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Artículo de método

Un modelo de xenoinjerto derivado del paciente para la malformación venosa

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DOI:

10.3791/61501

⸱

15 de junio de 2020

 ,  , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Presentamos un protocolo detallado para generar un modelo de xenoinjerto murino de malformación venosa. Este modelo se basa en la inyección subcutánea de células endoteliales derivadas del paciente que contienen mutaciones hiperactivantes de los genes TIE2 y/o PIK3CA. Las lesiones de xenoinjerto recapitulan estrechamente las características histopatológicas del tejido del paciente con VM.

Resumen

La malformación venosa (VM) es una anomalía vascular que surge del deterioro del desarrollo de la red venosa que resulta en venas dilatadas y a menudo disfuncionales. El propósito de este artículo es describir cuidadosamente el establecimiento de un modelo de xenoinjerto murino que imita la VM humana y es capaz de reflejar la heterogeneidad del paciente. Las mutaciones TEK (TEK2) y PIK3CA no heredadas hiperactivantes en células endoteliales (EC) se han identificado como los principales impulsores de la ampliación patológica del buque en la máquina virtual. El siguiente protocolo describe el aislamiento, purificación y expansión de la CE derivada del paciente que expresa EL TIE2 mutante y/o PIK3CA. Estas EC se inyectan por vía subcutánea en la parte posterior de ratones athímicos inmunodeficientes para generar canales vasculares ectáticos. Las lesiones generadas con TIE2 o PIK3CA-mutant EC se vascularizan visiblemente dentro de los 7 u20129 días de la inyección y recapitulan las características histopatológicas del tejido del paciente con VM. Este modelo de xenoinjerto de VM proporciona una plataforma confiable para investigar los mecanismos celulares y moleculares que impulsan la formación y expansión de máquinas virtuales. Además, este modelo será fundamental para los estudios traslacionales que prueban la eficacia de los nuevos candidatos a fármacos en la prevención de la ampliación anormal de los vasos observados en la máquina virtual humana.

Introducción

Los defectos en el desarrollo de la vasculatura son la causa subyacente de muchas enfermedades, incluida la malformación venosa (VM). La VM es una enfermedad congénita caracterizada por morfogénesis anormal y expansión de las venas1. Importantes estudios sobre el tejido VM y las células endoteliales (EC) han identificado mutaciones de ganancia de función en dos genes: TEK, que codifica el receptor de tirosina quinasa TIE2, y PIK3CA,que codifica la isoforma p110o (subunidad catalítica) de PI3-kinasa (PI3K)2,3,,4,5. Estas mutaciones somáticas dan lugar a la hiperactivación independiente del ligando de vías clave de señalización angiogénica/crecimiento, incluyendo PI3K/AKT, lo que resulta en venas ectáticas dilatadas3. A pesar de estos importantes descubrimientos genéticos, los mecanismos celulares y moleculares subsiguientes que desencadenan la angiogénesis anormal y la formación de canales vasculares agrandados todavía no se entienden completamente.

Durante la angiogénesis normal y patológica, los nuevos vasos brotan de una red vascular preexistente y la EC se someten a una secuencia de procesos celulares importantes, incluyendo la proliferación, la migración, la remodelación de la matriz extracelular (ECM) y la formación de lúmenes6. Los cultivos in vitro bidimensionales y tridimensionales (2D/3D) de EC son herramientas importantes para investigar cada una de estas propiedades celulares individualmente. Sin embargo, existe una clara demanda de un modelo de ratón que recapitula la ampliación de los vasos patológicos dentro del microambiente anfitrión, al tiempo que proporciona una plataforma eficaz para la evaluación preclínica de fármacos específicos para la investigación traslacional.

Hasta la fecha, no se ha notificado un modelo murino transgénico de VM asociado con mutaciones de ganancia de función de TIE2. Los modelos actuales de ratón VM transgénicos se basan en la expresión omnipresente o restringida en los tejidos de la mutación activadora PIK3CA p.H1047R3,5. Estos animales transgénicos proporcionan una visión significativa de los efectos específicos de todo el cuerpo o tejido de esta mutación PIK3CA de punto caliente. La limitación de estos modelos es la formación de una red vascular altamente patológica que resulta en la letalidad temprana. Por lo tanto, estos modelos de ratón no reflejan completamente la ocurrencia esporádica de eventos mutacionales y la naturaleza localizada de la patología de la VM.

