empleo de algoritmos de desconvolución disponibles en el módulo de procesamiento de imágenes del software de adquisición. Sin embargo, la realización de microscopía fluorescente, la selección de manchas y tintes específicos es vital para evitar el blanqueo temprano en el set o la conversación cruzada de espectros de excitación/emisión superpuestos. En ocasiones, un usuario puede experimentar un mal funcionamiento en la generación de luz confocal. Si un usuario experimenta una falta de emisión de luz o un mal funcionamiento de las líneas láser, una manera de solucionar problemas es restablecer el sistema, normalmente se realiza reiniciando el software operativo. Si el problema persiste, es posible que el detector de luz transmitido no se haya mudado dentro o fuera de su lugar dentro de la trayectoria óptica del microscopio de luz. Restablecer la posición del detector del transmisor puede ayudar a aliviar la recolección de luz o los problemas de imágenes láser.

El objetivo del instrumento Conpokal es proporcionar a los usuarios la capacidad de recopilar información óptica y basada en la fuerza sobre biomateriales vivos en un entorno líquido, simultáneamente y en la misma célula o característica. Este trabajo describe explícitamente cómo realizar estos experimentos en líquido, un hogar natural para muchos biomateriales, aunque, los experimentos secos todavía se pueden realizar utilizando la instrumentación. Con muestras preparadas en platos Petri, la altura del plato es una limitación. Debido a la configuración del bloque de vidrio que sostiene el voladizo AFM, las paredes laterales de los platos deben ser de menos de 10 mm de altura; si el plato es demasiado alto, el instrumento no será capaz de bajar la punta AFM a la superficie de la muestra o el sustrato.

Aunque hay una limitación para el tamaño de la muestra, no hay ninguna limitación con el instrumento o las capacidades de software con respecto a un retraso de tiempo. Simultáneamente confocal y AFM es posible con los factores correctos en su lugar. La limitación que contribuye a su capacidad casi simultánea se refiere al ruido que se genera al realizar ciertas funciones de microscopía confocal y funciones de microscopía de fuerza atómica simultáneamente. Las vibraciones de los motores que mueven el objetivo del microscopio durante la recolección de una pila z se añadirán a la señal de la punta de la sonda AFM durante su movimiento. El ruido se verá realzado por un objetivo de aceite, ya que los motores se mueven hacia arriba y hacia abajo en la dirección z para iluminar los planos secuenciales en la muestra. Por lo tanto, el protocolo recomendado incluye la recopilación secuencial de exploraciones AFM e imágenes de pila z confocales. ClSM y AFM simultáneos requerirían imágenes estacionarias con el confocal, sin embargo, con la técnica actual, el tiempo de retardo para los dos instrumentos podría ser tan corto como decenas de segundos. El tiempo real para cambiar de la operación de AFM a la imagen confocal fue de alrededor de 2 – 4 minutos para las imágenes recogidas en la Figura 2A y la Figura 4B. Este valor se determinó restando los dos períodos de tiempo de recopilación de imágenes del tiempo total de 33 minutos, que incluye el tiempo para comenzar y completar el escaneo AFM, cambiar los modos de instrumento para activar la imagen confocal y comenzar y completar la pila de imagen confocal z.

El futuro de Conpokal tiene como objetivo explorar nuevas relaciones estructura-función, además de una visión aguda de los procesos de una sola célula. Por ejemplo, la experimentación de tratamientos farmacológicos in situ en muestras celulares o bacterianas para determinar los efectos de la elasticidad celular sería un avance a los campos de los biomateriales, la biología y la biomecánica. La terapia de tratamiento en el plato de muestra durante la toma de imágenes y el sondeo proporcionarían conocimiento de cómo la muestra responde a las terapias en un ambiente vivo y cuidadosamente controlado, con el tiempo. Incorporar un nuevo fármaco o desafío ambiental ampliaría la comprensión de cómo la ubicación del citoesqueleto o del orgánulo afecta a la locomoción, topología, rigidez, etc. Otro avance potencial de Conpokal es la capacidad de tener un control ambiental completo del sistema. El actual Conpokal mencionado en este protocolo se encuentra dentro de un recinto acústico diseñado para reducir el ruido desde el interior del laboratorio. El avance de esta carcasa proporcionaría la capacidad de probar dentro, tal vez, de uno o una combinación de factores, no limitados a aquellos tales como un ambiente estéril, temperatura controlada, o incluso de gravedad variable. Tal como está, el método Conpokal proporciona un enfoque eficaz y útil para caracterizar biomateriales vivos en líquido, pero el futuro de la técnica sólo avanzará estas capacidades aún más.

Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reconocemos la financiación de NIH COBRE con el número P20GM130456. Agradecemos al núcleo de microscopía de luz del Reino Unido, que cuenta con el apoyo del Vicepresidente de Investigación, por la asistencia en este trabajo. Las cepas de S. mutans y E. faecalis fueron proporcionadas por la Dra. Natalia Korotkova. La primera mención del juego de palabras, Conpokal, para describir la combinación de microscopía confocal y microscopía de fuerza atómica se atribuye al Dr. Brad Berron, Ingeniería Química y de Materiales, en la Universidad de Kentucky, en discusión con la Dra. Martha Grady (autora correspondiente) en anticipación de la llegada de un orador del seminario Dr. Jonathan Pham, quien se unió a la facultad de Ingeniería Química y Materiales en la Universidad de Kentucky en el otoño de 2017.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Recinto acústico	JPK-Bruker	Recinto acústico	Cámara utilizada para mitigar el ruido
BioTracker 488 Verde Microtúbulos Citoesqueleto Tinte	Millipore Sigma	SCT142	Se utiliza para marcar microtúbulos en células de mamíferos
CP-qp-CONT-BSG Puntas AFM	NanoAndMore	CP-qp-CONT-BSG-B	Puntas AFM colodiales buenas para mediciones de módulo en muestras
biológicasTinción de Dil (1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina perclorato ('DiI'; DiIC18(3)))	ThermoFischer Scientific	D282	Se utiliza para marcar la membrana plasmática de células de mamíferos
Medio Eagle modificado de Dulbecco	VWR	VWRL0100-0500	Componente de los medios de cultivo celular
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	ThermoFisher Scientific	A1285601	Se utiliza para simular el entorno biológico
Suero fetal bovino	Fischer Scientific	45000-736	Componente de los medios de cultivo celular
Fisher BioReagents Microbiology Media Aditivos: Extracto de levadura	Fischer Scientific	BP1422-500	Componente del medio de cultivo bacteriano
FluoroDish Cell Culture Dish	World Precision Instruments (WPI)	FD35-100	Platos con fondo de vidrio cuyas paredes laterales tienen menos de 10 mm, necesarios para el pleno funcionamiento del ácido nucleico Nanowizard 4a AFM
Hoechst 33342 tinción	ThermoFischer Scientific	62249	Se utiliza para marcar el núcleo de células de mamíferos, un buen marcador nuclear para células vivas
Riñón embrionario humano 293 células	Centro Global de Recursos Biológicos ATCC	CRL-1573	Células de mamíferos utilizadas en el protocolo
Matrigel	VWR	47743-716	Recubrimiento en placa de cultivo celular
Modelo: Consejos PFQNM-LC-A-CAL AFM Bruker		PFQNM-LC-A-CAL	Puntas de AFM que funcionan bien para muestras que tienen grandes alturas (como las células eucariotas)
NanoWizard 4a	JPK-Bruker	NanoWizard 4a	AFM
Microscopio confocal de escaneo láser Nikon A1	Nikon	HD25	Microscopio utilizado para imágenes de campo claro, epifluorescencia y confocal
PENICILINA/ESTREPTOMICINA	VWR	16777-164	Componente de los medios
de cultivo celularPetriDishHeater	JPK-Bruker	PetriDishHeater	Mantiene la temperatura deseada de la muestra de la placa de Petri
qp-BioAC-Cl Puntas AFM	Nanosensores	qp-BioAC-Cl-10	Tres voladizos AFM diferentes de diferente rigidez
Pinzas reemplazables con punta de fibra de carbono	Ted Pella Inc.	5051	Se utiliza para colocar y retirar con cuidado las delicadas puntas de AFM en el bloque de montaje de vidrio
Todd Hewitt Broth Bacto	BD DIFCO Bacterius Ltd	Bacto-249240	Componente del medio de cultivo bacteriano
Vancomicina, BODIPY FL Conjugado	Thermo Fisher Scientific	V34850	Se utiliza para marcar fluorescentemente la pared celular bacteriana

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

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