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Artículo de método

Vitrificación de Volumen Mínimo de Ovocitos Felinos Inmaduros

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DOI:

10.3791/61523

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24 de junio de 2020

 , 
1Dipartimento di Scienze Veterinarie per la Salute, la Produzione Animale e la Sicurezza Alimentare 'Carlo Cantoni', Università degli Studi di Milano

En este artículo

Resumen

Este manuscrito describe un protocolo para la vitrificación de volumen mínimo de ovocitos de gato inmaduros con medios de laboratorio en soportes comerciales. Cubre cada paso desde el aislamiento de ovocitos desde las gónadas ex vivo hasta la vitrificación y el calentamiento.

Resumen

En los programas de conservación de animales salvajes, la banca de gametos es crucial para salvaguardar los recursos genéticos de individuos valiosos y especies raras y para promover la preservación de la biodiversidad. En los delitos, la mayoría de las especies están amenazadas de extinción, y las razas domésticas se utilizan como modelo para aumentar la eficiencia de los protocolos para la banca por germoplasma. Entre las técnicas de criopreservación de ovocitos, la vitrificación es cada vez más popular en la reproducción asistida humana y veterinaria. La vitrificación de la criotop, que al principio se desarrolló para ovocitos y embriones humanos, ha demostrado ser adecuada para los ovocitos de gato. Este método ofrece varias ventajas, como la viabilidad en las condiciones de campo y la velocidad del procedimiento, que puede ser útil cuando es necesario procesar varias muestras. Sin embargo, la eficiencia depende en gran medida de las habilidades del operador, y se necesita estandarización entre laboratorios e intra-laboratorios, así como capacitación del personal. Este protocolo describe la vitrificación de volumen mínimo de ovocitos felinos inmaduros en un soporte comercial en un protocolo paso a paso favorable al campo, desde la colección de ovocitos hasta el calentamiento. Siguiendo el protocolo, preservación de la integridad de los ovocitos y viabilidad en el calentamiento (hasta 90%) puede esperarse, aunque todavía hay margen de mejora en la maduración posterior al calentamiento y los resultados del desarrollo embrionario.

Introducción

La criopreservación se ha convertido en un paso clave de las técnicas de reproducción asistida (AT). En los seres humanos, permite la preservación de la fertilidad o el aplazamiento de la paternidad por razones médicas o personales. En animales, es necesario superar la distancia y el tiempo en apareamientos planificados, especialmente en animales de granja y mascotas, o preservar material genético de sujetos valiosos en programas de conservación, particularmente en especies silvestres en peligro de extinción. La criopreservación de gametos es la mejor opción cuando los individuos a criar aún no han sido elegidos o para evitar problemas éticos asociados con la congelación de embriones, especialmente en la medicina humana1. Los espermatozoides son relativamente fáciles de preservar y dan resultados satisfactorios después de la descongelación, pero los ovocitos, debido a sus características estructurales, podrían ser más complejos de almacenar. De hecho, la baja relación superficie/volumen, así como la presencia de la zona pellucida que rodea el ooplasma, limita el movimiento de crioprotectores y agua a través de la célula2. Además, en los animales domésticos, incluidos los feminidos, se caracterizan por un citoplasma rico en lípidos, que se cree que los hace más sensibles a la criopreservación3.

La mayoría de los fetas están amenazados, y el gato doméstico se utiliza como modelo para desarrollar protocolos para la preservación del germoplasma gracias a la disponibilidad de gónadas de la ovariectomía de rutina. En animales salvajes, las gónadas se pueden obtener después de cirugías electivas o (más frecuentemente) se pueden recuperar gametos post morteme inmaduros (vesícula germinal). La estimulación hormonal destinada a obtener ovocitos maduros (metafase II) no es tan común como en los ÁRT humanos debido a las cuestiones éticas y a la respuesta específica de las especies e individuos a los tratamientos4.