Por el contrario, los modelos de xenoinjerto derivados del paciente se basan en el trasplante o la inyección de tejido patológico o células derivadas de pacientes en ratones inmunodeficientes7. Los modelos de xenoinjertos son una poderosa herramienta para ampliar el conocimiento sobre el desarrollo de enfermedades y el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos8. Además, el uso de células derivadas del paciente permite a los científicos recapitular la heterogeneidad de la mutación para estudiar el espectro de fenotipos de pacientes.

Aquí, describimos un protocolo en el que la EC VM derivada del paciente que expresa una forma mutante constitutivamente activa de TIE2 y/o PIK3CA se inyecta por vía subcutánea en la parte posterior de ratones desnudos athímicos. Las células vasculares inyectadas se suspenden en un marco ECM para promover la angiogénesis como se describe en los modelos anteriores de xenoinjerto vascular9,10,11. Estos VM EC sufren una morfogénesis significativa y generan vasos patológicos agrandados y perfundidos en ausencia de células de soporte. El modelo de xenoinjerto descrito de VM proporciona una plataforma eficiente para la evaluación preclínica de fármacos específicos por su capacidad para inhibir la expansión de lúmenes no controlada.

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Protocolo

Las muestras de tejido del paciente se obtuvieron de los participantes después del consentimiento informado de la Colección y Repositorio de Muestras de Tejidos y Datos de Pacientes con Tumores y Anomalías Vasculares bajo una Junta de Revisión Institucional (IRB) aprobada por las políticas institucionales en Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC), Cancer and Blood Disease Institute y con la aprobación del Comité de Investigación Clínica. Todos los procedimientos con animales descritos a continuación han sido revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la CCHMC.

1. Preparación de materiales y soluciones de stock

  1. Preparación de un medio de crecimiento completo de células endoteliales (EGM)
    1. Suplemento endotelial basal medio (EBM) con los siguientes factores de crecimiento presentes en el kit (ver Tabla de Materiales):Factor de Crecimiento de Fibroblasto humano-Beta (hFGF-), Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), Largo Arg3 Insulina-Like Factor de Crecimiento- I (R3-IGF-I), ácido ascórbico, factor de crecimiento epidérmico (EGF), gentamicina sulfato y ampatería de Añadir 1% De Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina (PSG) solución y 20% de suero bovino fetal (FBS).
      NOTA: No recomendamos añadir hidrocortisona.
    2. La solución estéril filtra la solución bajo una campana de flujo laminar a través de un filtro superior de botella de 0,2 m en una botella de vidrio autoclavado y medios de alícuota en tubos cónicos de 50 ml y se almacena a 4 oC hasta una semana o a -20 oC durante un año.
  2. Preparar colagenasa Una solución de stock
    1. Preparar 50 mg/ml de colagenasa Una solución en stock en 1x solución salina tampón de fosfato (PBS).
    2. Filtro estéril de la solución bajo una campana de flujo laminar con filtro y jeringa de 0,2 m, y almacenar 100 l de alícuotas a -20 oC.
  3. Preparar el medio de recogida de tejido (Buffer A)
    1. Preparar una solución de Stock ca2+/Mg2+ añadiendo 0,927 g de cloruro de calcio dihidrato (CaCl2.2H 2O) y 1 g de sulfato de magnesio heptahidrato (MgSO4.7H2O) a 500 ml de agua destilada. La solución estéril filtra la solución a través de un filtro superior de botella de 0,2 m en una botella de vidrio autoclavado y se almacena a temperatura ambiente (RT).
    2. Suplemento Medio águila modificada de Dulbecco (DMEM) con solución 10% Ca2+/Mg2+ y 2% FBS.
    3. Filtro estéril de la solución bajo una campana de flujo laminar con filtro y jeringa de 0,2 m y almacenar alícuotas de 5 ml a -20 oC.
  4. Recubrimiento de fibronectina de placas de cultivo de tejidos
    1. Preparar el tampón de recubrimiento (Buffer B) disolviendo 5,3 g de carbonato sódico (Na2CO3; 0,1 M) en 500 ml de agua desionizada. Ajuste el pH del tampón a 9,4 utilizando ácido clorhídrico de 1 M (HCl). Filtrar bajo una campana de flujo laminar a través de un filtro superior de botella de 0,2 m en una botella de vidrio autoclavado y almacenar en RT.
    2. Para recubrimiento, pipeta 2 mL/5 mL/10 mL de Tampón B por placa de cultivo de tejido de 60 mm/100 mm/145 mm, respectivamente. Añadir 1 g/cm2 de solución de proteína purificada de fibronectina plasmática humana y distribuir suavemente el líquido sobre la placa.
    3. Incubar la placa a 37oC, 5% CO2 durante 20 min.
    4. Aspirar el búfer B y lavar la placa con PBS antes de cultivar las células.

