Aislamiento de núcleos de tejido entero utilizando un método de detergente y libre de enzimas

Resumen

El aislamiento de núcleos individuales se basa en la disociación y la permeabilización basada en detergente de la membrana celular, pasos que necesitan optimización y son propensos a introducir artefactos técnicos. Demostramos un protocolo libre de detergente y enzimas para el aislamiento rápido de núcleos intactos directamente de todo el tejido, produciendo núcleos adecuados para ARN-seq de un solo núcleo (snRNA-Seq) o ATAC-seq.

Resumen

El perfilado de transcriptoma y epigenoma de alto rendimiento requiere la preparación de una sola célula o una sola suspensión de núcleos. La preparación de la suspensión con células o núcleos intactos implica disociación y permeabilización, pasos que pueden introducir ruido no deseado y daños indeseables. Particularmente, ciertos tipos de células como las neuronas son difíciles de disociar en células individuales. Además, la permeabilización de la membrana celular para liberar núcleos requiere optimización por ensayo y error, que puede ser lento, laborioso y financieramente inviable. Para mejorar la robustez y reproducibilidad de la preparación de muestras para la secuenciación de alto rendimiento, describimos un método de aislamiento rápido basado en columnas y enzimas libres de detergentes. El protocolo permite un aislamiento eficiente de los núcleos de todo el cerebro de pez cebra en 20 minutos. Los núcleos aislados muestran morfología nuclear intacta y baja propensión a agregar. Además, la citometría de flujo permite el enriquecimiento de núcleos y el aclaramiento de desechos celulares para su aplicación posterior. El protocolo, que debe funcionar en tejidos blandos y células cultivadas, proporciona un método simple y accesible para la preparación de muestras que se puede utilizar para la elaboración de perfiles de alto rendimiento, simplificando los pasos necesarios para experimentos exitosos de ARN-seq y ATAC-seq de un solo núcleo.

Introducción

El ARN-seq de una sola célula (scRNA-Seq) y el ATAC-seq son herramientas versátiles para estudiar sistemas biológicos complejos con resolución de una sola célula. Se utilizan ampliamente para definir subtipos y estados celulares, redes genéticas y para evaluar la heterogeneidad celular. Un requisito previo para realizar scRNA-seq es la preparación de una suspensión de una sola célula por disociación tisular. Debido a la variación en la composición de la matriz extracelular y las propiedades mecánicas, los tejidos individuales requieren la optimización del protocolo de disociación para la preparación de la suspensión de una sola célula.

La disociación de los tejidos en células individuales suele implicar el tratamiento con enzimas digestivas, incluyendo colagenasa, dispase o tripsina, a 37 oC^1,2,3,4. Dado que la maquinaria transcripcional permanece activa a 37oC, la disociación enzimática puede introducir artefactos de expresión de ARNm y ruido^5,,6. En particular, la incubación prolongada puede inducir genes sensibles al estrés y respuesta de choque térmico de una manera no uniforme, lo que conduce a una variabilidad técnica en el experimento⁷.

Otro inconveniente de generar una suspensión de una sola célula es la dificultad para obtener tipos de células viables e intactos con morfologías complejas. En particular, las neuronas, adipocitos y podocitos son un reto para aislar^8,9,10,11. Por ejemplo, Wu y sus colegas demostraron la ausencia de podocitos glomerulares en los perfiles de SCRNA de un riñón de ratón adulto¹². Observaciones no óptimas similares se han realizado con respecto a la recuperación de neuronas interconectadas del tejido cerebral^8,13,14. En resumen, los protocolos de disociación pueden introducir sesgo de detección hacia tipos de células más fáciles de disociar, lo que conduce a una tergiversación de la arquitectura celular del órgano.

