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Artículo de método

Evaluación del compromiso de objetivos celulares por inhibidores de la fosfatasa SHP2 (PTPN11)

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DOI:

10.3791/61457

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17 de julio de 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Metabolism & Signaling Networks Program, NCI-Designated Cancer Center, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

En este artículo

Resumen

La capacidad de evaluar la participación objetivo de los inhibidores candidatos en las células intactas es crucial para el descubrimiento de fármacos. Este protocolo describe un ensayo de cambio térmico celular de formato de 384 pozos que detecta de forma fiable el compromiso de destino celular de inhibidores dirigidos a SHP2 de tipo salvaje o sus variantes oncogénicas.

Resumen

La fosfatasa 2 (SHP2) que contiene dominio Src-homología 2), codificada por el protooncogene PTPN11, es un mediador clave de la señalización celular impulsada por la tirosina quinasa del receptor (RTK), promoviendo la supervivencia y proliferación celular. Además, SHP2 es reclutado por receptores de punto de control inmune para inhibir la activación de células B y T. La función aberrante SHP2 se ha implicado en el desarrollo, progresión y metástasis de muchos tipos de cáncer. De hecho, los inhibidores de SHP2 de moléculas pequeñas han entrado recientemente en ensayos clínicos para el tratamiento de tumores sólidos con activación de la vía Ras/Raf/ERK, incluidos tumores con algunas mutaciones rasgénicas oncogénicas. Sin embargo, la clase actual de inhibidores SHP2 no es eficaz contra las variantes oncogénicas SHP2 que ocurren con frecuencia en las leucemias, y el desarrollo de moléculas pequeñas específicas que se dirigen a SHP2 oncogénico es objeto de investigación actual. Un problema común con la mayoría de las campañas de descubrimiento de fármacos que involucran proteínas citosólicas como SHP2 es que los ensayos primarios que impulsan el descubrimiento químico son a menudo ensayos in vitro que no reportan la participación de la diana celular de los compuestos candidatos. Para proporcionar una plataforma para medir el compromiso de objetivos celulares, desarrollamos ensayos de desplazamiento térmico celular SHP2 de tipo salvaje y mutante. Estos ensayos detectan de forma fiable la participación objetivo de los inhibidores de SHP2 en las células. Aquí, proporcionamos un protocolo integral de este ensayo, que proporciona una herramienta valiosa para la evaluación y caracterización de los inhibidores de SHP2.

Introducción

La fosforilación de tirosina desempeña un papel importante en la transducción de señales en las células1,2. Esta modificación post-traduccional es catalizada por proteínas tirosina quinasas (PTK) y revertida por proteínas tirosina fosfatasas (PTP). Por lo tanto, la función aberrante PTK o PTP conduce a muchas enfermedades humanas heredadas o adquiridas3,4,5,6. La fosfatasa 2 (SHP2) que contiene dominios Src-homología 2 (SHP2) es un PTP de tipo no receptor ampliamente expresado codificado por el proto-oncogene PTPN117 y es un regulador clave de numerosos procesos fisiológicos que implican la transducción de señales por activación de las vías de señalización Ras/Raf/ERK, PI3K/Akt o JAK/STAT8. Normalmente, la actividad de SHP2 está estrechamente regulada para evitar la señalización aberrante. En condiciones basales, SHP2 es autoinhibitado por su dominio SH2 del terminal N, que bloquea el acceso al sitio activo dentro del dominio catalítico de fosfatasa (Figura 1A)9,10. Tras la activación celular, las proteínas de unión fosforiladas de tirosina reclutan SHP2, lo que hace que adopte su conformación activa, en la que el sitio activo es ahora accesible a sus sustratos. En muchos tipos de cáncer, la actividad de SHP2 es elevada. Las mutaciones somáticas de ganancia de función (GOF) en PTPN11 se han identificado principalmente en las leucemias y evitan la unión del dominio N-SH2 al dominio de la fosfatasa, lo que resulta en SHP2(Figura 1B)11constitutivamente activo. Las mutaciones de Germline GOF en PTPN11 son responsables del 50% de los casos de síndrome de Noonan, un trastorno del desarrollo con un mayor riesgo de neoplasia maligna12. En los tumores sólidos, donde las mutaciones de PTPN11 son raras, mayores niveles de proteínas de unión fosforiladas conducen a una mayor actividad de SHP2 (Figura 1C). SHP2 también es importante para la señalización de puntos de control inmune, ya que los receptores de punto de control como BTLA o PD-1 reclutan SHP2 para desfosforilar moléculas clave de señalización, evitando la activación de células inmunitarias13,,14,,15.