2. Aislamiento de células endoteliales del tejido del paciente VM

  1. Aislamiento de la CE del tejido sólido de VM
    NOTA: El tejido VM se resegura mediante la desbulción de la cirugía12,,13 bajo un protocolo aprobado por el IRB.
    1. Lavar el tejido VM (el peso de la muestra de tejido suele oscilar entre 0,5 g y 1,5 g) en un 5% de PSG en PBS.
    2. Transfiera el tejido a un plato de cultivo celular de 100 mm, muestree la muestra de tejido picado en trozos pequeños utilizando herramientas de disección quirúrgica estériles y transfiera a un tubo cónico de 50 ml.
    3. Añadir 100 l de colagenasa Una solución de stock a 5 ml de Tampón A para una concentración final de 1 mg/ml, luego añadir esto al tejido y digerir el tejido picado a 37 oC durante 30 min mientras agita el contenido cada 5 min.
    4. Moler cuidadosamente el tejido digerido en RT utilizando una amoladora de pestle de superficie lisa de 6 mm dentro del tubo cónico de 50 ml.
    5. Continúe moliendo cuidadosamente el tejido digerido usando un pestle mientras agrega 5 ml de PBS frío complementado con 0.5% de albúmina sérica bovina (BSA) y 2% PSG. Repita este paso cuatro veces.
    6. Filtrar la solución a través de un colador celular de 100 m en un tubo cónico de 50 ml para eliminar fragmentos de tejido.
    7. Suspensión de la célula de centrifugadora durante 5 min a 400 x g en RT. Proceda al paso 2.3.
  2. Aislamiento de VM EC a partir de sangre lesionada obtenida de la escleroterapia del paciente
    1. Obtener sangre lesional de VM humana de la escleroterapia bajo un protocolo aprobado por el IRB.
    2. Diluir la sangre lesional (el volumen de la muestra suele oscilar entre 0,5 ml y 5 ml) en PBS y un volumen final de 40 ml.
    3. Suspensión de la célula de centrífuga durante 5 min a 200 x g en RT.
  3. Revestimiento inicial de celdas
    1. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet de una sola célula en 1 ml de EGM.
    2. Añadir 9 ml de EGM completo en placas recubiertas de fibronectina (1 g/cm2) de 100 mm y semilla 1 ml de suspensión celular.
    3. Incubar las células a 37oC en una atmósfera humidificada del 5% deCO2.
    4. Cada dos días retire 2 mL de medios y agregue 2 ml de FBS filtrado estéril.
    5. Una vez que los cultivos celulares alcanzan una confluencia de 40-u201250% cambiar el medio para completar EGM. Por lo general, las células tardan entre 2.u20123 semanas en alcanzar esta confluencia.
    6. Observar diariamente la aparición de colonias de EC. Pueden ser reconocidos por su morfología típica "como el adoquines"(Figura 1A). En cada muestra aparecen colonias EC de 3o3o3125.
    7. Cambie el medio cada dos días durante otros 5 días de 5 a 20127 días hasta que las colonias individuales de la CE comiencen a tocarse unas a otras.
  4. Aislamiento manual de colonias ec individuales
    1. Para cosechar colonias EC, lave la placa con 5 ml de PBS y aspire manualmente con una pipeta serológica.
    2. Lleve la placa a un microscopio y circule las ubicaciones de varias colonias EC usando una pluma de marcado tanto en la tapa como en la parte inferior antes de devolverla a la campana de flujo laminar.
    3. Separe las colonias de EC pipeteando 50 l de solución de trippsina-EDTA al 0,05% en las áreas marcadas.
    4. Usando un rascador de celda pequeña o una punta de pipeta, raspe suavemente las células de la placa.
    5. Incline la placa hasta el borde más cercano y enjuague con 1 ml de EGM por área marcada y recoja las células.
    6. Cuente el número de células utilizando un hemocitoómetro o un contador de células automatizado.
    7. Plato de las colonias EC recogidas a una densidad de 1 x 104 células/cm2 en platos de cultivo celular recubiertos de fibronectina (1 g/cm2) que contengan EGM fresco. Al día siguiente, cambie el medio a EGM completo.
    8. Cambie el medio para completar el EGM cada dos días durante 2-u20123 semanas hasta que las células alcancen el 80% de confluencia.
    9. Trypsinize EC con 2 ml de precalentó 0.05% de trippsina-EDTA por plato de 100 mm a 37 oC durante 2 min y neutralizar la trippsina añadiendo 4 ml de EGM.
    10. Recoger la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml y centrífuga a 400 x g en RT durante 5 min. Aspirar las células sobrenadantes y resuspendidas en 2 ml de EGM.
    11. Cuente el número de células utilizando un hemocitoómetro o un contador de células automatizado. Los números de celda típicos obtenidos son 1 x 106 células por placa de cultivo celular de 60 mm o 2 x 106 células por placa de cultivo de tejido de 100 mm.
    12. Pele el líquido de las células por centrifugación a 400 x g a RT durante 5 minutos y aspirar el sobrenadante. Continúe con el paso 3.2.1.