Para superar el ruido técnico y el sesgo introducido durante la preparación de la muestra en scRNA-Seq., el aislamiento y el perfilado del núcleo proporciona una alternativa atractiva. Como la morfología nuclear es similar entre los diferentes tipos de células, el aislamiento de los núcleos elude el problema de aislar las células intactas y viables con morfologías complejas. Por ejemplo, Wu y sus colegas demostraron un perfil exitoso de podocitos glomerulares con el ARN-Seq. (snRNA-Seq. de un riñón de ratón adulto, que faltaba en scRNA-Seq¹². Intrigantemente, los estudios comparativos entre el ARN-seq de una célula y el RNA-seq de un solo núcleo han sugerido una disminución en la inducción de los genes de respuesta al estrés y al choque térmico con arn ARN-Seq¹². Los estudios sugieren además una alta correlación entre los genes detectados por los dos métodos. Sin embargo, un estudio reciente sobre la microglia humana no detectó la activación genética en la enfermedad de Alzheimer¹⁵. Por lo tanto, en ciertos contextos, snRNA-Seq es una alternativa adecuada para scRNA-Seq^16,17. Además, el aislamiento nuclear se puede utilizar para ATAC-Seq de una sola célula, proporcionando información sobre las regiones de cromatina abierta dentro de células individuales.

El protocolo para el aislamiento de núcleos implica tres pasos principales: i) la lelisis a base de detergente de la membrana celular para liberar el núcleo; ii) homogeneización del tejido utilizando un homogeneizador Dounce; y iii) enriquecimiento de núcleos y eliminación de residuos celulares utilizando centrifugación de gradiente o citometría de flujo^{18,19,20,21,22}. Entre esto, los dos primeros pasos dependen del tipo de tejido y necesitan ser optimizados empíricamente. El detergente suave conduce a la ruptura parcial de la membrana celular y a la recuperación ineficiente de los núcleos del tejido^23. Por otro lado, el alto nivel de detergente y la homogeneización dura conduce a la ruptura de la membrana nuclear y su pérdida^24,25. Los núcleos rotos tienden aún más a agruparse y formar agregados, que si no se eliminan pueden conducir a artefactos en el experimento de generación de perfiles aguas abajo.

Para evitar los problemas relacionados con la optimización del detergente para el aislamiento de núcleos, introducimos un protocolo para aislar los núcleos intactos de muestras frescas utilizando un método sin detergente y basado en columnas de espín. El protocolo produce núcleos de todo el órgano en 20 minutos, lo que limita la inducción de la transcripción artefacto. Los núcleos aislados se pueden enriquecer con FACS para ARN-Seq. y ATAC-seq de un solo núcleo, proporcionando un método simple y universal que permite un perfilado de alto rendimiento robusto y reproducible.

Protocolo

Todos los procedimientos presentados a continuación se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones y regulaciones éticas y de bienestar animal nacionales, que fueron aprobadas por el comité ético para el bienestar animal (CEBEA) de la Universidad Libre de Bruselas (protocolos 578N-579N).

1. Preparación antes de la disección de tejidos

1. Preparar una solución de Tricaína al 0,2% en PBS para eutanasiar el pez cebra. Enfríe la solución sobre hielo.
2. Prepare un plato petri de 30 mm para picar el tejido.
3. Preparar el hielo frío 1x PBS (10 ml por muestra de tejido).
4. Enfríe la centrífuga a 4oC.
5. Para el aislamiento de núcleos, utilice un kit de aislamiento de núcleos sin detergente (Tabla de materiales).
6. Antes de iniciar el protocolo, pre-enfriar el buffer A y B proporcionado en el kit colocándolos en hielo durante al menos 30 minutos antes del aislamiento de los núcleos.
7. Para manipular los núcleos aislados, cubra los reactivos plásticos como tubos y puntas de pipeta con una solución BSA al 5%. Para ello, prepare la solución disolviendo 2 g de BSA en 40 ml de PBS. Recubrimiento de artículos de plástico con 5% BSA reduce los núcleos pegados al plástico. Este paso mejora la recuperación de núcleos aislados.
8. Recubrir las puntas de la pipeta pipeteando 5% solución BSA 2-3 veces. Seque al aire las puntas durante 2 horas. Prepare 10 puntas de plástico por muestra.
9. Recubrir los tubos para la recolección de núcleos llenándolos con 5% de BSA. Invierta los tubos 3 veces para garantizar un recubrimiento eficiente. Retire la solución y seque al aire los tubos boca abajo en un papel de tejido limpio durante 2 horas. Por muestra, cubra un tubo de recogida proporcionado en el kit. Además, preparar tubos recubiertos de 1,5 ml para la recolección de núcleos después de FACS.
   NOTA: Las puntas de vidrio son una alternativa muy recomendable a las puntas de pipeta de plástico para minimizar la adherencia.

