Evaluación De La Expresión Del Complejo De Histocompatibilidad Mayor Clase I En Las Neuronas Primarias Murinas Del Hipocampo Por Citometría De Flujo

Summary

Este protocolo describe un método para cultivar neuronas primarias del hipocampo a partir del cerebro embrionario del ratón. La expresión de la clase I importante del complejo de la histocompatibilidad en la superficie extracelular de neuronas cultivadas entonces es evaluada por análisis cytometric del flujo.

Abstract

Las pruebas cada vez mayores apoyan la hipótesis que las interacciones neuro-inmunes afectan la función del sistema nervioso en condiciones homeostáticas y patológicas. Una función bien estudiada de la clase I del complejo de histocompatibilidad mayor (MHCI) es la presentación de péptidos derivados de células al sistema inmune adaptativo, particularmente en respuesta a la infección. Más recientemente se ha demostrado que la expresión de moléculas de MHCI en las neuronas puede modular los cambios dependiente de la actividad en la conectividad sináptica durante el desarrollo normal y trastornos neurológicos. La importancia de estas funciones para la salud del cerebro apoya la necesidad de un ensayo sensible que detecta fácilmente la expresión de MHCI en las neuronas. Aquí se describe un método para el cultivo primario de las neuronas murinas del hipocampo y luego la evaluación de la expresión de MHCI por análisis citométrico de flujo. El hipocampo murino se microdiseca de las crías de ratón prenatales en el día embrionario 18. El tejido se disocia en una suspensión unicelular utilizando técnicas enzimáticas y mecánicas, luego se cultiva en un medio libre de suero que limita el crecimiento de células no neuronales. Después de 7 días in vitro, la expresión de MHCI es estimulada tratando las células cultivadas farmacológicamente con interferón beta. Las moléculas de MHCI se etiquetan in situ con un anticuerpo marcado fluorescentemente, luego las células se disocian no enzimáticamente en una suspensión de una sola célula. Para confirmar la identidad neuronal, las células se fijan con paraformacionaldehído, permeabilizadas y etiquetadas con un anticuerpo marcado fluorescentemente que reconoce el antígeno nuclear neuronal NeuN. La expresión de MHCI entonces es cuantificada en neuronas por análisis cytometric del flujo. Las culturas neuronales se pueden manipular fácilmente por modificaciones genéticas o intervenciones farmacológicas para probar hipótesis específicas. Con ligeras modificaciones, estos métodos se pueden utilizar para cultivar otras poblaciones neuronales o para evaluar la expresión de otras proteínas de interés.

Introduction

El sistema nervioso central (CNS) fue pensado una vez para ser desprovisto de la vigilancia inmune, referida como "privilegiado inmune^1." Ahora está claro que este privilegio no equivale a la ausencia absoluta de componentes inmunes, sino más bien, a una regulación especializada que funciona para limitar el daño asociado a la inmunopatología^1. De hecho, la comunicación entre el SNC y el sistema inmunológico es una conversación continua que es necesaria para el desarrollo saludable del cerebro y la respuesta a las infecciones^2,3.

Las moléculas principales del complejo de histocompatibilidad clase I (MHCI) son proteínas transmembrana poligénicas y polimórficas más conocidas por su función en la presentación de péptidos antigénicos a las células T CD8⁺ durante la infección^4. Los complejos clásicos de MHCI consisten en una transmembrana α cadena y una cadena ligera extracelular, llamada β2-microglobulina. La cadena α contiene un surco polimórfico que se une a un péptido antigénico para la presentación^5. La expresión adecuada de MHCI en la membrana extracelular requiere la acción coordinada de chaperonas moleculares en el retículo endoplásmico para asegurar el plegamiento adecuado de la cadena α y β2-microglobulina junto con la carga de un ligando peptídico de alta afinidad^5. Sólo una vez que se ensamblan los complejos MHCI, se exportan del retículo endoplásmico a la membrana plasmática⁶. Tras el compromiso del receptor cognado de células T con el complejo MHCI cargado de péptidos, las células T CD8⁺ median la muerte celular liberando gránulos líticos que contienen perforina y granzimas o induciendo apoptosis a través del receptor Fas de unión en la membrana celular diana^7. Además, las células T^CD8+ producen citoquinas, como el interferón gamma (IFNγ) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), que pueden activar mecanismos antivirales en células infectadas sin efectos citopáticos^8,9. Para muchos virus neurotrópicos, cd8⁺ células T son necesarios para eliminar la infección del SNC^10,11,12.