Apuntar a los PTP con moléculas pequeñas ha sido un desafío, porque el sitio activo de los PTP está altamente conservado y altamente cargado; inhibidores que apuntan al sitio activo son a menudo potentes, pero exhiben mala selectividad y biodisponibilidad oral16,17,18,19,20,21,22. De hecho, muchos inhibidores de SHP2 reportados sufren de mala selectividad y falta de eficacia en las células23. Recientemente, se han notificado inhibidores alostéricos de SHP2 con buena potencia y excelente selectividad (por ejemplo, SHP09924 y RMC-455025)y han despertado un renovado interés en los inhibidores de SHP2. Los compuestos basados en SHP099 y RMC-4550 se encuentran actualmente en ensayos clínicos de fase I para tratar tumores sólidos con activación de la vía de tirosina quinasa receptora (RTK)26,,27. Mientras que innovadores, estos compuestos son ineficaces contra muchos de los mutantes oncogénicos SHP2 que impulsan la leukemogénesis en un número significativo de pacientes con cáncer de sangre28,,29,30. Esta falta de potencia de los compuestos similares a SHP099 hacia las variantes oncogénicas SHP2 se deriva de su mecanismo alostérico único, ya que inhiben la actividad de SHP2 al unir y estabilizar la conformación inactiva y cerrada, que se interrumpe en los mutantes SHP2. Además, sobre la base de un informe reciente31,los mecanismos de resistencia adaptativa en pacientes tratados con inhibidores similares a SHP099 son bastante concebibles. En consecuencia, el desarrollo de inhibidores SHP2 de próxima generación que se dirigen a su estado activo y abierto es un tema de intensa investigación.

La caracterización de nuevos inhibidores de SHP2 en las células es un aspecto esencial del proceso de optimización del plomo. Críticamente, el compromiso objetivo probado del inhibidor en condiciones fisiológicas proporciona un nivel adicional de confianza de que los recursos para la química medicinal se despliegan eficientemente en compuestos con eficacia celular prometedora. En el pasado, se han desarrollado varios métodos para evaluar la unión de inhibidores de moléculas pequeñas a sus objetivos, principalmente para las quinasas proteicas32. Para desarrollar un ensayo de compromiso de objetivo celular SHP2, utilizamos un ensayo de desplazamiento térmico celular33. Este ensayo, similar al ensayo de desplazamiento térmico in vitro (PTS) para proteínas34, supervisa la estabilidad térmica de la proteína objetivo, que normalmente se ve alterada por la unión de moléculas pequeñas. El ensayo original es un ensayo de bajo rendimiento que utiliza anticuerpos para cuantificar los niveles de proteína objetivo. Alternativamente, elegimos una variante recientemente reportada del ensayo de cambio térmico que utiliza un ensayo de β-galactosidasa en forma de fragmentos de enzima (EFC)(Figura 2)35. Para estos experimentos, la proteína de interés se expresa en las células como una proteína de fusión N o C-terminal que lleva una etiqueta ProLabel mejorada (ePL, un fragmento de 42 aminoácidos de β-galactosidasa). Las células se transfieren a placas compatibles con PCR de 384 pozos y se incuban con compuestos de interés. Un termociclador se utiliza para aplicar un gradiente de temperatura a las células, cuyas proteínas desnaturalizarán y se agregarán a medida que la temperatura aumenta en función de su estabilidad térmica. La capacidad de un compuesto candidato para unir y estabilizar la proteína de interés resultará en una mayor estabilidad térmica de esa proteína. Por lo tanto, después de la lysis de las células, las proteínas etiquetadas que han sido estabilizadas por un compuesto candidato permanecerán en solución a temperaturas más altas que las proteínas etiquetadas de las células incubadas con el control del vehículo. El aceptador de enzimas reporter (EA) es capaz de complementar las proteínas solubles etiquetadas con ePL, lo que resulta en una actividad detectable β-galactosidasa utilizando un sustrato de luminiscencia.

