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Artículo de método

Inyección de andamios de biomaterial de hidrogel en el cerebro después de un accidente cerebrovascular

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DOI:

10.3791/61450

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1 de octubre de 2020

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Department of Neurology, University of California Los Angeles, 3Department of Neurology, Duke University, 4Department of Dermatology, Duke University

En este artículo

Resumen

El accidente cerebrovascular es un problema global con opciones de tratamiento mínimas y sin terapia clínica actual para regenerar el tejido cerebral perdido. Aquí describimos métodos para crear un accidente cerebrovascular fototrombótico preciso en la corteza motora de roedores y la posterior inyección de biomateriales de hidrogel para estudiar sus efectos sobre la regeneración de tejidos después del accidente cerebrovascular.

Resumen

El accidente cerebrovascular es la principal causa de discapacidad y la quinta causa principal de muerte en los Estados Unidos. Aproximadamente el 87% de todos los accidentes cerebrovasculares son accidentes cerebrovasculares isquémicos y se definen como el bloqueo repentino de un vaso que suministra sangre al cerebro. A los pocos minutos de la obstrucción, las células comienzan a morir y resultan en daños irreparables en los tejidos. Los tratamientos terapéuticos actuales se centran en la eliminación de coágulos o lisis para permitir la reperfusión y prevenir daños cerebrales más graves. Aunque la plasticidad cerebral transitoria puede salvar parte del tejido dañado con el tiempo, fracciones significativas de pacientes quedan con déficits neurológicos que nunca se resolverán. Existe una falta de opciones terapéuticas para tratar los déficits neurológicos causados por el accidente cerebrovascular, lo que enfatiza la necesidad de desarrollar nuevas estrategias para tratar a esta creciente población de pacientes. Los biomateriales inyectables se están diseñando actualmente para mejorar la plasticidad cerebral y mejorar la reparación endógena a través de la administración de agentes activos o células madre. Un método para probar estos enfoques es utilizar un modelo de accidente cerebrovascular de roedor, inyectar el biomaterial en el núcleo del accidente cerebrovascular y evaluar la reparación. Conocer la ubicación precisa del núcleo del accidente cerebrovascular es imperativo para el tratamiento preciso después del accidente cerebrovascular, por lo tanto, es preferible un modelo de accidente cerebrovascular que resulte en una ubicación predecible del accidente cerebrovascular para evitar la necesidad de imágenes antes de la inyección. El siguiente protocolo cubrirá cómo inducir un accidente cerebrovascular fototrombótico, cómo inyectar un hidrogel de manera controlada y precisa, y cómo extraer y crioseccionar el cerebro mientras se mantiene intacto el biomaterial. Además, destacaremos cómo estos mismos materiales de hidrogel se pueden utilizar para la co-entrega de células madre. Este protocolo se puede generalizar al uso de otros biomateriales inyectables en el núcleo del accidente cerebrovascular.

Introducción

El accidente cerebrovascular es la principal causa de discapacidad y la quinta causa principal de muerte en los Estados Unidos1. Aproximadamente el 87% de todos los accidentes cerebrovasculares son isquémicos, mientras que la mayoría del 13% restante son hemorrágicos2. Un accidente cerebrovascular isquémico se define como el bloqueo del flujo sanguíneo en una arteria al tejido circundante. Esta oclusión resulta en la privación de oxígeno y la necrosis posterior que a menudo conduce a la discapacidad permanente en los pacientes sobrevivientes. Si bien ha habido una disminución en la tasa de mortalidad del accidente cerebrovascular3,se espera que su prevalencia aumente a 3,4 millones de personas para 20304. Este aumento en los sobrevivientes discapacitados y la consiguiente carga económica ha llevado a un impulso para la investigación del accidente cerebrovascular que se centra en los mecanismos de reparación neuronal. Después del accidente cerebrovascular hay un período inflamatorio que conduce a la formación de una cicatriz que impide que la región necrótica se expanda. La región que rodea el núcleo necrótico se denomina "peri-infarto" y hay una fuerte evidencia de que la plasticidad en esta región, que incluye el aumento de la angiogénesis, la neurogénesis y la brotación axonal, está directamente relacionada con la recuperación observada en modelos animales y humanos5. Dado que no hay modelos in vitro que puedan replicar adecuadamente las interacciones complejas después del accidente cerebrovascular, los modelos animales son esenciales para la investigación del accidente cerebrovascular.