Por lo tanto, el desarrollo de estrategias de criopreservación se ha centrado en los gametos inmaduros, que generalmente se pueden recuperar después de la muerte inesperada o repentina de individuos raros. Desde un punto de vista biológico, hay algunas diferencias en la criopreservación de gametos inmaduros o maduros, cada uno con sus ventajas. En primer lugar, el ADN está más protegido en ovocitos inmaduros, cuya vesícula germinal contiene cromosomas rodeados por una membrana nuclear, mientras que el husillo meótico de los ovocitos metafase II podría ser más vulnerable a los criocinitos5. En segundo lugar, los daños por citoesqueleto inducidos por el frío pueden afectar la rotación del husillo, la extrusión del cuerpo polar, la migración pronuclear y la citoquinesis, que podrían tener diferentes impactos según la fase de desarrollo de los ovocitos, influyendo en la progresión de la meiosis o en eventos posteriores a la fertilización. Por último, y tal vez lo más importante, mientras que los ovocitos maduros están listos para ser fertilizados, los gametos inmaduros confían en el apoyo de las células cúmulos circundantes para pasar por la maduración nuclear y citoplasma6,y esta es la razón por la que los complejos cúmulos-oocitos (COC) enteros son criopreservados. Sin embargo, la pérdida de células cúmulos y/o la pérdida de conexión funcional entre el gameto y las células somáticas circundantes son probablemente el efecto más perjudicial de la criopreservación de COCs inmaduros.

Entre las técnicas de criopreservación, la vitrificación es una que se puede aplicar más fácilmente en condiciones de campo. En comparación con la congelación lenta (o de velocidad controlada), la vitrificación es más rápida y no requiere equipos específicos, como un congelador programable. Con el fin de satisfacer los tres principios fundamentales de la vitrificación (es decir, alta viscosidad, conectado a alta concentración crioprotectora, pequeños volúmenes y disminución ultrarráptica de la temperatura), varios medios y soportes especialmente se han desarrollado y utilizado en gatos tanto para ovocitos inmaduros como maduros. A partir de pajitas simples7, los dispositivos se desarrollaron para alcanzar el objetivo de "Volumen mínimo". Cryoloop8, pajitas abiertas (OPS)9, canalones de plástico (paja modificada)10 y criotubos11 se han utilizado, hasta que se emplee un dispositivo más eficiente (es decir, Cryotop)11, mejorando la supervivencia y la reanudación de la meiosis. Cryotop(Figura Suplementaria 1) es un soporte disponible comercialmente que se ha convertido en el sistema abierto electivo para la vitrificación. Desarrollado para la vitrificación de ovocitos y embriones humanos, consiste en una pequeña tira de película unida a un soporte de plástico duro, protegido por una tapa de tubo de plástico durante el almacenamiento12. Gracias a su facilidad de uso y a la extrema reducción del volumen de vitrificación (tan solo 0,1 l), lo que también conduce a tasas de enfriamiento y calentamiento extremadamente rápidas, este soporte de vitrificación se ha aplicado cada vez más en varias especies, incluido el gato doméstico, en el que se ha utilizado con una variedad de medios13,,14,,15,,16,,17.

El propósito de este manuscrito es describir un protocolo de calentamiento de la vitrificación de colección, con pequeñas modificaciones del desarrollado originalmente para ovocitos humanos, que emplea medios de laboratorio y soportes comerciales para la vitrificación de volumen mínimo y se puede aplicar fácilmente en condiciones de campo para la criopreservación de COC felinos inmaduros.

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Protocolo

Los procedimientos por la presente descritos no se sometieron a aprobación ética ya que los ovarios de gato fueron recogidos en clínicas veterinarias como subproductos de la ovariectomía de rutina solicitada por el propietario o la ovariohisterectomía.