Anteriormente se pensaba que las neuronas expresan MHCI sólo en condiciones de daño, infección viral, o con estimulación in vitro de citoquinas. Recientemente, la investigación ha identificado un papel para la expresión neuronal de MHCI en la remodelación sináptica y la plasticidad^13,14. Aunque los mecanismos precisos que subyacen a la regulación de la sinapsis no se entienden bien, los datos indican que el nivel de expresión de MHCI está regulado por la actividad sináptica^15,16. Una hipótesis postula que las neuronas expresan inmunoglobulina emparejada como el receptor B (PirB) presinápticamente, que se une a MHCI transynaptically^13,17. Esta interacción inicia una cascada de señalización por PirB que se opone a las vías implicadas en la remodelación sináptica, reforzando y estabilizando así la conexión sináptica^17,18,19. En ausencia de actividad neuronal, la expresión de MHCI disminuye^14,y la pérdida de MHCI resulta en la eliminación defectuosa de la sinapsis y circuitos sinápticos mal organizados^20,21.

El ensayo descrito aquí, que fue adaptado de Chevalier et al.^9,utiliza el análisis citométrico de flujo para evaluar cuantitativamente la expresión de proteínas extracelulares de MHCI en cultivos primarios de neuronas murinas del hipocampo. Este protocolo ilustra las técnicas iniciales para microdissecting el tejido hippocampal de cachorros embrionarios del ratón. A continuación, detalla los procesos para la disociación enzimática y mecánica del tejido en una suspensión unicelular y los métodos para el mantenimiento de los cultivos invitro. Debido a que no se dividen, una vez que están en cultivo, las neuronas deben ser plateadas en un plato y densidad adecuada para su punto final experimental. A continuación, se describen los pasos para inducir la expresión de MHCI con interferón beta (IFNβ), inmunoetiquetado para MHCI y núcleos neuronales marcador NeuN, y el análisis de células por citometría de flujo. Finalmente, se describen los procedimientos para evaluar los datos de citometría de flujo para identificar las neuronas MHCI-positivas y cuantificar el nivel de la expresión de MHCI. También se observan en este protocolo pequeños ajustes que se pueden hacer con el fin de cultivar neuronas corticales además o en lugar de neuronas del hipocampo. Este protocolo se puede modificar fácilmente para probar hipótesis específicas utilizando variaciones genéticas o tratamientos farmacológicos.

Protocol

Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y de acuerdo con los Principios Rectores Internacionales para la Investigación Biomédica con Animales. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Norte en Charlotte (Protocolo #19-020).

1. Prepararse para la cultura

NOTA: Estos procedimientos deben realizarse en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad designado para cultivo de tejidos. Consulte la Tabla 1 para ver los medios y las soluciones.

1. Esterilice todas las herramientas de disección mediante autoclave en bolsas de esterilización autoselladas.
2. Prepare las existencias de trabajo de poli-D-lisina para el tratamiento de platos de cultivo de 12 pozos.
   1. Disolver la poli-D-lisina en 1x tampón de borato a una concentración de 100 μg/mL (10x concentrado). Guarde aproximadamente 1 mL de alícuotas a -20 °C hasta que sea necesario.
   2. Diluir 10x poli-D-lisina concentrada en dPBS a 10 μg/mL (1x) y filtrar esterilizar.
   3. Trate las placas de cultivo de 12 pocillos con 0.5 mL por pocillo de 1x poli-D-lisina a temperatura ambiente durante al menos 1 h o durante la noche para usar al día siguiente. Asegúrese de que el volumen de poli-D-lisina es suficiente para cubrir completamente la parte inferior del área de cultivo.
   4. Justo antes del uso, retire la poli-D-lisina de la placa de cultivo, enjuague 3 veces en agua estéril y manténgala en agua estéril hasta que esté lista para platear las células. Retire todos los rastros de líquido por una aspiración completa antes de enchapado de las células.
3. Prepare los medios de crecimiento de la neurona y el búfer FACS. Filtrar esterilizar y conservar a 4 °C hasta su uso. Medios de crecimiento de la neurona se pueden mantener durante aproximadamente 2 wks; El búfer FACS se puede mantener durante aproximadamente 4 wks.

2. Disección del hipocampo embrionario

NOTA: Este procedimiento se puede realizar en la sobremesa ya que requiere el uso de un microscopio estéreo para la eliminación de meninges y microdisección del hipocampo. Adherirse a la técnica aséptica estricta para minimizar la contaminación potencial.

