Aislamiento y enriquecimiento de células progenitoras epiteliales pulmonares humanas para cultivo de organoides

Bindu Konda; Apoorva Mulay; Changfu Yao; Stephen Beil; Edo Israely; Barry  R. Stripp

doi:10.3791/61541

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Artículo de método

Aislamiento y enriquecimiento de células progenitoras epiteliales pulmonares humanas para cultivo de organoides

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DOI:

10.3791/61541

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21 de julio de 2020

Bindu Konda¹ , Apoorva Mulay¹ , Changfu Yao¹ , Stephen Beil¹ , Edo Israely¹ , Barry R. Stripp¹

¹Lung and Regenerative Medicine Institutes, Department of Medicine, Cedars-Sinai Medical Center

En este artículo

Resumen

Este artículo proporciona una metodología detallada para los enfoques de disociación tisular y fraccionamiento celular que permiten el enriquecimiento de células epiteliales viables de las regiones proximal y distal del pulmón humano. En este caso, estos enfoques se aplican para el análisis funcional de células progenitoras epiteliales pulmonares mediante el uso de modelos de cultivo de organoides 3D.

Resumen

Los modelos organoides epiteliales sirven como herramientas valiosas para estudiar la biología básica de un sistema de órganos y para el modelado de enfermedades. Cuando se cultivan como organoides, las células progenitoras epiteliales pueden autorrenovarse y generar una progenie diferenciadora que exhibe funciones celulares similares a las de sus contrapartes in vivo . A continuación describimos un protocolo paso a paso para aislar progenitores específicos de la región del pulmón humano y generar cultivos organoides 3D como herramienta experimental y de validación. Definimos las regiones proximales y distales del pulmón con el objetivo de aislar las células progenitoras específicas de la región. Utilizamos una combinación de disociación enzimática y mecánica para aislar las células totales del pulmón y la tráquea. Las células progenitoras específicas se fraccionaron de las células de origen proximal o distal utilizando la clasificación celular asociada a la fluorescencia (FACS) basada en marcadores de superficie específicos del tipo celular, como NGFR para clasificar las células basales y HTII-280 para clasificar las células alveolares tipo II. Se utilizaron progenitores basales o alveolares aislados de tipo II para generar cultivos organoides 3D. Tanto los progenitores distales como los proximales formaron organoides con una eficiencia de formación de colonias del 9-13% en la región distal y del 7-10% en la región proximal cuando se chapan 5000 células / pozo en el día 30. Los organoides distales mantuvieron las células alveolares tipo II HTII-280⁺ en cultivo, mientras que los organoides proximales se diferenciaron en células ciliadas y secretoras para el día 30. Estos cultivos organoides 3D se pueden utilizar como una herramienta experimental para estudiar la biología celular del epitelio pulmonar y las interacciones mesenquimales epiteliales, así como para el desarrollo y validación de estrategias terapéuticas dirigidas a la disfunción epitelial en una enfermedad.

Introducción

Los espacios aéreos del sistema respiratorio humano se pueden dividir ampliamente en zonas conductoras y respiratorias que median el transporte de gases y su posterior intercambio a través de la barrera epitelial-microvascular, respectivamente. Las vías respiratorias conductoras incluyen tráquea, bronquios, bronquiolos y bronquiolos terminales, mientras que los espacios de aire respiratorio incluyen bronquiolos respiratorios, conductos alveolares y alvéolos. El revestimiento epitelial de estos espacios aéreos cambia de composición a lo largo del eje proximo-distal para adaptarse a los requisitos únicos de cada zona funcionalmente distinta. El epitelio pseudoestratific....