1. Colección de ovocitos

  1. Antes de iniciar los experimentos, prepare soluciones para la recolección de ovarios y ovocitos. Preparar la solución de recolección de ovarios con solución salina tamponada de fosfato (PBS) con una mezcla de antibióticos y antimicóticos (100 UI/ml de penicilina G sódica, 0,1 mg/ml de sulfato de estreptomicina, 0,25 g/ml de anfotericina B). Preparar la solución de recolección de ovocitos (es decir, PBS/PVA) con PBS con 100 UI/ml de penicilina G sódica, 0,1 mg/ml de sulfato de estreptomicina y 0,1% (p/v) de alcohol polivinílico (PVA).
  2. Almacene las soluciones para la recolección de ovarios y ovocitos a 4 oC hasta su uso.
  3. El día de los castrajes de las reinas, unas horas antes de procesar las muestras, tomar parte de las soluciones de recolección de ovarios y ovocitos y dejar que se calienten a temperatura ambiente (RT; 25 o 2 oC).
  4. Cuando las muestras lleguen al laboratorio, aísle los ovarios del tejido conectivo circundante y del oviducto y lávelos en un medio de recogida de ovarios frescos en un plato de Petri.
  5. Llene un plato de Petri de 35 mm para cada reina con aproximadamente 3 ml de RT PBS/PVA, y un plato más para recoger los ovocitos.
  6. Coloque un par de ovarios en un plato de Petri y picar la corteza con un bisturí quirúrgico. Asegúrese de que todos los folículos se han roto con la ayuda de un estereomicroscopio (magnificación 8x).
  7. Recoger LOS COC con una pipeta y moverlos en PBS/PVA fresco en el plato Petri asignado. Seleccione cocs de buenas calidades, con un citoplasma homogéneo y oscuro y rodeado de varias capas compactas de células cúmulos (grado I18).

2. Vitrificación

  1. Preparar medios de equilibrio y vitrificación.
    1. Preparar la solución de equilibrio (ES) con 7,5% (v/v) etilenglicol (EG) y 7,5% (v/v) dimetilsulfoxido (DMSO) en Medium 199, con un 20% de suero bovino fetal (FBS).
    2. Preparar la solución de vitrificación (VS) con 15% (v/v) EG, 15% (v/v) DMSO y 0,5 M de sacarosa en Medium 199, con 20% FBS (modificado a partir de 19).
    3. Deje que ES y VS se calienten en RT antes de usarlos.
      NOTA: Se sabe que los crioprotectores (por ejemplo, EG, DMSO) son citotóxicos. Una estrategia para contrarrestar su toxicidad es reducir la temperatura a la que las células están expuestas a ellos20, y los ovocitos suelen estar expuestos a crioprotectores en RT. Así, todo el procedimiento, desde la recogida de ovocitos hasta la vitrificación, se lleva a cabo en RT en este protocolo para evitar fluctuaciones de temperatura.
  2. Preparar el plato de vitrificación (es decir, un plato especial que consiste en seis pozos cónicos divididos en dos filas, conocidos como "Repro plate"). Prepare una fila (tres pozos) para cada soporte de vitrificación.
    1. Añadir 20 l de ES en la parte inferior del primer pocólo.
    2. Agregue 300 l de VS en la parte inferior del segundo (es decir, 1VS) y tercero (es decir, 2VS).
  3. Equilibre los COC en ES.
    1. Con una pipeta de diámetro pequeño (por ejemplo, una pipeta Pasteur tirada de un pico Bunsen para hacerlo más delgado – el diámetro debe ser de al menos 200 m), transferir uno (o más) COC(s) en la parte inferior del primer pozo.
      NOTA: Elija el tamaño de la pipeta de acuerdo con el número de capas de celdas cúmulos que rodean los ovocitos, para las dimensiones de los COC, con el objetivo de reducir en la medida de lo posible el volumen de medios que se transfieren con COCs en cada paso. Con el protocolo actual, los operadores capacitados pueden vitrificar con éxito hasta ocho COC felinos por cada soporte de vitrificación.
    2. Agregue lentamente 20 l de ES en el borde de la caída. Espere 3 minutos.
    3. Agregue lentamente otros 20 l de ES en el borde de la caída. Espere 3 minutos.
    4. Agregue lentamente 240 l de ES en el borde de la caída. Espera 9 minutos.
    5. Mientras espera, prepare una caja con nitrógeno líquido (LN2),etiquete un soporte de vitrificación con el código de identificación del experimento/gato y déjelo abierto. Ponga ambos cerca del estereomicroscopio, para que puedan ser fácilmente accesibles mientras trabajan.
      ¡Precaución! Use equipo de protección personal cuando manipule LN2.
    6. Alternativamente, si varios COC tienen que ser vitrificados, comience el primer paso de equilibrio (véase el paso 2.3.1 - 2.3.2) para otro grupo de COC (que se cargará en un nuevo soporte de vitrificación).
  4. Vitrify COCs en VS en menos de 90 segundos.
    1. Usando la misma pipeta de diámetro pequeño, llénala con 1VS, toma los COC de la parte inferior del primer pozo (ES) y muévelos a la superficie del segundo pozo (1VS).
    2. Lave la pipeta con 1VS.
    3. Tome los COC y muévalos en otra área (en la parte inferior) del pozo; mezclar el medio que los rodea con la pipeta.
    4. Llene la pipeta con 1VS en otra área del pozo, tome los COC, muévalos y mezcle el medio que los rodea con la pipeta.
    5. Repita el paso 2.4.4.
    6. Lave la pipeta con 2VS.
    7. Tome los COC y muévalos en la parte inferior del tercer pozo (2VS); mezclar el medio que los rodea con la pipeta.
    8. Llene la pipeta con 2VS en otra área del pozo, tome los COC, muévalos y mezcle el medio que los rodea con la pipeta.
    9. Repita el paso 2.4.8.
    10. Llene la pipeta con 2VS en otra área del pozo, tome los COC y cárguelos en la tira del soporte de vitrificación, lo más cerca posible de la punta. Aspirar el exceso de medio para reducir el volumen de VS tanto como sea posible.
    11. Sumerja inmediatamente el soporte de vitrificación en LN2,moviéndolo. Ciérralo con la ayuda de algunas abrazaderas, asegurándose de que siempre permanece inmersa en LN2.
      NOTA: Mantener el momento adecuado es crucial debido a la toxicidad celular crioprotectora. Debido a su alta concentración en medios de vitrificación, la exposición celular debe ser controlada, también mediante la ejecución impecable de la técnica21. Si las muestras son abundantes, considere dividirlas para procesarlas más rápidamente y minimizar la cantidad de tiempo desde la recolección de ovocitos hasta la vitrificación.
  5. Almacene los soportes de vitrificación cargados en una copa y guárdelos en un tanque LN2 de almacenamiento hasta el calentamiento.
    NOTA: Todos los pasos anteriores del protocolo también se pueden aplicar en condiciones de campo si LN2 está disponible. Un remitente seco será necesario para transportar las muestras al laboratorio de forma segura y luego proceder allí con las siguientes fases.