1. Eutanasiar a una hembra de ratón C57BL/6J embarazada cronometerada en el día embrionario 18 en una cámara de CO_2.
2. Rocíe la piel abdominal y la piel con 70% de EtOH, luego pellizque la piel con fórceps de tejido y haga una pequeña incisión con tijeras quirúrgicas. Incise el peritoneo para exponer las vísceras y el útero.
3. Agarre el útero con las autonujeras de patrón estándar, elebre fuera de la cavidad y corte la conexión con el mesometrium con unas tijeras finas. Transferir el útero con embriones a 100 mm de plato de cultivo plástico estéril colocado sobre hielo.
4. Usando tijeras finas y lórceps finos, corte cuidadosamente el útero y extraiga los sacos embrionarios para liberar embriones. Transferir embriones a un nuevo plato de cultivo de plástico estéril de 100 mm que contenga dPBS colocado en hielo.
5. Decapitar cachorros embrionarios usando tijeras finas y transferir cabezas a un nuevo plato de cultivo de plástico estéril de 100 mm que contiene el medio Hibernate-E colocado en el hielo.
6. Para extirpar el cerebro, sostenga la cabeza con un par de pórceps finos en una mano. Usando dumont curvo #7 fórceps en otra mano, inserte la punta de las pinzas en la base del cráneo y pellizque el hueso y la piel sobrepuesto moviéndose anterior a lo largo de la línea media sin perforar el cerebro.
7. El uso de fórceps curvos separa la piel y el cráneo para exponer el cerebro. Barrer las fórceps curvas debajo del cerebro desde el bulbo olfatorio expuesto hasta el cerebelo para levantar el cerebro del cráneo. Transfiera el cerebro a un nuevo plato de cultivo de plástico estéril de 100 mm que contenga el medio Hibernate-E colocado en el hielo. Repita para cada cerebro.
   NOTA: Todos los cerebros pueden ser recogidos en un solo plato de cultivo a menos que sea necesario estar separado para fines específicos del experimento.
8. Bajo un microscopio de disección estéreo, trabajando con un cerebro a la vez y dos pares de dumont estériles #5 pinzas, pellizcar los bulbos olfativos y alejar las meninges. El retiro cuidadoso de las meninges es necesario evitar la contaminación de la cultura por otras células y permitir la disección adicional.
9. Una vez que las meninges se eliminan correctamente, el lado superior de la corteza se abre lateralmente, lo que expondrá el hipocampo. Usando Dumont #5 fórceps, pellizcar el hipocampo lejos de la corteza unida, y transferir cuidadosamente el hipocampo aislado a un tubo cónico estéril de 15 mL que contiene 5 mL de medio Hibernate-E en el hielo.
10. Repita la disección para ambos hemisferios cerebrales para cada cachorro de ratón embrionario y combine todos los hipocampos en un solo tubo cónico de 15 mL, a menos que sea necesario por separado para fines específicos del experimento.
    1. Para cultivar neuronas corticales, la corteza puede separarse de la subcorteza y procesarse de forma idéntica a las neuronas del hipocampo.
       Nota : en este momento, el protocolo puede estar en pausa. Almacenar cerebros o hipocampos disecados en medio Hibernate-E suplementado con B27 (2%) a 4 °C durante un máximo de 1 mes, aunque el retraso prolongado puede comprometer el número de células viables.

3. Disociar y cultivar las neuronas del hipocampo

NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad designado cultivo de tejidos.