3. Selección y expansión de células endoteliales

  1. Preparación de perlas magnéticas anti-CD31-conjugadas
    1. Vórtice el vial que contiene las perlas magnéticas anti-CD31-conjugadas durante 30 s. El número de perlas requeridas es 8 x 106 perlas/2 x 106 células.
    2. Lavar la cantidad deseada de perlas magnéticas anti-CD31-conjugadas con 1 ml de solución de lavado que contiene 0.1% de BSA en PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    3. Coloque el tubo de microcentrífuga en un imán de aislamiento celular durante 1 min.
    4. Aspirar el sobrenadante y repetir el paso de lavado.
  2. Purificación y enchapado de células endoteliales
    1. Pellet de célula resuspendida obtenido en 2.4.12 en 500 l de solución de lavado que contiene 0.1% de BSA en PBS.
    2. Añadir solución celular al tubo de microcentrífuga que contiene perlas magnéticas y resuspend a fondo.
    3. Incubar durante 20 min a 4oC con una suave inclinación.
    4. Añadir 500 l de 0,1% de BSA en PBS y mezclar bien.
    5. Coloque el tubo sobre un imán de aislamiento celular durante 1 min.
    6. Aspirar suavemente todo el líquido, que contiene la fracción CD31 negativa de las células sin tocar las cuentas.
    7. Lavar el pellet de cordón que contiene la fracción de célula CD31 positiva con 1 ml de 0.1% BSA en PBS y repetir la separación magnética.
    8. Repita el lavado y el paso de separación magnética durante un mínimo de 3 veces para purificar la fracción de celda CD31 positiva.
    9. Resuspender las células endoteliales purificadas en un tubo cónico de 15 ml y girar hacia abajo durante 5 minutos a 400 x g en RT.
    10. Retire el sobrenadante y el pellet de célula resuspendida en 1 ml de EGM.
    11. Añadir 9 ml de EGM completo en placas recubiertas de fibronectina (1 g/cm2) de 100 mm y semilla 1 ml de suspensión celular. Tenga en cuenta que algunas perlas magnéticas todavía están unidas a las células en este paso inicial de siembra. La mayoría de las cuentas se lavan durante la expansión celular, pero un pequeño número de cuentas puede persistir en los pasajes tempranos.
    12. Incubar las células a 37oC en una atmósfera humidificada del 5% deCO2.
    13. Cambie el medio cada dos días hasta que las células alcancen el 80 % de confluencia (Figura 1B).
  3. Expansión de células endoteliales
    1. Una vez que las células alcanzan el 80 % de confluencia, desprende con 2 ml de 0,05% de trippsina-EDTA por plato de 100 mm a 37 oC durante 2 min.
    2. Neutralice la trippsina añadiendo 4 ml de EGM y recoja células en un tubo cónico de 15 ml.
    3. Centrífuga a 400 x g a RT durante 5 min.
    4. Aspirar el sobrenadante, resuspend las células en 2 ml de EGM, y contar el número de células con un hemocitoómetro o mediante el recuento automatizado de células.
    5. Células de semillas a una densidad de 1 x 104 células/cm2 en placas de cultivo de tejido recubiertas de fibronectina de 145 mm (1 g/cm2).
    6. Continúe pasando las celdas hasta que se haya alcanzado el número de celda deseado. Tenga en cuenta que una placa de cultivo de tejido confluente de 145 mm contiene aproximadamente 8 -u20129 x 106 células y el número de células necesarias es 2,5 x 106 células por inyección. Sólo se deben considerar las células entre los pasos 3 y 8 para el xenoinjerto.

4. Protocolo de xenoinjerto derivado del paciente VM

NOTA: En este protocolo utilizamos ratones Foxn1 desnudos de Foxn1 de 5nu años de edad, inmunodeficientes y athímicos.

Todos los procedimientos con animales deben ser aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).