Recientemente desarrollamos un robusto ensayo de cambio térmico celular para SHP2 de tipo salvaje (SHP2-WT) y una variante oncogénica SHP2 frecuente (SHP2-E76K) en un formato miniaturizado de 384pozos 36. Aquí, informamos de un protocolo detallado de este ensayo, que detecta de forma fiable el compromiso de destino por parte de los inhibidores de SHP2 en las células y demuestra un alto grado de correlación entre la potencia del inhibidor y los datos de desplazamiento térmico celular. El flujo de trabajo de ensayo general se ilustra en la Figura 3. Nuestra plataforma utiliza proteínas de fusión ePL-SHP2 con la etiqueta N-terminal. Para la generación de los plásmidos de expresión pICP-ePL-N-SHP2-WT y pICP-ePL-N-SHP2-E76K correspondientes, consulte nuestra reciente publicación36. Este ensayo se puede realizar utilizando un gradiente térmico para establecer perfiles térmicos SHP2 y determinar las temperaturas de fusión de SHP2 en presencia o ausencia de inhibidor. Una vez establecidos los perfiles térmicos, también se puede realizar en condiciones isotérmicas, lo que permite la evaluación de la dosis-respuesta del inhibidor. Ambos tipos de experimentos se describen a continuación.

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Protocolo

1. Preparación del cultivo celular y reactivos

  1. Formular una botella de 500 ml de medios de crecimiento con 10% de suero bovino fetal, 1x antibiótico/antimético, HEPES de 20 mM y piruvato sódico de 1 mM. Conservar a 4oC.
  2. Descongelar reactivos de desplazamiento térmico celular (reactivo EA, tampón de lysis y sustrato) de botellas de stock originales congeladas.
  3. Dispensar los reactivos y tampón como alícuotas de 2 ml y almacenar a -20 oC.
    NOTA: Evite la congelación/descongelación para la reproducibilidad y utilice únicamente el volumen de reactivo necesario para el procedimiento de ensayo.

2. Crecimiento y mantenimiento de células HEK293T

  1. Obtenga células HEK293T adherentes de paso bajo del almacenamiento criográfico.
  2. Mantener las células HEK293T en medios de crecimiento a 37oC, 5% CO2.
  3. Dividir celdas cada 4 días en una proporción de 1:14.
    NOTA: Para obtener el mejor rendimiento, las celdas HEK293T no pueden pasar más de 25 veces.

3. Preparación celular HEK293T para transfección transitoria

  1. Separe las células HEK293T de placas de 16 ml utilizando 3 ml del reactivo de desprendimiento de células.
  2. Diluir con 12 ml de medios de crecimiento. Recoger las células por centrifugación a 1.400 x g durante 4 min.
  3. Resuspender el pellet en medios de crecimiento de 10 ml. Mida la concentración y viabilidad de las células utilizando el azul tripano y un contador celular.
  4. Placa 7.0 x 105 células HEK293T de crecimiento exponencial por pozo en una placa de cultivo celular de 6 pozos aproximadamente 24 h antes de la transfección.
    NOTA: Reserve un pozo para que cada plásmido sea trans infectado.
  5. Incubar durante 24 h a 37oC, 5% CO2.

4. Transfección de células HEK293T

  1. De un material de plásmido purificado de pICP-ePL-N-SHP2-WT o pICP-ePL-N-SHP2-E76K (200 ng/L) diluir 2 g de ADN plásmido en 200 l de tampón de transfección.
  2. Vórtice para 10 s y centrífuga a 1.400 g durante 4 min.
  3. Añadir 4 l de reactivo de transfección al ADN diluido. Vórtice para 10 s y centrífuga a 1.400 g durante 4 min.
  4. Incubar a 23oC durante 10 min.
  5. Retire de la incubadora la placa de 6 pozos que contiene células HEK293T en crecimiento. Agregue la mezcla de transfección a las celdas conectadas en la placa de 6 pocillos. Incubar durante 24 h a 37oC, 5% CO2.

5. Preparación de placas de ensayo

  1. Preparar soluciones de stock de 10 mM en DMSO de compuestos a probar.
  2. Dispensar soluciones inhibidoras en una placa de fuente de bajo volumen de 384 pozos para su uso inmediato.
  3. Detecte el volumen deseado de inhibidores o vehículos (DMSO) utilizando un manipulador de líquidos en placas PCR en tiempo real de 384 pozos a un volumen final objetivo inferior al 0,5% de DMSO (v/v). Selle la placa con un sellador de placas con purga de gas inerte.
    NOTA: Para los ensayos de dosis-respuesta de inhibidores, asegúrese de rellenar dmSO en consecuencia para que se utilicen cantidades iguales de DMSO para cada concentración de inhibidor. Para obtener los mejores resultados, almacene las placas a 23oC y utilice las placas en un plazo de 24 h.