1. Preparar 0,5 mL de solución de disociación de papaína por embrión para la disociación del hipocampo. El volumen de solución de disociación necesaria variará dependiendo del número de cerebros embrionarios que se diseccionen.
   NOTA: Para el cultivo de neuronas corticales, prepare 1,0 mL de solución de papaína por embrión.
   1. Disolver 20 μL de suspensión de papaína por 1 mL del medio Hibernate E por vórtice durante aproximadamente 3 min.
   2. Después de disolver la papaína, añadir 1 μL de DNasa I por 1 mL de la solución. No vórtice la solución después de que se haya añadido DNasa I, ya que esto puede desactivar la enzima.
2. Centrífuga 15 mL tubo cónico que contiene tejido hipocampal (paso 2.10) a 1, 000 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y agregue la solución de papaína. Resuspend el tejido invirtiendo varias veces. Incubar a 37 °C durante 30 min, invirtiendo para resuspend el tejido cada 10 min.
   1. Si cultiva neuronas corticales, transfiera todas las cortezas a un nuevo plato de cultivo estéril de 100 mm, aspire cuidadosamente los medios del plato y el tejido picado con tijeras finas o cuchilla de afeitar. Añadir solución de papaína al plato de cultivo y transferir tejido cortical con solución de papaína a 15 mL de tubo cónico utilizando una pipeta de transferencia estéril. Incubar tejido y solución enzimática a 37 °C durante 30 min, agitando cada 10 min.
3. Durante 30 min de incubación, prepare 3 pipetas Pasteur de vidrio pulido al fuego: 1 completamente abierto, 1 medio abierto y 1 cuarto abierto.
4. Después de la incubación de 30 minutos, centrífuga el tubo cónico de 15 mL que contiene tejidos cerebrales digeridos en 125 x g por el minuto 10. Retire la solución enzimática y reemplácela con un volumen igual de medio hibernado E fresco.
5. Usando pipeta Pasteur completamente abierta, triturar el tejido 10x. Deje que el tejido se asiente durante 2 minutos, luego transfiera la suspensión de células sobrenadantes a un tubo cónico estéril de 50 mL. Agregue un volumen igual de medio Hibernate E de nuevo al tejido.
6. Usando pipeta Pasteur sesabierta, triturar el tejido 10x. Deje que el tejido se asiente durante 2 minutos, luego transfiera la suspensión de células sobrenadantes al mismo tubo cónico de 50 mL que en el paso anterior. Agregue un volumen igual de medio Hibernate E de nuevo al tejido.
7. Usando pipeta Pasteur cuarto abierto, triturar el tejido 10x. Deje que el tejido se asiente durante 2 minutos, luego transfiera la suspensión de células sobrenadantes nuevamente a los mismos 50 mL cónicos que en pasos anteriores. Deseche cualquier tejido restante que no se haya disociado.
8. Centrifugar el tubo cónico de 50 mL que contiene el sobrenadante de la suspensión celular a 125 x g durante 5 min. Si aún no lo ha hecho, lave las placas recubiertas de poli-D-lisina con agua estéril y elimine todos los rastros de líquido por aspiración completa durante la centrifugación.
9. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y resuspend el pellet celular en 5 mL de medios de crecimiento de neuronas. Cuente las células vivas usando el azul del trypan y el hemocytometer.
   1. Si cultiva neuronas corticales, agregue al menos 10 mL de medios de crecimiento neuronal para células menos densas y un conteo más preciso.
10. Diluya las células con medios de crecimiento neuronal para una densidad de revestimiento final de 5 x 10⁵ células viables por ml y agregue 1 mL de suspensión de células diluidas a cada pozo de una placa de 12 pozos. Mantener las neuronas a 37 °C con un 5% de_CO2.
    NOTA: Típicamente, los hipocampos de 1 cerebro de ratón embrionario, es decir, 2 hipocampos, producen aproximadamente 1 x 10⁶ células viables. Este número se proporciona únicamente con fines de planificación de experimentos y no debe considerarse una sustitución para contar las celdas de cada cultivo.
11. Cambie el medio de crecimiento al día siguiente del cultivo eliminando la mitad del volumen de medios de cada pozo, es decir, 0,5 mL, y agregue un volumen igual de medios frescos al lado del pozo para evitar interrumpir las células cultivadas. La mitad completa de los medios cambia dos veces por semana para la vida útil de la cultura.

