Este manuscrito describe un protocolo para la vitrificación de volumen mínimo de ovocitos de gato inmaduros con medios de laboratorio en soportes comerciales. Cubre cada paso desde el aislamiento de ovocitos desde las gónadas ex vivo hasta la vitrificación y el calentamiento.
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Artículo de método
Vitrificación de Volumen Mínimo de Ovocitos Felinos Inmaduros
En este artículo
Resumen
Resumen
En los programas de conservación de animales salvajes, la banca de gametos es crucial para salvaguardar los recursos genéticos de individuos valiosos y especies raras y para promover la preservación de la biodiversidad. En los delitos, la mayoría de las especies están amenazadas de extinción, y las razas domésticas se utilizan como modelo para aumentar la eficiencia de los protocolos para la banca por germoplasma. Entre las técnicas de criopreservación de ovocitos, la vitrificación es cada vez más popular en la reproducción asistida humana y veterinaria. La vitrificación de la criotop, que al principio se desarrolló para ovocitos y embriones humanos, ha demostrado ser adecuada para los ovocitos de gato. Este método ofrece varias ventajas, como la viabilidad en las condiciones de campo y la velocidad del procedimiento, que puede ser útil cuando es necesario procesar varias muestras. Sin embargo, la eficiencia depende en gran medida de las habilidades del operador, y se necesita estandarización entre laboratorios e intra-laboratorios, así como capacitación del personal. Este protocolo describe la vitrificación de volumen mínimo de ovocitos felinos inmaduros en un soporte comercial en un protocolo paso a paso favorable al campo, desde la colección de ovocitos hasta el calentamiento. Siguiendo el protocolo, preservación de la integridad de los ovocitos y viabilidad en el calentamiento (hasta 90%) puede esperarse, aunque todavía hay margen de mejora en la maduración posterior al calentamiento y los resultados del desarrollo embrionario.
Introducción
La criopreservación se ha convertido en un paso clave de las técnicas de reproducción asistida (AT). En los seres humanos, permite la preservación de la fertilidad o el aplazamiento de la paternidad por razones médicas o personales. En animales, es necesario superar la distancia y el tiempo en apareamientos planificados, especialmente en animales de granja y mascotas, o preservar material genético de sujetos valiosos en programas de conservación, particularmente en especies silvestres en peligro de extinción. La criopreservación de gametos es la mejor opción cuando los individuos a criar aún no han sido elegidos o para evitar problemas éticos asociados con la congelac....
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Protocolo
Los procedimientos por la presente descritos no se sometieron a aprobación ética ya que los ovarios de gato fueron recogidos en clínicas veterinarias como subproductos de la ovariectomía de rutina solicitada por el propietario o la ovariohisterectomía.
1. Colección de ovocitos
- Antes de iniciar los experimentos, prepare soluciones para la recolección de ovarios y ovocitos. Preparar la solución de recolección de ovarios con solución salina tamponada de fosfato (PBS) con una mezcla de antibióticos y antimicóticos (100 UI/ml de penicilina G sódica, 0,1 mg/ml de sulfato de estreptomicina, 0,25 g/ml de anfotericina B). Preparar la soluc....
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Resultados
Tras la vitrificación y calentamiento de ovocitos de gato de acuerdo con el protocolo actual(Figura 1 y Figura Suplementaria 1),la gran mayoría de los gametos sobreviven. Después de la vitrificación, entre otras técnicas, la viabilidad se puede evaluar en el microscopio óptico como integridad morfológica22 o con el uso de manchas vitales. Uno de estos últimos es el diacetato de fluoresceína/yoduro propidium (FDA/PI), que permite la identificación de c.......
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Discusión
La criopreservación de ovocitos es una técnica crucial de conservación del germoplasma, especialmente en taxones donde muchas especies están en peligro de extinción, como la familia Felidae. En este manuscrito, se presentó un protocolo sencillo y amigable con el campo para la vitrificación de ovocitos de gato inmaduros. Los medios de laboratorio, los soportes mínimos de vitrificación de volumen y el personal capacitado son los factores clave para el éxito de este método, que permite obtener ovocitos viables de manera con.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por la beca EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) 2016 y por la Universidad degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). También queremos agradecer a la Dra. MariaGiorgia Morselli por su contribución a los experimentos que se describen y a la adquisición de imágenes.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anfotericina B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Pipetas y puntas automáticas | / | / | Necesaria para pipetear 20, 100, 240 y 300 & micro; L |
| Bisturíes quirúrgicos | / | / | El tamaño 10 suele estar bien |
| Pico Bunsen | / | / | / |
| Pinzas | / | /Algunos | pequeños (pinza para mosquitos) para el aislamiento de ovarios, algunos más grandes (pinza Klemmer) para trabajar en nitrógeno líquido |
| Cryotop | Kitazato (distribuidor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.CR | Los distribuidores y el número de catálogo pueden cambiar en diferentes países |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Etilenglicol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Suero fetal bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Pipetas Pasteur de vidrio | / | / | Longitud recomendada 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | Según los bidones del tanque de almacenamiento |
| Etapa de calentamiento | / | / | Todas las etapas de calentamiento están bien, siempre y cuando puedan mantener 38º C |
| Nitrógeno líquido | / | / | / |
| Medio 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicilina G sódica | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Alcohol polivinílico (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Placa | de reproducciónKitazato (distribuidor: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Los distribuidores y el número de catálogo pueden cambiar en diferentes países |
| Microscopio estereoscópico | / | / | Siempre que el operador pueda seleccionar los ovocitos, otros microscopios estereoscópicos están bien |
| Tanque de almacenamiento | / | / | Cualquier tanque lleno regularmente está bien |
| Sulfato de estreptomicina | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Espuma de poliestireno/caja resistente al nitrógeno | / | /Todas | las cajas que pueden contener nitrógeno líquido están bien, siempre y cuando el operador se sienta cómodo. La caja Kitazato se llama "Cooling Rack" |
| Sacarosa | Sigma-Aldrich | S1888/ | |
| Temporizadores | / | /Todos | los temporizadores que se pueden configurar en tiempos de hasta 9 minutos están bien |
Referencias
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.
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Reimpresiones y permisos