6. Desprendimiento y preparación de células transfectosas

  1. Preincubinar medios de crecimiento y reactivo de desprendimiento celular en un baño de agua de 37oC. Retire las células trans infectadas de la incubadora. Aspirar suavemente los medios de los pozos de la placa.
    NOTA: Utilice un nuevo aspirador para cada pozo que contenga un plásmido trans infectado diferente.
  2. Añadir 0,3 ml del reactivo de desprendimiento de celda. Mece suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás para cubrir a fondo la superficie de la parte inferior de la placa. Incubar a 23oC durante 2 min.
  3. Añadir 1 ml de medios de crecimiento a cada pozo. Pipetee suavemente los medios y las células del pozo y transfiera a un tubo centrífugo Falcon de 15 ml. Recoger las células por centrifugación a 1.400 x g durante 4 min.
  4. Aspirar suavemente pero a fondo los medios de comunicación.
    NOTA: El rojo fenol residual en el reactivo de desprendimiento de células puede interferir con el ensayo.
  5. Pellet de células resuspendidas cuidadosamente en 2 ml de medios de crecimiento. Mida la concentración y viabilidad de las células utilizando el azul tripano y un contador celular.
    NOTA: La viabilidad celular debe ser > 90% para obtener mejores resultados.
  6. Diluir las células a una concentración de 125 células/L. Por ejemplo, para un ensayo de 5 l, se trata de 625 celdas/L. Para una viabilidad óptima, mantenga las células en suspensión durante no más de 2 h.

7. Incubación de células con inhibidores de SHP2

  1. Dispensar las células en una solución estéril de un solo canal.
  2. Placa PCR centrífuga en tiempo real de 384 bien que ha sido pre-preparada por la deposición del inhibidor SHP2 a 2.500 x g durante 5 min a 23 oC.
  3. Retire el sello de la placa compuesta. Usando una pipeta multicanal de 125 l, agregue 5 l de las células diluidas a los pozos deseados.
  4. Centrifugar la placa a 42 x g durante 30 s sin tapa en la placa. Coloque un sello de tapa en la placa después de que la placa se hila hacia abajo e incubar la placa de ensayo a 37 oC, 5% deCO2 durante 1 h.

8. Preparación de la mezcla maestra de reactivos quimiominiscentes

  1. Elimine la cantidad necesaria de reactivos de detección (reactivo de EA, tampón de lelisis y sustrato) del almacenamiento de -20 oC después de las células de chapado. Reactivos de descongelación a 23oC.
    NOTA: Para mayor comodidad en la transferencia, prepare un volumen que sea 1,5 veces el volumen total de celdas que se han depositado en la placa. No reutilice los reactivos después de su uso.
  2. Preparar una mezcla maestra de los reactivos utilizando la condición EA-10, que consiste en el componente y la fracción de volumen de la siguiente manera: reactivo de EA (0,17), tampón de lesis (0,17), sustrato (0,67).
    NOTA: Las relaciones de reactivos se basan en experimentos de optimización realizados según lo especificado en el manual del proveedor.

9. Pulso de calor de gradiente isotérmico o térmico

  1. Programe el termociclocidor con capacidad de gradiente para la entrega de pulso de calor.
    1. Para experimentos de gradiente de perfil térmico, preprograme el termociclotro con las siguientes especificaciones de ejemplo:
    2. Pulso de calor: 3 minutos de temperatura de fusión deseada (gradiente vertical u horizontal +/- 15 oC; ejemplo 38-68 oC repartidos en 24 pozos produce incrementos de temperatura de 1,25 oC).
  2. Paso de recuperación de la equilibración: 3 min 20 oC con velocidad de rampa a 1 oC/s
    1. Para experimentos isotérmicos, configure el protocolo configurado de la siguiente manera:
    2. Pulso de calor: 3 min 55oC. Paso de recuperación de la equilibración: 3 min 20 oC con velocidad de rampa a 1 oC/s
      NOTA: Para una mayor reproducibilidad, ya que puede ser difícil colocar la placa con precisión en el momento en que el termociclador alcanza la temperatura deseada, configure el programa para contar 15 s antes de comenzar el pulso de 3 minutos. Para el termociclador utilizado en este experimento ver Tabla de materiales,la tapa se mantiene durante el pulso de calor.