Hay varios modelos in vivo que se pueden utilizar para producir accidente cerebrovascular isquémico. Uno de los modelos más comunes utilizados en ratones es la oclusión de la arteria cerebral media, o MCAo, a través de la oclusión distal o proximal (a través del filamento intraarterial). El modelo proximal, también conocido como filamento MCAo (fMCAo), generalmente resulta en grandes accidentes cerebrovasculares isquémicos que abarcan entre el 5% y el 50% del hemisferio cerebral, dependiendo del número de factores6. En estos modelos, una sutura o filamento se avanza desde la arteria carótida interna hasta la base de la arteria cerebral media (MCA) y se mantiene en su lugar durante un período de tiempo específico. Este método de oclusión, que puede hacerse temporal o permanente, produce un infarto que se centra en el cuerpo estriado y puede o no implicar la corteza suprayacente6. El tamaño del accidente cerebrovascular resultante es muy variable, y se requieren técnicas de imagen, como el doppler láser, para confirmar la efectividad del procedimiento en cada ratón. La oclusión del filamento intraarterial o intraluminal que dura más de 30 minutos produce accidentes cerebrovasculares en el extremo más grande del rango de tamaño. Algunos investigadores se han centrado en tiempos de oclusión de filamentos más cortos, que requieren un enfoque experimental sustancial y validación de laboratorio7. Los modelos de MCAo de filamento en ratones siguen etapas similares de muerte celular, progresión isquémica y formación de una región periinfarto como se ve en los casos de accidente cerebrovascular humano; sin embargo, los accidentes cerebrovasculares más grandes se parecen más al estado de enfermedad de los infartos cerebrales malignos, que son menos comunes, menos tratables accidentes cerebrovasculares humanos6. Mientras tanto, la oclusión distal de MCA requiere una cirugía y una craniectomía más involucradas. En este modelo, la parte distal del MCA que corre a lo largo de la superficie del cerebro se ocluye directamente con una atadura de sutura o cauterización. En algunas variaciones de la técnica, las arterias carótidas se ocluyen unilateral o transitoriamente-bilateralmente. Un beneficio del MCAo distal es que produce un trazo basado en cortical que es menos variable en tamaño que el modelo de filamento. Sin embargo, el modelo distal produce una producción conductual más pobre debido a la transección de la arteria carótida externa (ECA), que también es una preocupación con fMCAo6.

Un modelo alternativo de accidente cerebrovascular que es conocido por ser menos invasivo es el modelo fototrombótico (PT). El modelo de PT da como resultado una localización bien definida de la isquemia y se asocia con una alta tasa de supervivencia8. La técnica se basa en un tinte fotosensible inyectado por vía intraperitoneal que permite la fotooxidación intravascular simplemente irradiando el tejido deseado con una luz o láser9. Tras la excitación, se forman radicales de oxígeno que causan daño endotelial, lo que activa la agregación plaquetaria y la formación de coágulos en el área irradiada8,9. El estricto control sobre el tamaño y la ubicación del trazo, así como la alta reproducibilidad del modelo PT, lo hacen ideal para estudiar biomateriales. Si bien la precisión es posible utilizando un láser y coordenadas estereotáxicas, hay algunas desventajas que pueden hacer que este modelo sea menos ideal para pocos estudios. A diferencia del modelo fMCAo, el modelo de carrera PT no se puede volver a perfundir. Por lo tanto, los materiales para investigar los agentes neuroprotectores específicos de los daños después de la reperfusión o los mecanismos posteriores a la reperfusión no serían útiles aquí8. Además, debido al insulto microvascular del modelo PT, se observa penumbra isquémica relativamente pequeña. En cambio, se produce edema vasogénico local, que no es característico del accidente cerebrovascular humano, lo que hace que este modelo sea indeseable para los estudios farmacológicos preclínicos centrados en el área del periinfarto6,8.

El objetivo general de las estrategias de biomateriales en el accidente cerebrovascular es administrar agentes bioactivos o actuar como una matriz extracelular sustituta para el crecimiento del tejido cerebral. Una estrategia que exploraremos utilizando nuestros métodos es administrar hidrogel directamente en el núcleo del accidente cerebrovascular, a diferencia del tejido periinfarto donde se administran muchas terapias celulares actuales10. La justificación de este enfoque es que la entrega en el tejido necrótico que se encuentra en el núcleo evitará interrumpir el tejido sano circundante o en recuperación. Suponemos que la difusión de cualquier agente activo incluido dentro del biomaterial podrá alcanzar el peri-infarto desde el núcleo, especialmente porque encontramos que la entrega de biomateriales de hidrogel reduce el grosor de la cicatriz glial11. Esto es importante ya que se ha demostrado que la región periinfarto exhibe neuroplasticidad después del accidente cerebrovascular, lo que la convierte en un objetivo atractivo. Además, la entrega de una matriz sustituta al núcleo del accidente cerebrovascular se puede cargar con12 factores angiogénicos o13 neurogénicos para guiar la formación de tejido nuevo, así como células para el parto14. La entrega celular se mejora en gran medida mediante el uso de una matriz porque protege a las células de las fuerzas de inyección severas y el entorno local presente durante la entrega, así como fomenta la diferenciación y el injerto15.