4. Evaluación de la expresión de MHCI por citometría de flujo

1. Preparar el tratamiento diluyendo interferón beta (IFNβ) o un volumen igual de diluyente en medios de crecimiento neuronal. Dado que el cambio de medios será un cambio de medio volumen, prepare medios de tratamiento con 2x IFNβ concentrado. es decir, para tratar 3 pozos de una placa de 12 pozos con 100 U/mL de IFNβ, preparar 1,5 mL con 200 U/mL ifnβ o un volumen igual de diluyente IFNβ para controles tratados con medios.
2. Retire 0.5 mL de cada pozo de neuronas y agregue 0.5 mL de medios de crecimiento neuronal con o sin IFNβ a cada pozo. Incubar en condiciones normales de crecimiento (37 °C, 5% co₂₎durante 6-72 h, dependiendo de las condiciones experimentales y la optimización de la señal.
3. Después del tiempo de tratamiento, retire todos los medios de cultivo y lave suavemente una vez en medios neurobasales fríos que carecen de suplementos (B27, L-glutamina, Pen-Strep).
4. Añadir 0,5 mL de medio neurobasal frío no suplementado que contenga 1 μg/mL de bloque Fc y 1 μg/mL de anticuerpo anti-MHCI conjugado fluorescente a cada pozo. Incubar a 4 °C protegido de la luz durante 45 min.
5. Retire los medios que contienen anticuerpos y lave cuidadosamente una vez en frío dPBS. Agregue 0,5 mL de tampón de disociación celular libre de enzimas a temperatura ambiente a cada pozo y agitar para desalojar las células. Esté atento a la disociación usando el microscopio de cultivo de tejido invertido.
6. Una vez que las células se separan del plato de cultivo, agregue 0.5 mL de tampón FACS a cada pocillo, triturar las células para dispersar los grupos y transferir el volumen total de cada pocillo a tubos individuales de microcentrífuga de 1.7 mL.
7. Centrífuga a 1, 000 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante, resuspend el pellet de la célula en 100 μL de tampón FACS, y transfiera el volumen total de cada tubo a los pozos individuales de una placa de fondo en U de 96 pozos.
8. Agregue 100 μL de reactivo fijador a cada pozo. Triturar varias veces para evitar que las células se agrupen e incubar durante 15 min a temperatura ambiente protegida de la luz.
9. Centrífuga a 500 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y resuspend en 200 μl de búfer FACS.
10. Centrífuga a 500 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y resuspend en 100 μL de reactivo de permeabilización que contiene anticuerpo anti-NeuN conjugado fluorescente (dilución 1:100) a cada pozo. Mezclar bien, luego incubar a temperatura ambiente protegido de la luz con balanceo durante 20 min.
11. Después de la incubación, centrífuga a 500 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a resuspend en 100 μL de búfer FACS. Repetir 2x.
12. Después del lavado final, resuspend las células en 100 μL de paraformadehído al 2% diluidas en tampón FACS. Mezcle bien para evitar que las células se agrupe. Conservar a 4 °C protegido de la luz hasta que esté listo para leer en un citómetro de flujo. Lea las muestras tan pronto como sea posible, dentro de 1 semana.

5. Cuantificación y evaluación de datos

1. Mida los controles de compensación para cada tinte fluorescente y corrija cualquier superposición espectral. Los controles de compensación ideales incluyen neuronas cultivadas que no están manchadas, teñidas con anti-MHCI solamente, y manchadas con anti-NeuN solamente.
2. Si es posible, registre 100.000 eventos para cada muestra (al menos 10.000) y guárdelos como archivos FCS.
3. Para analizar los datos, utilizando el software de análisis adecuado, configure puertas secuenciales, como se muestra en la Figura 1A-C para seleccionar las neuronas NeuN-positivas.
   1. Gráfica SSC-A (logaritmo) vs FSC-A (lineal). Dibuje una puerta en la población celular (P1) para eliminar los desechos celulares del análisis.
   2. Dentro de la población celular P1, gráfica FSC-H (lineal) vs FSC-A (lineal). Dibuje una puerta en la población unicelular.
   3. Dentro de la población unicelular, trace SSC-A (log) vs NeuN (log). Dibuje una puerta en la población NeuN-positiva usando las células manchadas sin manchar o MHCI-solamente como guía.
   4. Trace un histograma de fluorescencia MHCI con eventos celulares normalizados al modo en el eje Y. Usando neuronas no manchadas o teñidas solo de NeuN como guía, dibuje una puerta horizontal para cuantificar el porcentaje de neuronas positivas para MHCI.
   5. Exporte el porcentaje de células positivas para MHCI, así como la mediana de intensidad de fluorescencia (IMF) para MHCI en la población NeuN-positiva para evaluación estadística y dibujo gráfico.

Results

Usando el procedimiento presentado aquí, el tejido hippocampal fue diseccionado de cachorros prenatales del ratón en el día embrionario 18. El tejido fue disociado en una sola suspensión de célula usando métodos enzimáticos y mecánicos, después cultivado en 12 placas bien que fueron pretratadas con poli-D-lisina. Después de 7 días in vitro, las células fueron tratadas con 100 U/mL de IFNβ o medios sólo durante 72 h, lo que estimuló la expresión de MHCI. Las neuronas fueron manchadas in situ para MHCI antes de no-enzimático disociadas en una sola suspensión de la célula. Las neuronas fueron fijadas y permeabilizadas, entonces manchadas intracelular para el marcador neuronal NeuN de los núcleos. Las muestras fueron evaluadas por citometría de flujo y los datos fueron analizados utilizando el software asociado. Las neuronas fueron identificadas a través de la selección secuencial de los eventos totales para excluir los desechos celulares y los dobletes (Figura 1A,B). Las neuronas fueron identificadas definitivamente por neun-positividad (Figura 1C). NeuN⁺ células se analizaron más a fondo para la MHCI-positividad trazando las células en un histograma con el número de células normalizadas al modo en el eje y y la fluorescencia MHCI en el eje x. Se dibujó una puerta MHCI⁺ en el punto donde los picos positivos y negativos divergieron (Figura 1D). A partir de esto, el porcentaje de neuronas positivas para la tinción de MHCI (Figura 1E) y la mediana de la intensidad de fluorescencia (IMF; Figura 1F) se calcularon. Los resultados muestran que el tratamiento con IFNβ aumentó significativamente el porcentaje de neuronas positivas para la tinción extracelular de MHCI, así como el nivel de expresión, según lo indicado por MFI. El análisis estadístico y la representación gráfica se realizaron utilizando software estadístico disponible en el mercado.