3. Calentamiento

  1. Prepare los medios de calentamiento.
    1. Preparar la solución de descongelación (TS) con 1 M de sacarosa en Medium 199, con 20% FBS.
    2. Preparar la solución de dilución (DS) con sacarosa de 0,5 M en el medio 199, con 20% FBS.
    3. Preparar la solución de lavado (WS) con Medium 199 con 20% FBS.
    4. Antes de su uso, caliente TS a 38 oC y DS y WS en RT.
  2. Si es necesario, preparar el medio de cultivo para el uso posterior de COC calentados (por ejemplo, maduración in vitro, IVM).
  3. Coloque el escenario calefactor cerca del estereomicroscopio y enciéndalo (38 oC). Ponga la tapa de un plato de Petri para calentar.
  4. Cuando todo esté listo, transfiera los soportes de vitrificación que deben calentarse desde el tanque de almacenamiento a una caja con LN2y coloque la caja cerca del estereomicroscopio.
  5. Prepare la "placa de reproducción". Prepare una fila para cada soporte de vitrificación que tenga que calentarse.
    1. Añadir 300 l de DS en la parte inferior del primer pocó.
    2. Agregue 300 l de WS en la parte inferior del segundo (es decir, 1WS) y de los pomos terceros (es decir, 2WS).
  6. Haga una gota de TS (100 l) en la tapa del plato Petri.
  7. Con abrazaderas, abra un soporte de vitrificación en el LN2.
  8. Coloque el TS caer debajo del estereomicroscopio y con un movimiento rápido tome el soporte de vitrificación del LN2 y sumerja su tira en la gota, moviéndola hasta que todos los COC se desprendan. Quite el soporte de la caída tan pronto como esté vacío, pero deje los COC en el TS durante 1 minuto en total (desde la inmersión hasta el siguiente paso).
  9. Tome una pipeta similar a la utilizada para la vitrificación y llénelo con DS. Tome los COC de la caída (TS) y muévalos a la parte inferior del primer pozo (DS). Espere 3 minutos.
  10. Lave la pipeta con 1WS. Tome los COC y muévalos en la parte inferior del segundo pozo (1WS). Espere 5 minutos.
  11. Lave la pipeta con 2WS. Tome los COC y muévalos en la superficie del tercer pozo (2WS). Espere a que toquen el fondo del pozo.
  12. Repita el paso 3.11 utilizando otra área del pozo.
  13. Lave la pipeta con un medio de cultivo y mueva los ovocitos al plato de cultivo para el siguiente uso (por ejemplo, IVM).