Estos biomateriales terapéuticos inyectables tienen relevancia clínica en aplicaciones de accidente cerebrovascular, ya que actualmente no existen terapias médicas que estimulen la recuperación neuronal después del accidente cerebrovascular. Los circuitos neuronales subyacentes involucrados en la recuperación se encuentran en el tejido cerebral que está adyacente al núcleo del accidente cerebrovascular16,mientras que el núcleo del accidente cerebrovascular en sí está desprovisto de tejido neural viable. Anticipamos que la entrega de un biomaterial en el núcleo del accidente cerebrovascular necrótico tiene el potencial de estimular el tejido adyacente hacia procesos regenerativos a través de una serie de mecanismos mencionados anteriormente, incluida la liberación de factores de crecimiento de depósito13,la estimulación del crecimiento del tejido y la promoción del desarrollo del tejido cerebral en recuperación11,12, la alteración de las respuestas inmunes17y la entrega de terapias derivadas de células madre14, 18. Sin embargo, para estudiar eficazmente la posibilidad de estas aplicaciones, se necesita un método consistente y reproducible para inducir el accidente cerebrovascular e inyectar biomateriales. El modelo de trazo PT utiliza técnicas que ofrecen un control preciso sobre la orientación y la ubicación del trazo. Un láser conectado al dispositivo estereotáxico guía las orientaciones, y las bombas conectadas a los dispositivos estereotáxicos controlan la velocidad de inyección del material sin la necesidad de formas adicionales de imágenes. Por lo tanto, hemos optado por describir los métodos para realizar un accidente cerebrovascular PT en las cortezas motoras de ratones y para inyectar biomateriales en el núcleo del accidente cerebrovascular. Aquí, utilizamos hidrogeles de partículas recocidas microporosas (MAP) como biomaterial para inyección sin células añadidas ni factores de crecimiento. Además, explicamos cómo recuperar con éxito el cerebro con biomaterial intacto, y discutimos los ensayos de inmunoquímica utilizados para analizar el resultado del accidente cerebrovascular con y sin inyección de biomateriales.

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Protocolo

Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con IUCAC en la Universidad de Duke y la Universidad de California en Los Ángeles. En este estudio se utilizaron ratones machos C57Bl/6J de 8 a 12 semanas de edad. Los animales fueron alojados a temperatura controlada (22 ± 2 °C), con un período de ciclo de luz-oscuridad de 12 h y acceso a alimentos granulados y agua ad libitum. Los protocolos de analgesia y sedación se describen como aprobados por el IUCAC, pero pueden diferir de los protocolos utilizados en otros laboratorios.

Los animales pueden ser sacrificados prematuramente si experimentan inquietud excesiva, vocalización (lo que indica dolor incontrolable), autotraumatismo, disminución o deterioro de la movilidad, signos físicos de infección dérmica, pérdida de apetito y / o pérdida de peso superior al 10% -15% como resultado de la cirugía de supervivencia. No hay efectos adversos anticipados de la inyección del gel, ya que está compuesto por un polímero natural dentro del cerebro. Los animales deben ser monitoreados diariamente, incluidos los fines de semana y días festivos, y volver a pesar cada dos días. Los estudios de nuestro laboratorio y otros no han encontrado déficits en el aseo, pérdida de peso corporal o signos / síntomas de abstinencia o estrés crónico en ratones después de estos pequeños accidentes cerebrovasculares corticales o subcorticales. Si los animales presentan algún signo de infección local de la herida en la cabeza, deben ser sacrificados. Los animales también deben ser monitoreados para detectar un aseo deficiente, condición de la herida y evidencia de peleas entre animales (heridas en la espalda). Si hay evidencia de peleas o dehiscencia de heridas, los animales primero deben ser tratados después de contactar a los veterinarios. Esto a menudo implica antibiótico en el agua y / o aplicación local de antibióticos tópicos. Si estas medidas no producen curación, los animales deben ser sacrificados.