  1. Preparación de materiales el día antes de la inyección
    1. Pre-enfriar jeringas, agujas y puntas de pipeteo en el congelador de -20 oC durante la noche.
    2. Descongelar lentamente la matriz extracelular de membrana del sótano (BMEM) durante la noche en un cubo de hielo colocado a 4 oC para evitar una mayor viscosidad del gel.
  2. Preparación de la suspensión celular inyectable
    1. Trypsinize EC con 5 ml de precalentó 0.05% de trippsina-EDTA por plato de 145 mm a 37 oC durante 2 min.
    2. Neutralice la trippsina añadiendo 5 ml de EGM y recoja células en un tubo cónico de 15 ml.
    3. Centrífuga a 400 x g a RT durante 5 min.
    4. Aspirar el sobrenadante, resuspend las células en 3 ml de EGM, y contar el número de células utilizando un hemocitoómetro o contador de células automatizado.
    5. Determine el número total de celdas que se necesitan para todas las inyecciones planificadas.
      NOTA: El número recomendado de celdas es de 2,5 x 106 células por inyección. Un total de 2 inyecciones se realizan típicamente en cada ratón para duplicados técnicos. Es necesario calcular un exceso del 10% del número de celda para tener en cuenta la pérdida durante la transferencia a la jeringa.
    6. Transfiera el volumen que contiene el número de celda calculado a un nuevo tubo cónico de 50 ml y células de pellets por centrifugación a 400 x g a RT durante 5 min.
    7. Aspirar el sobrenadante, dejando un pequeño volumen (alrededor de 50-u201270 l) para aflojar el pellet.
  3. Preparación de jeringas
    1. Calcule un volumen sobrante de 20 l/inyección para tener en cuenta la pérdida durante la transferencia a la jeringa. Resuspender el pellet celular con 220 l de BMEM por inyección en hielo. El volumen inyectado de la suspensión celular será de 200 l por lesión.
    2. Mezcle bien la suspensión celular sobre hielo para obtener una suspensión celular homogénea y evitar la creación de burbujas.
    3. Usando una pipeta de 1 ml y una jeringa de 1 ml, pipetee simultáneamente la mezcla de células BMEM en la abertura de la jeringa por fuerza de succión mientras tira del émbolo de la jeringa.
    4. Luer bloquee una aguja estéril de 26G x 5/8 pulgadas a la jeringa y mantenga las jeringas preparadas sobre hielo antes de la inyección.
  4. Inyección subcutánea en el ratón
    1. Anestfetizar los ratones con 5% de mezcla de isoflurano/oxígeno a un caudal de 1 L/min utilizando un vaporizador de isoflurano. Asegurar la sedación adecuada de los animales (por ejemplo, falta de respuesta a los pellizcos de los dedos de los dedos). Mantener la anestesia mediante la administración continua de 1,5% de isoflurano/oxígeno suministrado a través del cono nasal.
    2. Coloque ratones en el estómago, exponiendo la región posterior donde se producirá el injerto y desinfecte la región de inyección con un 70% de etanol.
    3. Enrolle suavemente la jeringa preparada para resuspender las células asentadas. Deslice burbujas hasta el extremo de la aguja de la jeringa y expulse un pequeño volumen de la suspensión celular para asegurar la eliminación de todas las burbujas.
      NOTA: Se pueden realizar dos inyecciones para cada ratón: a la izquierda y a la derecha de la parte posterior del ratón.
    4. Pinche y cree una estructura 'similar a una tienda' con el pulgar y el dedo índice e inserte la aguja por vía subcutánea justo debajo de la piel. Asegúrese de que la aguja sólo es la piel profunda mediante la liberación de la piel pellizcada para evitar la inyección en el tejido muscular.
    5. Sosteniendo la aguja en un ángulo de 45o inyectar cuidadosamente 200 s de la suspensión celular para crear una pequeña masa esférica (Figura 1C).
    6. Registre el peso del ratón con una báscula, etiquete el ratón y vuelva a la jaula.
    7. Supervise los ratones después de la sedación para asegurarse de que vuelvan a la actividad normal.
  5. Monitorización del crecimiento de lesiones
    1. Usando una pinza, mida la longitud y la anchura de cada enchufe (Figura 1D).
    2. Mediciones de documentos cada dos días hasta la recolección de lesiones.

5. Recolección y procesamiento de tejidos

  1. Eutanasiar los ratones 9 días después de la implantación en una cámara deCO2 y comprobar los signos vitales para confirmar la muerte. Realizar la luxación cervical en los ratones como un método secundario para eutanasiar el ratón.
  2. Cosecha la lesión/enchufe de xenoinjerto del flanco del ratón mediante disección utilizando fórceps quirúrgicos y tijeras.
    NOTA: Para evitar la rotura de los vasos llenos de sangre dentro del tapón, es importante evitar tocar el tapón de la lesión con herramientas de disección y dejar el tejido circundante excesivo, como la piel unida al tapón.
  3. Sumerja la lesión resecada en PBS para lavarla.
  4. Configure un escenario de cámara con una cámara. Alinee los enchufes en una placa de corte con una regla. Tome una imagen de todos los tapones para registrar la vascularización bruta de las lesiones (Figura 1E).
  5. Arreglar enchufes sumergiendo en 10% formalina durante la noche en RT.
  6. Lave los tapones en PBS al día siguiente y muévalos al 70% de etanol.
  7. Tapones de lesiones de proceso para incrustación de parafina (núcleo patólogo).