2. Disección del cerebro de pez cebra

1. Para eutanasiar el pez cebra, preparar un plato petri de 90 mm con 25 ml de solución de Tricaine helada.
2. Con cuidado, tome el pez cebra del tanque usando una red de pesca y colóquelo en el plato Petri.
3. Eutanasia el pescado dejándolo en Tricaine durante 5 min.
4. Decapita al animal con una cuchilla de afeitar afilada.
5. Usando fórceps, abre suavemente el cráneo y elimina los tejidos blandos, la piel y los huesos del lado ventral y dorsal del cráneo.
6. Transfiera suavemente el cerebro a un plato fresco de 30 mm que contenga PBS helado.
7. Picar el cerebro en trozos pequeños usando una cuchilla de afeitar para facilitar la carga de la muestra en la columna de giro.

3. Aislamiento de núcleos individuales

1. Transfiera el tejido picado al cartucho de filtro suministrado en el kit de aislamiento de núcleos y agregue 200 l de tampón frío A para sensibilizar el tejido. Moler el tejido utilizando la varilla de plástico proporcionada por el kit durante 2 minutos.
2. Añadir 300 l de tampón en frío A e incubar el cartucho de filtro sobre hielo con la tapa abierta durante 10 min.
3. Tapar el cartucho y resuspender el tejido invirtiendo el tubo 5 veces.
4. Centrífuga a 16.000 g g para 30 s. En este paso, las células se rompen al pasar a través del filtro y se aplica la fuerza centrífuga de alta velocidad. El flujo a través contiene núcleos intactos, que pellet en la parte inferior del tubo.
5. Deseche el filtro y resuspender el pellet por vórtice vigorosamente durante 10 s.
6. Pellet los núcleos centrifugando la solución a 500 x g durante 3 min. Deseche el sobrenadante cuidadosamente ya que el pellet de núcleos es incoloro.
7. Resuspender el pellet en 0,8 ml de tampón frío B y centrífuga a 600 x g durante 10 min. En este paso, los núcleos se separan de los desechos de membrana. El pellet incoloro obtenido contiene núcleos aislados.
8. Resuspender los núcleos aislados en 500 l de PBS con 5% de BSA. Mantenga la suspensión de los núcleos sobre hielo para realizar el FACS después de la cuantificación.

4. Visualización de la morfología de los núcleos

1. Confirme la morfología nuclear mediante la tinción de Hoechst. Para ello, retire 100 ml de suspensión de núcleos individuales en un tubo nuevo utilizando puntas recubiertas de BSA. Para manchar los núcleos, añada 0,1 l de Hoechst (1 mg/ml). Atratice suavemente el tubo.
2. Transfiera la suspensión de los núcleos a la placa inferior de vidrio para obtener imágenes.
3. Imagen de los núcleos utilizando un microscopio de fluorescencia con ajustes de excitación láser de longitud de onda de 405 nm (Violeta).

5. Enriquecimiento de núcleos basado en FACS

1. Antes de realizar FACS, filtre los núcleos utilizando un colador celular de 40 m en un tubo recubierto de BSA.
2. Diluir la suspensión filtrada añadiendo PBS con 5% de BSA a un volumen final de 1.000 l.
3. Etiquete dos tubos FACS de fondo redondo como "control" y "manchados". El tubo de "control" contendrá núcleos sin teñir, mientras que el tubo "manchado" tendrá núcleos manchados de Hoechst.
4. Transfiera 250 l de la suspensión de los núcleos al tubo de "control" utilizando la punta de pipeta recubierta de BSA.
5. Transfiera la solución restante de 750 l al tubo FACS etiquetado como "manchado" y añada 1 oL de tinte Hoechst para manchar los núcleos. Mezclar por vórtices lentos.
6. Cargue la muestra de control no manchada en el clasificador de celdas. Registre 5000 eventos.
7. Cargue las muestras manchadas y registre 5000 eventos.
8. Dibuje puertas FACS que permitan la identificación de núcleos individuales. Los núcleos se pueden seleccionar comparando la señal de fluorescencia Hoechst entre el control y la muestra teñida.
9. Ordene los núcleos positivos de Hoechst del tubo teñido en un nuevo tubo de 1,5 ml que contenga 50 l de PBS con 5% de BSA.
   NOTA: Los núcleos aislados se pueden recoger en un medio deseado de acuerdo con los requisitos de la aplicación posterior.