1. Preparación de materiales e instrumentos

  1. Preparar el tinte fototrombótico antes de la cirugía. Pesar 15 mg de Rosa de Bengala en un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
    PRECAUCIÓN: La rosa de Bengala puede causar daño/ irritación ocular grave.
    1. Disuelva la rosa de Bengala en 1,5 ml de PBS 1x filtrado estéril para hacer una concentración de trabajo de 10 mg / ml.
    2. Vórtice el tubo hasta que no se vean grumos, lo que indica que el tinte se ha disuelto por completo, luego cúbralo con papel de aluminio hasta su uso posterior.
      NOTA: La cantidad de tinte requerida dependerá del número de ratones. El colorante se inyecta IP intraperitonealmente a una concentración de 10 μL/g, por ejemplo, 200 μL para un ratón de 20 g.
  2. Encienda la almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal del ratón durante la anestesia (37 °C).
  3. Prepare tijeras en autoclave, fórceps, algodón, ungüento para ojos veterinarios, pegamento quirúrgico o material de sutura, un marcador quirúrgico azul o negro y toallitas estériles de alcohol y beta yodo. Prepare la perforación ósea con cabezales de broca esterilizados.
  4. Encienda la esterilización de cuentas a 160 ° C para permitir la esterilización de instrumentos entre la cirugía de ratones. Reservar un tubo cónico de 50 ml de solución salina estéril o 1 solución de PBS para su uso posterior en el mantenimiento de un área de operación hidratada.
  5. Conecte el láser al dispositivo estereotáxico. Usando gafas de seguridad láser, mida la potencia del láser (mW).
    PRECAUCIÓN: Use gafas de seguridad láser cada vez que se encienda el láser en el procedimiento.
    1. Ajuste la corriente en la consola láser, siguiendo las instrucciones de fabricación láser, hasta que la potencia de salida láser lea 10 mW, y configure la corriente como preestablecida en la consola de la pantalla de inicio. Luego ajuste la corriente nuevamente para establecer otro preestablecido donde la potencia de salida del láser lea 40 mW. Ahora apague el láser hasta su uso posterior.
      NOTA: Los 10 mW se utilizarán para orientar el láser antes de su uso.
  6. Prepare una jaula limpia para ratones después de la cirugía. Luego, coloque al ratón en la cámara de inducción con una concentración de isoflurano del 4% para anestesiarlo hasta que el movimiento espontáneo se detenga y su respiración llegue a un ritmo lento y constante.
  7. Una vez dormido, pesa al ratón para determinar cuánto tinte de rosa de Bengala inyectar. Luego, transfiera y asegure el mouse al dispositivo estereotáxico con una concentración de isoflurano de mantenimiento del 1.5%.
    NOTA: El aumento de las concentraciones de isoflurano puede dilatar los vasos y prevenir la oclusión suficiente o los accidentes cerebrovasculares de tamaño constante entre ratones.
  8. Aplique ungüento para ojos veterinarios en ambos ojos.
    NOTA: Observe la respiración y la temperatura durante todo el procedimiento y pellizque los dedos de los pies de vez en cuando para asegurarse de que el mouse no pueda sentir nada.

2. Trazo fototrombótico modelo9

  1. Afeitar el pelaje de la cabeza del ratón y preparar asépticamente el área usando una toallita con alcohol seguida de una toallita con beta yodo. Repetir tres veces.
    NOTA: Si es necesario, use una toallita con alcohol adicional al final para limpiar todo el beta yodo, ya que causa irritación de la piel que lleva a los ratones a picar su cráneo después de la cirugía.
  2. Usando tijeras de operación pequeñas, haga una incisión lateral entre las orejas y los ojos, aproximadamente 1-2 cm. Haga esto tirando de la piel hacia arriba con fórceps para crear una tienda de campaña, cortando una vez hacia abajo, luego insertando las tijeras en la abertura y creando una incisión continua en la línea media.
  3. Separe la piel y presione ligeramente sobre los huesos parietales con las pinzas para localizar el bregma. Marque el bregma con un punto usando el marcador quirúrgico.
    NOTA: El movimiento del fragmento óseo resalta el borde frontal de los huesos parietales. El bregma es el punto central en el que se encuentran los fragmentos óseos frontales y parietales(Figura 1A).
  4. Usando gafas de seguridad láser, mueva el láser sobre el cráneo del mouse, fijando el dispositivo estereotáxico en un ángulo de 90 °. Seleccione el preestablecido de 10 mW y encienda el láser.
    1. Ajuste los ejes X e Y del láser hasta que esté directamente sobre el bregma. Restablezca la x y la y en la consola de la pantalla digital y, a continuación, mueva el láser 1,8 mm a la izquierda del bregma. Ahora lleve el láser lo más cerca posible del cráneo sin dejar que toque el cráneo.
    2. Mueva el láser a 2,2 mm a la izquierda del bregma para asegurarse de que pueda moverse sin obstrucciones. Apague el láser.
  5. Inyecte la cantidad adecuada de colorante de rosa de Bengala por vía intraperitoneal (IP) con una aguja desechable de 29 G. Inicie inmediatamente un temporizador durante 7 minutos para permitir que el tinte circule sistémicamente. Seleccione el preestablecido para 40 mW sin encender el láser.
    NOTA: Una vez que se sienta cómodo con el procedimiento, el tinte se puede inyectar antes de la preparación aséptica del ratón y terminar antes de que terminen los 7 minutos para ahorrar tiempo.
  6. Encienda el láser (40 mW) cuando se apague el temporizador de 7 minutos, mientras usa gafas de seguridad láser, y configure un temporizador de 10 minutos.
    1. Después de 10 minutos, mueva el láser a 2,2 mm a la izquierda del bregma sin apagarlo y configure otro temporizador de 10 minutos.
    2. Una vez que el segundo temporizador de 10 minutos se haya apagado, cambie el láser de nuevo a 10 mW y mueva el láser a 2,0 mm a la izquierda del bregma. Marque este punto con el marcador quirúrgico. A continuación, apague el láser.
    3. Levante el láser y desbloquéelo desde el ángulo de 90 ° para que pueda alejarse del mouse. En este punto, aplique la solución salina estéril o PBS con algodón si el área quirúrgica está seca.
  7. Perfore pequeñas ráfagas en la marca de 2,0 mm perpendicular a la superficie del cráneo.
    NOTA: Tenga cuidado de perforar lentamente para evitar perforar demasiado profundamente y golpear el cerebro. Habrá una ligera caída / cambio en la resistencia una vez que el taladro haya atravesado el cráneo, y la perforación puede causar sangrado.
    1. Use algodón para absorber cualquier exceso de sangre. Es típico ver algo de sangre de las arterias cortadas en el cráneo después de la perforación: el exceso de sangre significa que la broca golpea el cerebro. Si esto sucede, registre el identificador del mouse y continúe.
  8. Coloque una pequeña toallita junto al mouse. Usando las pinzas, tire de la piel muy junta para prepararse para el pegado.
    NOTA: La sutura se puede hacer aquí en su lugar. La sutura generalmente requiere solo 3 suturas.
    1. Usando las pinzas, agarre los dos lados de la piel y tire de ellos juntos y hacia arriba. Frote cualquier gota grande de pegamento quirúrgico al final de la punta en la toallita antes de aplicar al mouse.
    2. Aplique el pegamento quirúrgico con moderación y mantenga la piel unida con fórceps durante 10 s. Continúe hasta que no haya aberturas visibles.
      NOTA: El pegamento sale rápidamente, no apriete la botella. Evite pegar la piel al cráneo o pegar pegamento en el ojo.
  9. Después de pegar o suturar, coloque al ratón en la nueva jaula para recuperarse de la anestesia. El animal tarda de 5 a 10 minutos en recuperarse, y ayuda a descansar la mitad de la jaula en una almohadilla térmica.