6. Seccionamiento de lesiones

  1. Utilice un microtoma para cortar secciones de 5 m de las lesiones murinas recogidas en diapositivas cargadas positivamente.
    NOTA: Para el análisis posterior, las secciones en el centro del enchufe (alrededor de 50-u201270 m en el tejido) son de importancia.
  2. Derretir la parafina a 60oC durante 1 h antes de la tinción.
  3. Desfilinizar y rehidratar el tejido secuencialmente bajo una campana de flujo de humo químico. Por lo tanto, incubar el tobogán en xileno durante 10 min, 100% etanol (EtOH) durante 5 min, 90% EtOH durante 3 min, y 80% EtOH durante 3 min.
  4. Enjuague el tobogán en agua desionizada durante 5 min.

7. Hematoxilina y Eosina (H&E)

  1. Incubar secciones en Hematoxilina durante 2 min.
  2. Coloque los portaobjetos en un frasco de tinción y enjuague en un fregadero con una corriente constante de agua del grifo hasta que el agua esté limpia.
  3. Deshidrate los portaobjetos incubando el tejido secuencialmente en 70% EtOH durante 1 min, 80% EtOH durante 1 min, 90% EtOH durante 1 min, 100% EtOH durante 1 min, y fresco 100% EtOH durante 1 min.
  4. Secciones de manchas en Eosin Y durante 30 s.
  5. Enjuagar en 100% EtOH hasta que la solución esté transparente.
  6. Incubar el tobogán en xilenos durante 2 min. Deje que los portaobjetos se sequen durante 5o u201210 min bajo la campana de humos.
  7. Dispensar una gota de medio de montaje permanente y no acuoso sobre secciones de xenoinjertos y colocar el cubreobjetos en la parte superior.
  8. Deje que las diapositivas se sequen durante la noche antes de tomar imágenes.

8. Inmunohistoquímica

  1. Preparar el tampón de recuperación de antígenos (Tris-EDTA) pesando 0,6 g de tris-base y 1 ml de 0,5 M EDTA a 500 ml de agua desionizada. Ajuste el pH a 9.0 usando 1 M HCl. Añadir 250 l de Tween-20.
  2. Incubar portaobjetos de tejido desfilinizados (como se obtuvo en el paso 6.2-u20126.3) en un vaso de precipitados con tampón de recuperación de antígenos, agitando en un bloque de calentamiento, durante 20 minutos a 95 oC.
  3. Retire el vaso de precipitados del bloque de calefacción, deje que la solución se enfríe a 35 oC y luego lave en PBS durante 3 minutos.
  4. Bloquear secciones de tejido en 5% suero de caballo normal en PBS durante 30 min en RT.
  5. Preparar una solución de trabajo biotinilo con Ulex europaeus agglutinina-I (UEA-I) diluyendo 20 g/ml de UEA-I biotinilado en un 5% de suero de caballo normal en PBS.
  6. Pipet 50-u2012100 l de solución de trabajo UEA-I por sección e incubar durante 1 h en RT en una cámara humidificadora.
  7. Lave los portaobjetos dos veces en PBS durante 3 min.
  8. Secciones deslizantes de enfriamiento en peróxido de hidrógeno al 3% durante 5 minutos en RT.
  9. Lave los portaobjetos dos veces en PBS durante 3 min.
  10. Preparar 5 g/ml de rábano picante de Streptavidin conjugado con peroxidasa en un 5% de suero de caballo normal en PBS.
  11. Pipet 50-u2012100 l en cada corredera de tejido e incubar durante 1 h en RT en una cámara humidificadora.
  12. Lave los portaobjetos dos veces en PBS durante 3 min.
  13. Preparar la solución de 3,3'Diaminobenzidina (DAB) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y añadir 50-u2012100 l por sección.
  14. Incubar secciones durante 10o u201215 min, comprobando y monitoreando el desarrollo de la mancha cada 2o 20125 min.
  15. Lave los portaobjetos tres veces en PBS durante 3 min.
  16. Añadir una gota de Hematoxilina e incubar durante 3 min.
  17. Coloque los portaobjetos en un frasco de tinción y enjuague en un fregadero con una corriente constante de agua del grifo hasta que el agua esté limpia.
  18. Incubar secuencialmente el tobogán en 80% EtOH durante 1 min, 90% EtOH durante 1 min, 100% EtOH durante 1 min, y xileno durante 2 min.
  19. Deje que los portaobjetos se sequen durante 5o u201210 min bajo la campana de humos.
  20. Dispensar una gota de medio de montaje permanente y no acuoso sobre secciones de xenoinjertos y colocar el cubreobjetos en la parte superior.
  21. Deje que las diapositivas se sequen durante la noche antes de tomar imágenes.