Resultados

--El protocolo descrito anteriormente se utilizó para generar la suspensión de un solo núcleo directamente a partir del tejido cerebral del pez cebra. El aislamiento normalmente requiere 20 minutos y evitar el uso de detergente o enzima digestiva. En la Figura 1,que se puede imprimir para que se utilice como orientación, se proporciona un esquema que resume los pasos individuales del protocolo.

Figura 1: Esquema del método basado en columnas giratorias sin detergente para el aislamiento de núcleos.
Representación gráfica de los pasos individuales realizados durante la extracción de núcleos a partir de tejido cerebral de pez cebra fresco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Visualización de la morfología nuclear

Para la confirmación cualitativa de la morfología nuclear, los núcleos aislados se tiñeron con Hoechst y se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia. Los núcleos aparecieron intactos, redondos y bien separados(Figura 2). Es importante destacar que la agregación nuclear, un signo de ruptura de la membrana nuclear, estaba ausente.

Figura 2: Aislamiento de núcleos únicos del cerebro de pez cebra.
Imagen de microscopía de fluorescencia de núcleos manchados de Hoechst demostrando su morfología intacta. Barra de escala: 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Enriquecimiento basado en FACS de los núcleos intactos

El enriquecimiento de núcleos aislados y la eliminación de desechos celulares se realizó mediante citometría de flujo mediante el gating en presencia de una señal de fluorescencia Hoechst. La señal Hoechst se detectó al excitar con violeta, 405 nm, láser (Violeta brillante 421 – BV421). Los núcleos sin mancha mostraban fluorescencia de fondo (Figura 3A, Figura complementaria 1A), mientras que los núcleos manchados mostraban una fuerte señal fluorescente ( Figura3B, Figura complementaria 1B). Como se ilustra en la Figura 3C,los núcleos no manchados y teñidos de Hoechst estaban bien segregados en el canal violeta.

Figura 3: Los núcleos aislados muestran una señal fluorescente Hoechst fuerte y específica en la citometría de flujo.
Gráficas de histograma para suspensión de núcleos individuales que muestran la distribución de la tinción Hoechst. Hoechst se excita por violeta, 405 nm, láser (Brillante Violeta 421 – BV421). La muestra no manchada (A) muestra la señal en el rango de 10⁰-10³, mientras que los núcleos manchados de Hoechst (B) emiten señal en el rango 10³-10^5. Una superposición de intensidad de fluorescencia emitida por muestras no mantenidas (grises) y manchadas (azul) (C) demuestra una clara separación entre las dos poblaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Estrategia de medición de la citometría de flujo para núcleos aislados. Gráficas de flujo representativas para la suspensión aislada de núcleos. Los núcleos aislados se analizaron utilizando la dispersión hacia adelante y el láser violeta BV421, que excita a Hoechst a 405 nm. La muestra no mantenida (A) mostró la señal BV421 en el rango 10⁰-10^3. De 13130 eventos, se detectaron 141 eventos como núcleos únicos basados en FSC-A (1,07% del total) y 0 eventos para núcleos no manchados basados en la señal BV421 (0% del total). Los núcleos manchados Hoechst (B) mostraron la señal BV421 en el rango 10³-10^5. De los 50000 eventos, se detectaron 2418 eventos como núcleos únicos basados en FSC-A (4,84% del total) y 2414 eventos para núcleos positivos de Hoechst basados en la señal BV421 (4,83% del total). Haga clic aquí para descargar esta figura.