3. Operación de accidente cerebrovascular simulado

  1. Realice todos los procedimientos de manera idéntica a la operación descrita anteriormente en la sección 2, excepto inyectar 1x PBS o solución salina en lugar de colorante rosa de Bengala.

4. Inyección de hidrogel u otros biomateriales

  1. Realizar la inyección de biomateriales en un momento definido por el usuario. En este experimento, las inyecciones se realizaron entre 5 y 7 días después del accidente cerebrovascular. Se inyectan 2 - 6 μL de hidrogel (definido por el usuario).
    1. Encienda la almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal del ratón durante la anestesia (37 °C).
    2. Prepare tijeras en autoclave, fórceps, algodón, ungüento para ojos veterinarios, pegamento quirúrgico o material de sutura, y toallitas estériles con alcohol y beta yodo. Prepare el taladro óseo con cabezales de broca estériles y las jeringas Hamilton de vidrio de 25 μL con agujas metálicas de 30 G.
    3. Encienda la esterilización de cuentas a 160 ° C para permitir la esterilización de instrumentos entre ratones.
    4. Conecte las bombas de inyección al dispositivo estereotáxico. Ajuste el caudal a 1 μL/min y ajuste el volumen a 4 μL.
    5. Prepare una jaula limpia para los ratones después de la cirugía.
  2. Coloque el ratón en la cámara de inducción con una concentración de isoflurano del 4% para anestesiarlo hasta que el movimiento espontáneo se detenga y su respiración llegue a un ritmo lento y constante.
    1. Una vez dormido, transfiera y asegure el ratón al dispositivo estereotáxico con una concentración de isoflurano de mantenimiento del 1,5%.
    2. Aplique el ungüento para ojos veterinarios en ambos ojos.
    3. Afeitar cualquier pelaje que pueda haber vuelto a crecer de la cabeza del ratón y preparar asépticamente el área usando una toallita con alcohol seguida de una toallita con beta yodo. Repetir tres veces.
      NOTA: Si es necesario, use una toallita con alcohol adicional al final para limpiar todo el beta yodo, ya que causa irritación de la piel y lleva a los ratones a picar su cráneo después de la cirugía.
  3. Usando las tijeras pequeñas y / o fórceps, vuelva a abrir la piel por encima del cerebro. Use algodón con solución salina estéril o PBS para limpiar cualquier residuo del cráneo. Un círculo blanco-amarillo (el trazo, Figura 1B)y el orificio de rebaba del taladro serán visibles. Si el tejido muerto no es visible, es probable que no se haya producido ningún accidente cerebrovascular. Si el orificio de rebaba no está centrado por encima de la carrera, vuelva a perforar para centrarlo.
  4. Oriente la bomba de inyección sobre el ratón y bloquee a 90°. Limpie la jeringa con solución salina estéril o PBS antes de volver a cargar el material.
    1. Una vez limpia, desmonta la jeringa de vidrio para que no quede aguja. Retrocargue la jeringa utilizando una pipeta de desplazamiento positivo de 25 μL con los 10 μL de hidrogel (u otro biomaterial aquí con o sin células).
    2. Usando el émbolo de la jeringa, empuje el gel hasta la parte frontal de la jeringa. Luego, vuelva a montar la jeringa y continúe empujando hasta que el gel exuda visiblemente de la aguja.
  5. Coloque la jeringa en la bomba. Es posible que sea necesario ajustar la parte posterior de la bomba para que la jeringa se ajuste. Para ello, ajuste el caudal a 30 μL/min, seleccione Retirada o Inyección en función de la dirección en la que necesite moverse y, a continuación, pulse Inicio. Presione Detener cuando la parte posterior de la bomba esté en la ubicación correcta.
    1. Atornille la parte posterior de la bomba para que la jeringa esté segura. Si se realizaron ajustes anteriormente, asegúrese de que el caudal se haya ajustado a 1 μL/min y esté configurado para inyectar.
  6. Mueva la bomba en la dirección x e y para orientarla sobre el orificio. Mueva la bomba hacia abajo en la dirección z hasta que la aguja de la jeringa toque la parte superior del orificio.
  7. Restablezca la z en la consola de la pantalla digital. A continuación, mueva la jeringa hacia abajo en la dirección z 0,750 mm. Si la jeringa se dobla o hay resistencia, el cráneo se curó o no se perforó por completo y debe volver a perforarse.
  8. Pulse Start en la consola de la bomba para inyectar de 4 a 6 μL del hidrogel a una velocidad de 1 μL/min.
  9. Establezca un temporizador de 5 minutos cuando la bomba deje de inyectar para permitir que el gel comience a reticularse.
  10. Después de 5 minutos, levante lentamente la jeringa girando el z nob. Observe si algún material se extrae accidentalmente o se escapa del agujero. Desbloquee la bomba y aléjela del ratón cuando la aguja esté lo suficientemente lejos del cráneo.
  11. Usando fórceps, pegamento quirúrgico o suturas, cierre la piel por encima de la cabeza. Coloque el ratón en la jaula limpia y observe su recuperación. El ratón debe tardar entre 5 y 10 minutos en recuperarse de la anestesia.