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Resultados

Tras la vitrificación y calentamiento de ovocitos de gato de acuerdo con el protocolo actual(Figura 1 y Figura Suplementaria 1),la gran mayoría de los gametos sobreviven. Después de la vitrificación, entre otras técnicas, la viabilidad se puede evaluar en el microscopio óptico como integridad morfológica22 o con el uso de manchas vitales. Uno de estos últimos es el diacetato de fluoresceína/yoduro propidium (FDA/PI), que permite la identificación de c...

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Discusión

La criopreservación de ovocitos es una técnica crucial de conservación del germoplasma, especialmente en taxones donde muchas especies están en peligro de extinción, como la familia Felidae. En este manuscrito, se presentó un protocolo sencillo y amigable con el campo para la vitrificación de ovocitos de gato inmaduros. Los medios de laboratorio, los soportes mínimos de vitrificación de volumen y el personal capacitado son los factores clave para el éxito de este método, que permite obtener ovocitos viables de manera con...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por la beca EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) 2016 y por la Universidad degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). También queremos agradecer a la Dra. MariaGiorgia Morselli por su contribución a los experimentos que se describen y a la adquisición de imágenes.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anfotericina BSigma-AldrichA2942/
Pipetas y puntas automáticas//Necesaria para pipetear 20, 100, 240 y 300 & micro; L
Bisturíes quirúrgicos//El tamaño 10 suele estar bien
Pico Bunsen///
Pinzas//Algunospequeños (pinza para mosquitos) para el aislamiento de ovarios, algunos más grandes (pinza Klemmer) para trabajar en nitrógeno líquido
CryotopKitazato (distribuidor: MBT - Medical Biological Technologies)01.CRLos distribuidores y el número de catálogo pueden cambiar en diferentes países
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD2650/
Etilenglicol (EG)Sigma-AldrichE9129/
Suero fetal bovino (FBS)Sigma-AldrichF9665/
Pipetas Pasteur de vidrio//Longitud recomendada 230 mm (100+130)
Gobelets//Según los bidones del tanque de almacenamiento
Etapa de calentamiento//Todas las etapas de calentamiento están bien, siempre y cuando puedan mantener 38º C
Nitrógeno líquido///
Medio 199Sigma-AldrichM4530/
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Sigma-AldrichD8662/
Penicilina G sódicaSigma-AldrichP3032/
Alcohol polivinílico (PVA)Sigma-AldrichP8136/
Placade reproducciónKitazato (distribuidor: MBT - Medical Biological Technologies)01.K-2Los distribuidores y el número de catálogo pueden cambiar en diferentes países
Microscopio estereoscópico//Siempre que el operador pueda seleccionar los ovocitos, otros microscopios estereoscópicos están bien
Tanque de almacenamiento//Cualquier tanque lleno regularmente está bien
Sulfato de estreptomicinaSigma-AldrichS9137/
Espuma de poliestireno/caja resistente al nitrógeno//Todaslas cajas que pueden contener nitrógeno líquido están bien, siempre y cuando el operador se sienta cómodo. La caja Kitazato se llama "Cooling Rack"
SacarosaSigma-AldrichS1888/
Temporizadores//Todoslos temporizadores que se pueden configurar en tiempos de hasta 9 minutos están bien

Referencias

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