10. Detección y medición de la lysis

  1. Suplemento de placas de ensayo con mezcla maestra de detección de lysis mediante la adición de volúmenes iguales (5 l) a cada pozo a analizar utilizando una pipeta multicanal.
  2. Centrifugar la placa 42 x g para 30 s. Conservar a 23oC en la oscuridad durante 30-60 min.
  3. Mida la quimiuminescencia utilizando un lector de microplacas capaz de detectar luminiscencia en formato de 384 pocóculos. Realice la medición de luminiscencia con el tipo de placa y el tiempo de integración optimizados (tiempo de integración 1000 ms, tiempo de liquidación 0 s). Mida los valores como recuentos/s y salida para su posterior análisis.

11. Análisis de datos

  1. Analice los datos de luminiscencia utilizando un software científico de gráficos y estadísticas 2D.
  2. Genere perfiles térmicos mediante el análisis de los datos de luminiscencia normalizados (normalizados al control del vehículo) utilizando una regresión no lineal y un modelo sigmoidal Boltzmann.
    NOTA: En los experimentos de perfil térmico, el V50calculado, la temperatura que es el punto intermedio entre la parte inferior y la parte superior de la curva, define la temperatura de fusión de SHP2. En experimentos isotérmicos, EC50 define la concentración del inhibidor que da una respuesta medio máxima.

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Resultados

El experimento de gradiente térmico para SHP2-WT dio como resultado un perfil térmico celular sigmoidal con una transición de fusión estrecha que es típica y consistente para una proteína plegada (Figura 4A). SHP2 consta de tres dominios independientes: dos dominios SH2 y el dominio catalítico(Figura 1). En la conformación cerrada autoinhibida estos dominios se autoasocian; la transición de fusión que se observó en el experimento de perfil térmico presumiblement...

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Discusión

Hemos presentado un ensayo de compromiso objetivo que puede confirmar la unión directa de moléculas pequeñas a la fosfatasa SHP2 en las células. El ensayo puede discriminar entre inhibidores de baja y alta afinidad y, lo que es más importante, confirmar la falta de potencia por parte de los inhibidores alostéricos del tipo SHP099 para el mutante SHP2-E76K oncogénico DEL GOF. Una fortaleza de este ensayo miniaturizado es su capacidad para integrarse en una campaña de detección de inhibidores de SHP2. La capacidad del ensa...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses con el contenido de este artículo.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Beca de los Institutos Nacionales de Salud 1R21CA195422 (a L. T.), el Premio de la Fundación de la Familia Epstein (a N. D. P.C.), y la Beca de Apoyo al Centro Oncológico NCI P30CA030199. Además, este proyecto ha sido financiado total o parcialmente con fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de Salud, bajo el Contrato No. del Consorcio de Biología Química. HHSN261200800001E. El contenido de esta publicación no refleja necesariamente las opiniones o políticas del Departamento de Salud y Servicios Humanos, ni la mención de nombres comerciales, productos comerciales u organizaciones implica la aprobación por parte del Gobierno de los Estados Unidos. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Termociclador equipado con gradiente de 384 pozosEppendorf AGX50h
Microplaca de bajo volumen muerto de 384 pozos Echo cualificadaBeckman Coulter, Inc.LP-0200
Placas de cultivo celular de 6 pozosGreiner Bio-One657 160Estéril con tapa
Antibiótico-Antimicótico (Anti Anti) 100 XThermo Fisher Scientific15240-062
Contador de celdasThermo Fisher ScientificCondesa II FL
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAXThermo Fisher Scientific10566-016500 mL
Manipulador acústico de líquidos EchoBeckman Coulter, Inc.Echo 550
Pipeta electrónica multicanalThermo Fisher ScientificE1 ClipTip
Suero fetal bovinoThermo Fisher Scientific26140-079500 mL
Búfer HEPESThermo Fisher Scientific15630-680100 mL
Kit de inicio InCell PulseEurofins DiscoverX Corp.94-4007Los componentes incluyen el buffer EA, el buffer de lisis y el sustrato
Lector de microplacasTecan Trading AGChispa
Canal de solución de canal únicoThermo Fisher ScientificS253012005
Piruvato de sodioThermo Fisher Scientific11360-010100 mM
Sellador térmico de microplacasAgilent Technologies, Inc.PlateLoc
Reactivos de transfecciónTransfección PolyplusjetPRIME
Azul de tripánThermo Fisher ScientificT10282
Reactivo TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific12605-010
Placas de PCR en tiempo real Twin.tec 384Eppendorf AG30132734

Referencias

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