Figura 1: Estrategia representativa de gating y cuantificación de MHCI.
Las neuronas primarias del hipocampo fueron tratadas con 100 U/mL de IFNβ o medios solamente. Después de 72 h, las neuronas fueron teñidas extracelularmente con MHCI azul-conjugado pacífico (1 μg/mL H2-K^b),entonces intracelular etiquetado con NeuN PE-conjugado (dilución del 1:100). La fluorescencia celular fue evaluada por cytometry de flujo, y los datos eran analizados. (A)Los eventos totales se trazaron como SSC-A (log) vs FSC-A (lineal), y las células (P1) se bloquearon para excluir los desechos. (B)Dentro de la población P1, las células fueron trazadas como FSC-H (lineal) vs FSC-A (lineal) para bloquear la población unicelular. (C)Dentro de la población unicelular, las células fueron trazadas SSC-A (registro) contra NeuN-PE (registro). NeuN⁺ células fueron cerradas para identificar las neuronas. (D) Dentro de la población de neuronas, las células se trazaron en un histograma con MHCI-PacBlu en el eje x y los números de celda normalizados al modo en el eje y. Se dibujó una puerta horizontal para cuantificar el porcentaje de neuronas positivas para la tinción de MHCI. (E)Cuantificación del porcentaje de MHCI⁺ de NeuN⁺ células en medios solamente y neuronas tratadas con IFNβ. (F)Cuantificación de la mediana de la intensidad de fluorescencia (IMF) de MHCI en neun⁺ células en medios (negro) y ifnβ-tratado (rojo) neuronas. La significación estadística se calculó mediante prueba t no emparejada. **, P < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Medios de crecimiento neuronal (50 ml)
Reactivo	Concentración Final	Concentración de existencias	Para 50 ml
Suplemento B27	2%	100%	1,0 ml
L-glutamina	2 mM	200 mM	0,5 ml
Penicilina-Estreptomicina	100 U/ml	10.000 U/ml	0,5 ml
Medios neurobasales			48,0 ml
Tampón FACS (500 ml)
Reactivo	Concentración Final	Concentración de existencias	Para 500 ml
Suero fetal bovino	2%	100%	10 ml
EDTA	1 mM	500 mM	1 ml
dPBS			489 ml
Solución de disociación de papaína
Reactivo	Concentración Final	Concentración de existencias	Para 1 ml
Suspensión de papaína	20 U/ml	1000 U/ml	0,020 ml
DNasa I	2,5 U/ml	2500 U/ml	0,001 ml
Hibernar-E			1,0 ml
Nota: El volumen de solución de disociación de papaína necesaria variará dependiendo del número de cerebros embrionarios que se diseccionan. Prepare 0,5 ml por cerebro para las neuronas del hipocampo o 1,0 ml por cerebro para las neuronas corticales.
Nota: Prepare la solución de disociación mediante el vórtice de la suspensión de papaína en Hibernate-E durante aproximadamente 3 min. Después de que la papaína se disuelva completamente, agregue DNase I. No vórtice DNase I.

Tabla 1: Medios y soluciones.