5. Perfusión y recogida de muestras

  1. Anestesiar el ratón usando isoflurano.
  2. Fije al animal en posición supina y abra la cavidad abdominal con un corte mediano. Opcionalmente, sujete la aorta abdominal descendente para usar menos fijador y PBS.
  3. Abra el diafragma y muévase hacia arriba por los lados de la caja torácica para abrir la cavidad torácica. Inserte una cánula de perfusión en el ventrículo izquierdo y corte una abertura en la aurícula derecha. Comience a perfundirse lentamente con 10-20 ml de PBS o hasta que el líquido corra semi-claro.
  4. Una vez despejado, cambie a 4% de PFA por otros 10 – 20 ml. Desanclar los brazos les permite contraerse a medida que el PFA se infunde. Una vez que dejen de moverse, espere otros 30 s.
  5. Decapita al animal y tira hacia atrás de la piel para exponer el cráneo. Usando fórceps contundentes y delgados, retire cuidadosamente las piezas del cráneo para exponer el cerebro. Se debe tener especial cuidado al extraer el cráneo por encima del sitio del accidente cerebrovascular. Aquí se pueden usar tijeras quirúrgicas pequeñas para ayudar a cortar el cráneo. El mayor desafío es que el gel se adhiera al cráneo y salga del cerebro a medida que se extrae el cráneo.
  6. Una vez que el cerebro esté separado, coloque en 10 – 15 ml de PFA al 4% durante la noche (no más de 24 h).
  7. Mueva los cerebros de PFA a 30% de sacarosa al día siguiente. El cerebro está listo para la criosección una vez que se hunde hasta el fondo (aproximadamente 2 – 3 días). También se puede dejar para almacenamiento en este punto.

