El artículo describe la cuantificación de 1) el tamaño y el número de adherencias focales y 2) índice de forma celular y su distribución de imágenes confocales de las monocapas confluentes de las células MCF7.
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Artículo de método
Cuantificación del área de adhesión de sustrato celular y distribuciones de formas celulares en monocapas de células MCF7
En este artículo
Resumen
Resumen
Los métodos presentados aquí cuantifican algunos parámetros de monocapas de células adherentes confluentes a partir de múltiples imágenes confocales debidamente manchadas: adhesión al sustrato en función del número y tamaño de adhesiones focales, y forma de celda, caracterizada por el índice de forma de celda y otros descriptores de forma. Las adherencias focales fueron visualizadas por la tinción de paxillin y los bordes de las células celulares se marcaron con plakoglobina de unión y actina. Los métodos para el cultivo celular y la tinción eran estándar; imágenes representan planos focales individuales; el análisis de imágenes se realizó utilizando software de procesamiento de imágenes disponible públicamente. Los protocolos presentados se utilizan para cuantificar el número y el tamaño de las adherencias focales y las diferencias en la distribución de la forma celular en las monocapas, pero se pueden reutilizar para la cuantificación del tamaño y la forma de cualquier otra estructura celular distinta que se pueda teñir (por ejemplo, mitocondrias o núcleos). La evaluación de estos parámetros es importante en la caracterización de las fuerzas dinámicas en la capa celular adherente, incluida la adhesión celular y la contractilidad de actomiosina que afecta a la forma celular.
Introducción
Las monocapas celulares epiteliales actúan como un colectivo en el que la adhesión de células celulares y sustratos celulares, así como fuerzas y tensiones contráctiles representan parámetros importantes y su equilibrio adecuado contribuye a la integridad general de la unidad1,,2,,3. Por lo tanto, la evaluación de estos parámetros representa una manera de establecer el estado actual de la capa de celda.
Los dos métodos descritos aquí representan un análisis bidimensional de las monocapas confluentes de las células epiteliales adherentes (en este ca....
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Protocolo
1. Pasos preparatorios
- Siembra celular para obtener monocapas confluentes
- Antes de la siembra, recubrir los pozos de un portaobjetos de 4 pozos con colágeno I (u otro componente ECM de elección). Para el recubrimiento de colágeno I, siga un protocolo comercial: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html a una concentración de 8 g/cm2.
- Semilla 400.000 células a un pozo de un portaobjetos de 4 pozos.
- Cultivo de las células durante 24 h (o más, dependiendo de los puntos finales experimentales) antes de la tinción, en una incubadora a 37 oC, 5% CO2. Este p....
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Resultados
Análisis de adherencia focal
Anteriormente se demostró que el derribo del gen HAX1 afectaba a las adherencias focales6. Las células se cultivaron en la superficie recubierta de colágeno I durante 48 h. Las imágenes de las células de control MCF7 y las células MCF7 con un knockdown HAX1 (HAX1 KD) de tres experimentos independientes manchados con paxillin de proteína de adhesión focal se obtuvieron utilizando un microscopio confocal (imagen de un solo p.......
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Discusión
La adhesión de células celulares y sustratos celulares constituyen atributos inherentes de las células epiteliales y desempeñan el papel crítico en la morfogénesis tisular y la embriogénesis. En los tejidos adultos, la regulación adecuada de las propiedades mecánicas de la capa celular es crucial para mantener la homeostasis y prevenir respuestas patológicas como la progresión tumoral y la metástasis. El tamaño y el número de adherencias focales dependen de la fuerza de la adhesión del sustrato celular, mientras que la f.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de Ciencias de Polonia bajo la subvención No. 2014/14/M/NZ1/00437.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | anti-conejo de cabra, 1:500 |
| Cloruro de amonio | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Colágeno de piel de becerro | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL en H2O), ácido nucleico tinción |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-glucosa, piruvato | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| celular | plakoglobina de unión | 2309S | conejo, 1:400 |
| Cabina de flujo laminar clase 2 | Equipo estándar | Alpina | |
| MCF7 Línea celular basada en HAX1KD | Línea celular establecida en el Instituto Nacional de Oncología, Varsovia, descrita en Balcerak et al., 2019 | MCF7 línea celular conHAX1knockdown | |
| Línea celular MCF7 (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epitelial, línea celular de cáncer de mama adherente |
| Microscopio óptico Olympus CK2 | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | conejo, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Conjugado de faloidina-TRITC | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL en DMSO), marcaje de actina |
| PTX Sigma | T7402-1MG | ||
| TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Microscopio confocal | Zeiss |
Referencias
- Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion. Search Results. 13 (1), 016006(2016).
- Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122
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Reimpresiones y permisos