9. Análisis de los canales vasculares de origen humano

NOTA: La vascularización de las lesiones VM se cuantifica midiendo el área vascular y la densidad vascular. Sólo los canales vasculares positivos de UEA-I, derivados del ser humano, se consideran para la cuantificación.

  1. Tome de cuatro a cinco imágenes por sección de lesión con un microscopio de campo brillante con un aumento de 20 veces (campos de alta potencia [HPF]). Tome imágenes HPF en un patrón de plano x dentro de la sección de lesiones para evitar la superposición (Figura 1F-H). Incluya una barra de escala en las imágenes tomadas.
  2. Abra las imágenes HPF en La imagen J (Archivo > Abrir). Calibre los píxeles de la barra de escala de la siguiente manera. Utilice la herramienta de línea recta y vaya sobre la barra de escala. Para convertir los píxeles medidos en mm, haga clic en Analizar > Establecer escala.
  3. Haga clic en Analizar > Definir medidas y seleccione Area y Add to overlay.
  4. Mida el área de campo total en un HPF utilizando Analizar > Medir. Guarde esta medición para la cuantificación en el paso 9.8.
  5. Usando la herramienta de selección a mano alzada, esboce manualmente LOS canales vasculares UEA-I+.
    NOTA: Un canal vascular se define como cualquier área que está forrada con UEA-I+ - EC que puede contener células sanguíneas.
  6. Haga clic en Analizar > Medir para cuantificar el área vascular UEA-I+ delineada (mm2/HPF).
  7. Repita esta medición para los cinco HPF tomados dentro de un enchufe.
  8. Promedio del área vascular total de los cinco HPF. El área vascular obtenida por HPF se divide posteriormente por el área de campo de HPF (en mm2, paso 9.5) y se expresa como un porcentaje (%).
  9. Para la cuantificación de la densidad vascular, cuente el número de canales vasculares UEA-I+ de cada HPF tomado. La densidad vascular es el número medio de canales vasculares UEA-I+ contados por área de HPF (vasos/mm2).

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Resultados

Este protocolo describe el proceso de generación de un modelo de xenoinjerto murino de VM basado en la inyección subcutánea de EC derivada del paciente en la parte posterior de ratones desnudos inmunodeficientes. Las colonias celulares endoteliales se pueden cosechar dentro de las 4 semanas posteriores al aislamiento celular inicial del tejido VM o de la sangre lesional(Figura 1A, B). Al día siguiente de la inyección, el tapón de la lesión de xenoinjerto cubre una superficie de aproximadamente 80-u201210...