6. Crioseccionamiento y tinción

  1. Saque el cerebro de la sacarosa y colóquelo en un portaobjetos de vidrio. Corta una pequeña porción de la parte posterior del cerebro con una cuchilla de afeitar para crear una porción plana que se montará en un mandril.
    1. Coloque una cucharada de Compuesto de Temperatura óptima de corte (OCT) en el mandril, y luego coloque el cerebro, plano hacia abajo, sobre el mandril en el OCT. Coloque esta muestra en hielo seco hasta que se congele o en el criostato en el bloque de congelación.
      NOTA: La OCT se puede agregar para abarcar completamente el cerebro para ayudar a evitar que el material se separe del cerebro durante la sección.
  2. Corte los cerebros en serie en un criostato a -20 °C a secciones de 30 μm de espesor en 10 diapositivas recubiertas de gelatina. Tenga cuidado al seccionar asegurándose de no perder el hidrogel. Si esta parte es difícil, coloque un poco de OCT en la parte superior del cerebro sobre el gel(Figura 3). Conservar a -80 °C hasta su uso posterior.
  3. Saque los toboganes de los -80 °C y colóquelos en una bandeja de tinción para que se sequen. Las diapositivas que no se han congelado, sino que solo se han seccionado, también se pueden manchar de inmediato.
  4. Usando una pluma hidrofóbica, dibuja un círculo alrededor de las rodajas cerebrales en la diapositiva. Una vez seco, rehidrate las rodajas cerebrales con 1x PBS filtrado y colóquelas en un agitador a temperatura ambiente durante 15 min. Esto toma aproximadamente 1 ml de búfer por diapositiva con 9 a 12 secciones cerebrales.
  5. Lave las diapositivas con 1x PBS filtrado durante 5 minutos a temperatura ambiente, repita tres veces.
  6. Bloquee los toboganes durante 30 minutos a una hora con suero de burro al 10% en PBS-Tritón X al 0,01% a temperatura ambiente en la bailarina del vientre. Esto toma alrededor de 200 μL por diapositiva.
  7. Incubar el anticuerpo primario en suero de burro al 10% con PBS-Triton X al 0,01% durante la noche a 4 °C en un agitador. Pruebe primero los anticuerpos primarios para determinar las concentraciones correctas. Aquí se utilizaron GFAP (1:400), Iba1 (1:250), Glut1 (1:500)(Figura 4).
  8. Lave las diapositivas con 1x PBS filtrado al día siguiente durante 5 minutos a temperatura ambiente, repita tres veces.
  9. Incubar con anticuerpos secundarios en suero de burro al 10% en PBS-Triton X al 0,01% y DAPI durante 2 h en el agitador de laboratorio a temperatura ambiente. 1:1.000 se utilizó para todos los secundarios y DAPI.
  10. Lave las diapositivas durante 5 minutos con 1x PBS filtrado.
  11. Deje que las secciones se sequen a temperatura ambiente en la oscuridad. Esto puede tomar de 20 minutos a 4 h; colocar las diapositivas en un desecador puede acelerar el proceso.
  12. La deshidratación se desliza en concentraciones ascendentes de alcohol (1 min por solución) de 50%, 70%, 95%, 100% y 100%.
  13. Desgrasar en el primer baño de xileno durante 1 min, luego en el segundo baño de xileno durante 5 min.
  14. Saque rápidamente las diapositivas una por una y agregue medio de montaje mientras las secciones del cerebro están húmedas con xileno. Agregue rápidamente una funda de vidrio en la parte superior. Use un resbalón de cubierta que sea de la longitud y el grosor correctos necesarios para el portaobjetos y el microscopio utilizados para la obtención de imágenes, respectivamente.
  15. Deshágase de las burbujas debajo de la cubierta presionando suavemente con una punta de pipeta en un movimiento hacia afuera desde el centro de la diapositiva. Deje que DPX se seque durante 4 h hasta pasar la noche en la oscuridad a temperatura ambiente.
  16. Use una cuchilla de afeitar para raspar cualquier medio de montaje seco que se haya derramado sobre las diapositivas. Limpie las diapositivas con el limpiador de lentes. Las diapositivas ahora se pueden obtener imágenes con microscopía de fluorescencia.
    NOTA: Es mejor almacenar la diapositiva en la oscuridad o a 4 °C hasta que finalicen las imágenes.

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Resultados

El objetivo de este método era demostrar cómo inyectar biomateriales en el cerebro después de un accidente cerebrovascular. Se utilizó un modelo fototrombótico con rosa de bengala y un láser de 520 nm para la orientación controlada de la lesión del accidente cerebrovascular tanto en tamaño como en ubicación. Cinco días después del accidente cerebrovascular, el infarto se pudo visualizar durante la cirugía(Figura 1B)y mediante TTC e imágenes de diapositivas teñidas de IHC...

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Discusión

Aquí demostramos un modelo de accidente cerebrovascular permanente fácilmente reproducible, mínimamente invasivo y describimos cómo inyectar un biomaterial en el infarto cinco días después del accidente cerebrovascular. El uso del tinte fototrombótico Rose Bengal y un láser colimado de 520 nm conectado al dispositivo estereotáxico nos da la capacidad de posicionar el trazo en la corteza motora del ratón con mayor precisión. Cinco días después del accidente cerebrovascular, la ubicación del infarto es visible a simple vis...

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Divulgaciones

Los autores declaran que TS es fundador de Tempo Therapeutics, que busca comercializar hidrogeles MAP.

