Cuantificación del área de adhesión de sustrato celular y distribuciones de formas celulares en monocapas de células MCF7

Summary

El artículo describe la cuantificación de 1) el tamaño y el número de adherencias focales y 2) índice de forma celular y su distribución de imágenes confocales de las monocapas confluentes de las células MCF7.

Abstract

Los métodos presentados aquí cuantifican algunos parámetros de monocapas de células adherentes confluentes a partir de múltiples imágenes confocales debidamente manchadas: adhesión al sustrato en función del número y tamaño de adhesiones focales, y forma de celda, caracterizada por el índice de forma de celda y otros descriptores de forma. Las adherencias focales fueron visualizadas por la tinción de paxillin y los bordes de las células celulares se marcaron con plakoglobina de unión y actina. Los métodos para el cultivo celular y la tinción eran estándar; imágenes representan planos focales individuales; el análisis de imágenes se realizó utilizando software de procesamiento de imágenes disponible públicamente. Los protocolos presentados se utilizan para cuantificar el número y el tamaño de las adherencias focales y las diferencias en la distribución de la forma celular en las monocapas, pero se pueden reutilizar para la cuantificación del tamaño y la forma de cualquier otra estructura celular distinta que se pueda teñir (por ejemplo, mitocondrias o núcleos). La evaluación de estos parámetros es importante en la caracterización de las fuerzas dinámicas en la capa celular adherente, incluida la adhesión celular y la contractilidad de actomiosina que afecta a la forma celular.

Introduction

Las monocapas celulares epiteliales actúan como un colectivo en el que la adhesión de células celulares y sustratos celulares, así como fuerzas y tensiones contráctiles representan parámetros importantes y su equilibrio adecuado contribuye a la integridad general de la unidad^1,,2,,3. Por lo tanto, la evaluación de estos parámetros representa una manera de establecer el estado actual de la capa de celda.

Los dos métodos descritos aquí representan un análisis bidimensional de las monocapas confluentes de las células epiteliales adherentes (en este ca....

Protocol

1. Pasos preparatorios

1. Siembra celular para obtener monocapas confluentes
   1. Antes de la siembra, recubrir los pozos de un portaobjetos de 4 pozos con colágeno I (u otro componente ECM de elección). Para el recubrimiento de colágeno I, siga un protocolo comercial: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html a una concentración de 8 g/cm².
   2. Semilla 400.000 células a un pozo de un portaobjetos de 4 pozos.
   3. Cultivo de las células durante 24 h (o más, dependiendo de los puntos finales experimentales) antes de la tinción, en una incubadora a 37 oC, 5% CO₂. Este p....

Results

Análisis de adherencia focal
Anteriormente se demostró que el derribo del gen HAX1 afectaba a las adherencias focales⁶. Las células se cultivaron en la superficie recubierta de colágeno I durante 48 h. Las imágenes de las células de control MCF7 y las células MCF7 con un knockdown HAX1 (HAX1 KD) de tres experimentos independientes manchados con paxillin de proteína de adhesión focal se obtuvieron utilizando un microscopio confocal (imagen de un solo p.......

Discussion

La adhesión de células celulares y sustratos celulares constituyen atributos inherentes de las células epiteliales y desempeñan el papel crítico en la morfogénesis tisular y la embriogénesis. En los tejidos adultos, la regulación adecuada de las propiedades mecánicas de la capa celular es crucial para mantener la homeostasis y prevenir respuestas patológicas como la progresión tumoral y la metástasis. El tamaño y el número de adherencias focales dependen de la fuerza de la adhesión del sustrato celular, mientras que la f.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A32740	anti-conejo de cabra, 1:500
Cloruro de amonio	Sigma	A9434
BSA	BioShop	ALB001.500
Colágeno de piel de becerro	Sigma	C9791-10MG
DAPI	Sigma	D9542	1:10000 (stock 1 mg/mL en H2O), ácido nucleico tinción
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-glucosa, piruvato	ThermoFisher Scientific	21885-025
FBS	ThermoFisher Scientific	10270-136
celular	plakoglobina de unión	2309S	conejo, 1:400
Cabina de flujo laminar clase 2	Equipo estándar	Alpina
MCF7 Línea celular basada en HAX1KD	Línea celular establecida en el Instituto Nacional de Oncología, Varsovia, descrita en Balcerak et al., 2019		MCF7 línea celular conHAX1knockdown
Línea celular MCF7 (CONTROL)	ATCC	ATCC HTB-22	epitelial, línea celular de cáncer de mama adherente
Microscopio óptico Olympus CK2	Olympus
Paxillin	Abcam	ab32084	conejo, 1:250, Y113
PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
Conjugado de faloidina-TRITC	Sigma	P1951	1:400 (stock 5 mg/mL en DMSO), marcaje de actina
PTX Sigma		T7402-1MG
TBST – NaCl	Sigma	S9888
TBST – Trizma base	Sigma	T1503
Triton X-100	Sigma	9002-93-11
Zeiss LSM800 Microscopio confocal	Zeiss