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Discusión

Aquí, describimos un método para generar un modelo de xenoinjerto derivado del paciente de VM. Este modelo murino presenta un excelente sistema que permite a los investigadores obtener una comprensión más profunda de la agrandación patológica del lumen y será fundamental en el desarrollo de terapias más eficaces y dirigidas para el tratamiento de la VM. Esto se puede adaptar fácilmente para investigar otros tipos de anomalías vasculares como la malformación venosa linfática capilar16. Hay varios p...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Los autores quieren agradecer a Nora Lakes por su corrección. La investigación reportada en este manuscrito fue apoyada por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre, bajo el Premio R01 HL117952 (E.B.), parte de los Institutos Nacionales de Salud. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ratones desnudos atímicos, (Foxn1-nu); 5-6 semanas, machosEnvigo069(nu)/070(nu/+)Inyección subcutánea
Biotinilado Ulex europeaus Aglutinina-I (UEA-I)Vector LaboratoriesB-1065Análisis histológico
Filtro de tapa de botella (500 ml; 0,2 y micro; M)Thermo Fisher974106Cultivo celular
Albúmina sérica bovina (BSA)BSAA7906-50MGCultivo celular; Análisis histológico
Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2.2H2O)SigmaC7902-500GCultivo celular
CalibreMicroscopía electrónica Ciencias50996491Medición de tapones de lesiones
Perlas magnéticas conjugadas CD31 (Dynabeads)Life Technologies11155DSeparación EC
Filtro de células (100 μ M)Greiner542000Cultivo celular
Colagenasa ARoche10103578001Cultivo celular
Tubo cónico; polipropileno (15 mL)Greiner07 000 241Cultivo celular
Tubo cónico; polipropileno (50 mL)Greiner07 000 239Cultivo celular
Frasco de tinción CoplinTed Pella21029Análisis histológico
Cubreobjetos (50 X 22 mm)Fisher Scientific12545EAnálisis histológico
DAB: 3,3'Reactivo de diaminobenzidina (ImmPACT DAB)Vector LaboratoriesSK-4105Análisis histológico
Modificación de Dulbecco del medio de águila (DMEM)Corning10-027-CVCultivo celular
DynaMag-2Life Technologies12321DSeparación EC
Punzón de orejaVWR10806-286Inyección subcutánea
EDTA (0,5 M, pH 8,0)Life Technologies15575-020Análisis histológico
Medio de crecimiento de células endoteliales-2 (EGM2) Bulletkit (medio basal y suplementos)LonzaCC-3162Cultivo celular
Eosina Y (a base de alcohol)Thermo Scientific71211Análisis histológico
EtanolDecon Labs2716Análisis histológico
Suero fetal bovino (FBS) , HyCloneGE HealthcareSH30910.03Cultivo celular
Punta de filtro 1,250 μ LMidSciAV1250-HMúltiples pasos
Punta de filtro 20 μ LVWR10017-064Pasos múltiples
Punta de filtro 200 μ LVWR10017-068
Solución tamponada con formalina de varios pasos (10%)SigmaF04586disección con tapón de lesiones
(INCYTO; Desechable)SKC FILMSDHCN015Cultivo celular
Vector de hematoxilina HematoxilinaH-3401Análisis histológico
Proteína purificada de fibronectina plasmática humana (1 mg/mL)SigmaFC010-10MGCultivo celular
Solución de peróxido de hidrógeno (30% p/p)SigmaH1009Análisis histológico
ImageJ SoftwareAnálisis
Isoflurano, USPAkorn Animal Health59399-106-01Inyección subcutánea
de sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O)SigmaM1880-500GCultivo celular
Matriz de membrana basal (libre de fenol rojo; Corning356237Inyección subcutánea
Tubo de microcentrífuga (1,5 mL)VWR87003-294Separación EC
Portaobjetos de microscopio Superfrost (75 mm x 25 mm)Fisher Scientific1255015-CSAgujas de análisis histológico,
26G x 5/8 pulgadas Agujas estériles Sub-QBecton Dickinson (BD)BD305115Inyección subcutánea
Normal suero de caballoVector LaboratoriesS-2000Análisis histológico
Penicilina-Estreptomicina-L-Glutamina (100X)Corning30-009-CICultivo celular
Medio de montaje permanente (VectaMount)Vector LaboratoriesH-5000Análisis histológico
Mortero tamaño C, lisoThomas Scientific3431F55Aislamiento
Fosfato tamponado Solución salina (PBS)Fisher ScientificBP3994Escala de cultivo celular
VWR65500-202Inyección subcutánea
Pipetas serológicas (10 ml)VWR89130-898Cultivo celular
Pipetas serológicas (5 ml)VWR89130-896Cultivo celular
Carbonato de sodio (Na2CO3)Sigma223530Cultivo celular
Estreptavidina, Peroxidasa de rábano picante, concentrado, para IHCVector LaboratoriesSA-5004Jeringa de cultivo celular
(60 ml)BD Biosciences309653Cultivo en celda
FILTRO DE JERINGA (0.2 y micro; M)Corning431219Jeringas de cultivo celular
(1 mL con Luer Lock)Becton Dickinson (BD)BD-309628Inyección subcutánea
Placa tratada con cultivo de tejidos (100 X 20 mm)Greiner664160Cultivo celular
Placa tratada con cultivo de tejidos (145X20 mm)Greiner639160Placas
de cultivo celular tratadas con cultivo de tejidos (60 X 15) mmEppendorf30701119Cultivo celular
Tris-base (Trizma base)SigmaT6066Análisis histológico
Solución de azul de tripano (0,4 %)Life Technologies15250061Cultivo celular
Tripsina EDTA, 1X (0,05% Tripsina/0,53mM EDTA)Corning25-052-ClCultivo celular
Tween-20Biorad170-6531Análisis histológico
Frasco WheatonVWR16159-798
XilenosFisher ScientificX3P-1GALAnálisis histológico
Hemacitómetro de EC de cultivo celular

Referencias

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  3. Castel, P., et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Science Translational Medicine. 8 (332), 42(2016).
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