Discusión

El perfilado del transcriptoma y el epigenoma con una resolución monocélula ha revolucionado el estudio de los sistemas biológicos. Los estudios a la resolución de una sola célula para un tejido sólido dependen de la disociación del órgano en células individuales o núcleos. La disociación es un procedimiento destructivo que puede introducir artefactos técnicos, que pueden impedir el desarrollo de una representación precisa del sistema^5,,6. Por ejemplo, la disociación enzimática puede dañar las células con morfologías complejas, como neuronas o podocitos, y puede inducir la expresión de los genes de respuesta de estrés y choque térmico^7,,12. Además, el uso de detergente durante la disociación puede romper la membrana nuclear y conducir a la agregación^23,,25. Por lo tanto, la optimización de la disociación para obtener una suspensión de una sola célula o núcleos de la más alta calidad es primordial para el éxito de los experimentos de perfilado de alto rendimiento.

Aquí, demostramos un método de aislamiento de detergente y núcleos libres de enzimas que permite la extracción de núcleos intactos del cerebro de pez cebra en menos de 20 minutos. El protocolo produce núcleos con morfología típica e integridad robusta(Figura 2). A partir de un solo cerebro de pez cebra con un peso de 6 mg, el protocolo produce un total de 60.000 núcleos determinados por un recuento de hemocitoómetros. Los núcleos aislados se pueden utilizar para múltiples aplicaciones aguas abajo, incluyendo snRNA-seq, ATAC-seq e inmunostaining. Los núcleos aislados pueden incluir contaminación cruzada de fracciones citoplasmáticas, particularmente de componentes de retículo endoplasmático y mitocondrias. Para experimentos de perfilado de alto rendimiento, se recomienda encarecidamente el aclaramiento de desechos celulares, particularmente las mitocondrias. La citometría de flujo (Figura 3) proporciona una opción viable para la purificación de núcleos. Alternativamente, el gradiente de sacarosa también se puede utilizar para la eliminación de escombros.

El protocolo se ha probado en la glándula tiroides del ratón (datos no mostrados) y proporciona resultados similares al tejido cerebral del pez cebra. En general, el protocolo proporciona un método robusto, reproducible y universal para la preparación de la suspensión de un solo núcleo, lo que ayuda a simplificar la logística para experimentos de generación de perfiles de alto rendimiento.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Albúmina sérica bovina (BSA)	Carl Roth	90604-29-8 Fracción de	albúmina Clasificadora de
células	BD Biosciences		Centrífuga FACSAria III
Sartorius	A-14C
Tubos Eppendorf (1,5 mL)	Eppendorf	22363204
Falcon (15 mL)	Tubos centrífugos
Falcon (5 mL )	de ensayo de fondo redondo de poliestireno	352052	Corning
Pinzas finas	Fine Science Tools	11295-10
Filtro de células Flowmi (40 μ m)	Sigma	BAH136800040
Microscopio de fluorescencia	Leica DMI6000	B
Frasco de vidrio (250 mL)	VWR	215-1593
Plato con fondo de vidrio	World Precision Instruments	FD3510-100	Fluorodish 35 mm
Pipetas Pasteur de vidrio	VWR	612-1701
Casquillo de pipeta de vidrio	Carl Roth	388.1	Auxiliar de pipeteo pi-pump 2500
Solución de tinción Hoechst	Abcam	ab228551	Hoechst 33342
Minute Kit de aislamiento de núcleos sin detergente	Invent Biotechnologies	NI-024
PBS (10X)	ThermoFisher	70011069
placa de Petri (30 mm)	FisherScientific	11333704	Pyrex
Placa de Petri (90 mm)	Corning	758-10178-CS	Gosselin
Puntas de pipeta	VWR	89079	10 μ L, 200 μ L, 1000 μ
L Pipetas	Gilson	F167380	Pipetman
Hoja de afeitar	Swann-Morton	7981809
sulfonato de metano tricaína	Sigma	E10521
Máquina de vórtice	Scientific Industries	SI-0236	Vortex-Genie 2