Agradecimientos

Nos gusta reconocer a los Institutos Nacionales de Salud y al Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares por su financiación (R01NS079691).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Suero de cabra normal al 10%VWR100504-028Para tampón de bloqueo
Almohadilla de pre con alcohol de 2 capas, estéril, medioMedlineMDS090735
25 uL Jeringa Hamilton 702RN, sin agujaFishcer Scientific14824663Jeringas utilizadas para inyectar biomateriales
25 uL Pipeta de desplazamiento positivoGilsonM-25
2x Expansor de haz, 400-650nmThorlabsGBE02-AExpansor de rayo láser
Plataforma de escenario ajustableKopf Instruments901
Transportador de glucosa GLUT1 anticuerpo, conejoAbcamab113435
Anticuerpo anti-Iba1, cabraabcamab5076
BD Vacutainer Safety-Lok Sets de recolección de sangre. 25G, 12 "Medsupply367294para perfusiones
BKF12- Papel de aluminio negro mateThorlabsBKF12Para cubrir cualquier cosa que sea reflectante cuando se usa láser.
Mini tijeras de iris de hueso - Instrumentos quirúrgicosSklar64-2035
C57BL/6 RatonesJackson Laboratory0006648-12 semanas de edad
Montaje de jaula RobThorlabsER3-P43" de largo, diámetro 6 mm, paquete de 4 - para conectar el láser a la esterotaxis
Rebabas de acero al carbono -0,5 mm de diámetroHerramientas de ciencia fina19007-05Para crear un agujero de rebaba
Sulfato de cromo (III) y potasio dodecahidratadoVWREM1.01036.0250
Controlador compacto para láseres de colaflexible ThorlabsCLD1010LP
bastoncillos de algodónVWR89031-288
CP 25 Puntas de pipetaGilsonF148012
Donkey anti-cabra IgG H& L (488)abcamab150129
Burro Anti-conejo IgG H& L (647)abcamab150075
Burro Anti-ratas IgG H& L (555)abcamab150154
EMS DPX MountantElectroron Microscopy Sciences13512Solución de montaje para portaobjetos
EMS Gelatina en polvo tipo A 300 BloomElectrónica Microscopy Sciences16564Para portaobjetos de recubrimiento de gelatina
EMS Paraformaldehído, granularVWR100504-162Para la fabricación de 45 PFA
ESD Worstation kitElmstatWSKK5324SBNecesidad de configurar el láser
Placa de pared de banco de fibra, sin roscaThorlabsHCA3Necesidad de conectar el láser al eje Kopf
FiberPortThorlabsPAF-X-5-AFC / APC & APC, f=4,6 mm, 350-700 nm, diámetro 0,75 mm
Tijeras finas: rectas/afiladas-romas/10 cmFine Science Tools14028-10
Anticuerpo GFAP, rataThermo Fisher Scientific13-0300
Placa calefactoraKopf InstrumentsHP-4M
ImmEdge Bolígrafo de barrera hidrofóbicaVector LaboratoriesH-4000Para tintear portaobjetos
Centro de Anestesia Multipaciente IMPAC 6-IntegradoVetEquip901808
Almohadillas de preparación de yodoMedx SuppleMED MDS093917H
Pinzas de Joyería #5GFS chemicals46085
Gafas de seguridad láserThorlabsLG10BLentes ámbar, 35% de luz visible (también hay versiones de google)
M27-1084 Potente LED Doble Cuello de CisneUnited ScopeLED-11C
Médico Grado USP Oxígeno AirgasOX USP250
Miltex Adson Pinzas de apósito, grado de disecciónIntefra MiltexV96-118
Mini Cord/Inalámbrico Recortadora de Pequeños Animales HarvardAparatus72-6110
Mini-bomba de caudal variableThomas Scientific70730-064Bomba para perfusiones
Cerebro de ratón Matrices, cortes coronales, 1 mmKent ScientificRBMA-200cpara cortes de TTC
Soporte de cabeza de anestesia de gasde ratón Kopf Instruments923-B
Nanojet Caja de controlChemyx10050
Nanojetcabezal de bomba Chemxy10051Acoplar a dispositivo estereotáxico para inyectar biomaterial
Aguja RN 30G PT STY 3, 0,5 pulgadasFishcer Scientific
Barras para los oídos que no se rompen 60ºTampón Kopf Instruments922
PBS pH 7.4VWR97062 338
Láser pigtalado 520 nm, 100mW, pin 5GThorlabsLP520-MF100
Portaobjetos de vidrio con carga positivaHaretaAHS90-WH
Medidor de energíaThorlabsPM100DSe utiliza para medir la salida del láser de mW
Puralube Vet PomadaDr. Foster Smith9N-76855
Sonda rectal Ratónkopf InstrumentsRet-3-ISO
Rose Bengal Dye 95%Sigma-Aldrich330000-5G
Eje modificado 8-32 orificio roscado 1/2" de profundidadKopf Instruments1770-02Para conectar el láser al dispositivo estereotáxico
Sensor de potencia de fotodiodo delgadoThorlabsS130VCUtilizado con energía de potencia metro
SM1-Threaed 30 mm Placa de jaula de 0,35" de espesor 2Thorlabsde retención CP02Para conectar expansor láser
Sol-M U-100 Jeringa de insulina con marcas de 1/2 unidad 0,5 mLVWR10002-726Para inyectar rosa bengala
StainTray Sistema de tinción de portaobjetosSimport ScientificM920-2Para tintar portaobjetos
Dispositivo esterotáxicoKopf Instruments940Instrumento estereotáxico para animales pequeños
Pinza Adson para estudiantes -1x2 dientesFine Science Tools91127-12
Pinzas finas para estudiantes - vástagos rectos/anchosFine Science Tools91113-10
Controlador de temperaturaKopf InstrumentsTCAT-2LV
Tissue-Tek OCT compuestoVWR25608-930
Triton X-100VWR97063-864
Abrazadera de soporte superiorKopf Instruments1770-cPara conectar el láser al dispositivo esterotáxico
Vetbond Tissue Adhessive 3mLSanta Cruz Biotechnologysc-361931
Vogue Professional My ManicuristBargin Source6400Para Fresas
VWR Esterilizadores de perlasVWR VWR75999-328
Tissue Tek OCT compuestoSakura4583Para la inclusión de tejidos
de 3-1/2" NC9459562

Referencias

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