Discussion

Este protocolo describe la disección y la cultura de neuronas hippocampal primarias de cachorros prenatales del ratón en el día embrionario 18. El uso de neuronas primarias cultivadas a partir de roedores es una de las metodologías más fundamentales desarrolladas en la neurobiología moderna²². Aunque las líneas celulares inmortalizadas pueden modelar ciertos aspectos de las neuronas, su naturaleza como células derivadas de tumores, la falta de desarrollo de axones definidos y la división celular continua plantean dudas sobre si recapitulan fielmente las propiedades de las neuronas post-mitóticas in vivo²³. Otra alternativa a las neuronas primarias es el uso de células madre pluripotentes inducidas por humanos (HiPSCs). La tecnología para el uso de hiPSCs, especialmente aquellos que son derivados de pacientes, ha avanzado rápidamente en los últimos años²⁴. Sin embargo, todavía existen limitaciones para trabajar con HiPSCs, incluyendo la variabilidad entre líneas celulares, la falta de madurez funcional y las diferencias en los perfiles epigenéticos²⁵. Aunque también hay limitaciones para trabajar con el modelo reduccionista de las neuronas primarias de roedores, las neuronas cultivadas conservan la naturaleza post-mitótica de las neuronas in vivo. Además, las herramientas expansivas de biología molecular y las modificaciones genéticas disponibles para los ratones favorecen el uso de neuronas primarias sobre hiPSCs para muchas aplicaciones, y los estudios en ratones se pueden traducir fácilmente al organismo in vivo más complejo sin perder el sistema genético experimental. Por estas razones, muchos investigadores utilizan neuronas primarias de roedores para verificar aspectos clave, si no la mayor parte, de su investigación.

Para ciertos ensayos, las neuronas se pueden analizar directamente después del aislamiento del cerebro exvivo. Esto es particularmente deseable para experimentos con ratones adultos que pueden ser sometidos a condiciones experimentales específicas o que pueden depender de interacciones de múltiples tipos celulares; sin embargo, hay varias cuestiones que limitan el tipo de análisis que se pueden hacer. Es técnicamente difícil preparar una suspensión unicelular de neuronas de los cerebros de ratones adultos porque las neuronas están interconectadas y ensheadas de forma única por la mielina^26. Los métodos no enzimáticos de trituración de tejidos son ineficientes para disociar el tejido y causar la muerte celular, mientras que las preparaciones enzimáticas a menudo escinden los antígenos de la superficie celular²⁷. Además, mientras que la mielina está en gran parte ausente de los ratones embrionarios, comprende alrededor del 20% del cerebro adulto, y puede perjudicar el aislamiento celular viable e impedir el análisis de citometría de flujo²⁸. Muchas de las técnicas que se han desarrollado en última instancia despojar a las neuronas de su citosol y dejar cuerpos celulares pequeños y redondeados que consisten principalmente en núcleos²⁹. Aunque esto es aceptable para algunos análisis, esto no es apropiado para cuantificar la expresión de proteínas citoplasmáticas o extracelulares. Además, el sistema reduccionista de cultivo celular permite probar preguntas mecanicistas específicas en una escala de tiempo más corta de lo que es frecuentemente posible con un sistema in vivo.

También se describen en este protocolo los métodos para estimular la expresión de MHCI farmacológicamente con IFNβ, y la cuantificación de la expresión extracelular de MHCI por citometría de flujo. La estimulación por IFNβ es un control positivo útil para probar otras condiciones experimentales, pero se puede observar que IFNγ y el ácido kainic también pueden estimular la expresión de MHCI en neuronas^9,30,mientras que la tetrodotoxina disminuye la expresión de MHCI^14. Los métodos anteriores para detectar la expresión de MHCI se basaron en la hibridación in situ y el análisis inmunohistoquímico^14,15,20,31. Mientras que los análisis mRNA-basados, tales como hibridación in situ y qRT-PCR, pueden determinar la localización espaciotemporal, la especificidad del tipo de célula, y los niveles de transcripción del gen, estos análisis no pueden evaluar la traducción o el transporte de la proteína a la membrana de plasma. El análisis de Immunohistochemical y de la mancha blanca /negra occidental puede determinar diferencias en la expresión de la proteína y la localización potencialmente celular pero puede ser difícil de cuantificar exactamente. Además, muchos anticuerpos MHCI reconocen la estructura terciaria del complejo, y son altamente sensibles a los cambios conformacionales. Así, las condiciones de permeabilización o desnaturalización dan lugar a la pérdida de inmunorreactividad de MHCI³². El método presentado aquí utiliza immunostaining in situ para MHCI, que permite el reconocimiento de la proteína por el anticuerpo en su conformación nativa, seguido por métodos de la fijación y de la permeabilización.

Con ligeras modificaciones, los métodos descritos aquí se pueden utilizar para cultivar otras poblaciones neuronales o para evaluar la expresión de otras proteínas extracelulares de interés. En este protocolo se observan modificaciones fáciles que se pueden hacer para cultivar neuronas corticales, pero los métodos aquí descritos también pueden ser utilizados para cultivar otras poblaciones neuronales, como las neuronas estriadas^33. Además, aunque este protocolo especifique immunostaining de MHCI y de NeuN, otros marcadores celulares se pueden identificar de una manera similar. En general, los marcadores extracelulares pueden ser tratados como MHCI y los marcadores intracelulares pueden ser tratados como NeuN. Sin embargo, cabe señalar que durante el paso de disociación celular, las proyecciones axonales se separan del soma. Debido a que la estrategia de gating definida aquí filtra los desechos celulares y se centra en los núcleos neuronales marcador NeuN, las proteínas que se expresan exclusivamente en proyecciones axonales pueden no ser detectadas.

Hasta hace poco, se pensaba que las neuronas expresaban MHCI sólo en respuesta al daño, la infección o la estimulación in vitro de citoquinas para comprometer las células T CD8⁺ citotóxicas^9. Una nueva investigación ha dilucidado otra función del MHCI en la regulación de las conexiones sinápticas durante el desarrollo¹³. El protocolo descrito aquí utiliza IFNβ para estimular la expresión de MHCI en neuronas cultivadas de tipo salvaje, pero se pueden utilizar métodos similares con una variedad de estímulos celulares o modificaciones genéticas para probar hipótesis específicas. Este método permitirá a los investigadores investigar los mecanismos moleculares que regulan la expresión de MHCI, lo que mejorará la comprensión del papel dicotómico de MHCI en estas dos funciones celulares distintas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml	Fisher	05-408-129	Suministros de laboratorio Placa
cultivo estéril de 100 mm	Fisher	FB012924	Tissue Culture
Supplies Tubos de centrífuga de 15 ml Genesee	21-103	Suministros de laboratorio	Tubo
centrífuga de 50 ml	Genesee	21-108	Suministros de laboratorio
500 mM EDTA	Invitrogen	AM9260G	Reactivo tampón FACS
70% Etanol	Fisher	BP82031Gal	Suministros de cultivo de tejidos
Placa de fondo en U de 96 pocillos	citometría de flujo	Genesee	25-221
B27	Gibco	17504044	Reactivo de cultivo de neuronas
Tampón de borato	Thermo Scientific	28341	Suministros de cultivo de tejidos
Vidrio de borosilicato Pipeta Pasteur	Fisher	13 678 20C	Suministros de laboratorio
Tampón de disociación celular	Gibco	13 151 014	Suministros de citometría de flujo
DNase I	Thermo	90083	Reactivo de solución de disociación
dPBS	Gibco	14190-235	Suministros de cultivo de tejidos
Dumont #5 Pinzas	Fine Science Tools	91150-20 Herramienta de	disección
Dumont #7 Pinzas	Herramientas de ciencia fina	91197-00 Herramienta de	disección
Suero fetal bovino	Gibco	26140079	tejidos
Pinzas finas	Herramientas de ciencia fina	91113-10	Herramienta de disección
Tijeras finas	Herramientas de ciencia fina	91460-11 Herramienta de	disección
Kit de permeabilización de células permanentes	Invitrogen	GAS003	Suministros de citometría de flujo
Glutamax	Gibco	35050061	reactivo de cultivo de neuronas
Hibernate-E	Gibco	A1247601	reactivo de cultivo de neuronas
Sellado instantáneo Bolsas de esterilización	Fisher	181254	Tissue Culture Supplies
Ensayo de interferón beta	PBL Ciencia	12405-1 Suministros de	citometría de flujo
Anticuerpo anti-NeuN-PE Milli-Mark, clon A60	MilliporeSigma	FCMAB317PE	Anticuerpo de citometría de flujo
Medios neurobasales	Gibco	21103049	Reactivo de cultivo de neuronas
Pacific Blue Anticuerpo anti-ratón H-2Kb	BioLegend	116513	Anticuerpo de citometría de flujo
Solución de papaína	Worthington	LS003126	Reactivo
de solución de disociaciónParaformaldehído	Microscopía Electrónica Ciencias	15714	Fijador
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140122	reactivo de cultivo de neuronas
Poly-D-Lisina	Sigma	P7280	Reactivo de cultivo neuronal
Pinzas de patrón estándar	Herramientas de ciencia fina	91100-12 Herramienta de	disección
Microscopio de disección estereoscópico	Swift	M29TZ-SM99CL-BTW1 Herramienta de	disección
Tijeras quirúrgicas	Herramientas de ciencia fina	91401-10	Herramienta de disección
Pipetas de transferencia	Corning	357575	Suministros de laboratorio
TruStain FcX (anti-ratón CD16/32)	BioLegend	101319	Citometría de flujo Anticuerpo
Trypan Blue	Sigma	T8154-100ML Suministros de	cultivo de tejidos