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Artículo de método

Un ensayo de degranulación de mastocitos ex vivo utilizando células de exudado peritoneal crudo y estimulación de antígenos naturales

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DOI:

10.3791/61556

⸱

27 de abril de 2021

 ,  , 
1College of Pharmacy, Chungnam National University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Hemos establecido un ensayo de degranulación ex vivo de mastocitos llevado a cabo mediante la incubación de células crudas de exudado peritoneal aisladas de ratones, tratadas con un agente farmacológico de interés y administradas previamente IgE anti-dinitrofenol (DNP), con DNP en una proteína transportadora.

Resumen

Los estabilizadores de mastocitos son una parte esencial de los medicamentos para la alergia. La anafilaxia sistémica pasiva (PSA) es un ensayo animal ampliamente utilizado para investigar el efecto de un agente farmacológico de interés sobre los mastocitos in vivo. Dado que los síntomas anafilácticos se atribuyen principalmente a la exocitosis de los gránulos de los mastocitos, se concibe que el agente que causa la mejora de los síntomas tiene una actividad estabilizadora de los mastocitos. A pesar de ello, es prudente confirmar la actividad demostrando directamente la disminución de la actividad funcional de los mastocitos tras su tratamiento. Para ello, se emplean de forma rutinaria ensayos de degranulación in vitro con una línea de mastocitos inmortalizados o mastocitos primarios cultivados. Los resultados de los ensayos in vitro e in vivo no siempre son similares entre sí; sin embargo, las condiciones de tratamiento (p. ej., dosis de tratamiento, tiempo, entornos circundantes) para los ensayos in vitro suelen ser distintas de las del ensayo in vivo, como el PSA. En la búsqueda de un ensayo in vitro (o ex vivo) para reflejar más de cerca el efecto de un agente farmacológico en los mastocitos in vivo, ideamos el ensayo de degranulación ex vivo de mastocitos en el que las células crudas de exudado peritoneal (PEC) aisladas de los ratones, tratadas con el agente y administradas IgE anti-dinitrofenol (DNP), se incubaron directamente con DNP en una proteína transportadora. Resultó que el ensayo no solo era útil para validar la actividad estabilizadora de mastocitos de un agente farmacológico indicado por el ensayo in vivo, sino también práctico y altamente reproducible.

Introducción

Los mastocitos juegan un papel central en la alergia 1,2. Cuando la IgE localizada en la superficie de los mastocitos a través de la interacción con el receptor de alta afinidad por IgE (FcεRI) encuentra un alérgeno afín, se provoca una cascada de señalización para provocar la liberación de los gránulos. Como resultado, se liberan una variedad de moléculas efectoras de alergias, incluidas las monoaminas (por ejemplo, histamina, serotonina), citocinas (por ejemplo, TNF-α) y enzimas proteolíticas (por ejemplo, triptasa, quimasa), para causar una serie de reacciones inmunológicas, neurológicas y vasomusculares 3,4.

Una clase de productos farmacéuticos se llama estabilizador de mastocitos que alivia los síntomas de la alergia al atenuar la función de losmastocitos 5. La anafilaxia sistémica pasiva (PSA) es un modelo animal que se utiliza a menudo para sondear la actividad estabilizadora de los mastocitos de los agentes farmacológicos. Dado que los síntomas anafilácticos son el resultado principalmente de la activación de los mastocitos tras la interacción de la IgE específica del hapteno transferida pasivamente con el hapteno en una proteína transportadora inyectada posteriormente en el animal, es bien recibido que un agente farmacológico de interés tenga una actividad estabilizadora de los mastocitos cuando su tratamiento da lugar a una mejora de los síntomas6. Aun así, a menudo es imperativo demostrar directamente el deterioro de la función de los mastocitos por parte del agente en un experimento separado para descartar la posibilidad de que la mejoría de los síntomas se derive de un mecanismo distinto de la supresión de la función de los mastocitos.

El ensayo de degranulación de mastocitos, que se lleva a cabo estimulando los mastocitos con un reactivo químico o un antígeno específico de IgE formando un complejo con FcεRI en la superficie de los mastocitos para inducir exocitosis de los gránulos secretores (es decir, degranulación), se utiliza generalmente para determinar la actividad estabilizadora de los mastocitos de un reactivo farmacológico in vitro7. En este ensayo se utilizan varios tipos de células, como la línea celular 8 de leucemia basófila(RBL) en rata, los mastocitos derivados de la médula ósea (BMMC)9 y los mastocitos derivados de células peritoneales (PCMC)10. Si bien es útil porque se puede obtener fácilmente una gran cantidad de células, RBL es una línea celular de cáncer inmortalizada cuyas propiedades celulares ya no son similares a las de los mastocitos en el cuerpo. La adquisición de un número suficiente de BMMC o PCMC, aunque sus propiedades celulares puedan parecerse más a las de los mastocitos en el cuerpo, suele ser costosa y requiere mucho tiempo.

Un ensayo de degranulación con mastocitos primarios purificados es una alternativa deseable11. Sin embargo, el uso de este tipo de ensayo no está muy extendido como método fácil para purificar mastocitos a partir de tejido animal, en particular de tejido de ratón, con un alto rendimiento, y aún no se dispone de pureza. Además, dado que la concentración y la duración del tratamiento con un agente farmacológico para inhibir la función de los mastocitos in vitro pueden no coincidir siempre con los del tratamiento in vivo, los resultados obtenidos con un ensayo de degranulación in vitro pueden ser erróneos con los de un ensayo in vivo, como el PSA, y viceversa. Por lo tanto, existe una gran demanda de un nuevo ensayo de degranulación, que no solo imite de cerca la forma en que se produce la activación de los mastocitos in vivo, sino que también refleje con precisión los efectos de un reactivo farmacológico ejercido sobre los mastocitos in vivo. Con el fin de satisfacer estas necesidades, ideamos un ensayo de degranulación de mastocitos ex vivo en el que los mastocitos en células de exudado peritoneal (PEC) aislados de los ratones, tratados con un agente farmacológico de interés y administrados previamente IgE específica para dinitrofenol (DNP), se estimulan con albúmina sérica bovina (BSA) conjugada con DNP.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la guía proporcionada por el IACUC (Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales) de la Universidad Nacional de Chungnam (Número de Protocolo Animal: CNU-00996).

1. Cuantificación de moléculas específicas de mastocitos en el lisado de PEC crudas

  1. Aislar las células de la cavidad peritoneal del ratón12.
    1. Anestesiar a un ratón (8 semanas de edad, macho, BALB/C) con isoflurano. Eutanasia a través de la luxación cervical.
    2. Coloque el mouse sobre un bloque de espuma. Limpie el abdomen con etanol al 70%.
    3. Corta la piel ventral longitudinalmente con unas tijeras de borde romo. Retira la piel del ratón con pinzas y tijeras.
    4. Inyecte 6 mL de tampón B13 Tyrode helado en la cavidad peritoneal con una jeringa de 10 mL con una aguja de 26 G. Inserte la aguja suavemente para evitar pinchar ningún órgano.
    5. Masajee el abdomen del ratón durante 60-90 s para recoger las células peritoneales en el tampón B de Tyrode. Hazlo con cuidado para no dañar los vasos sanguíneos.
    6. Inserte la aguja (20 G) conectada a una jeringa de 10 ml con bisel. Aspire el líquido lentamente desde la cavidad peritoneal (generalmente 5-6 mL).
    7. Retire la aguja de la jeringa. Dispense el líquido peritoneal en un tubo cónico de 50 mL. Mantenga el tubo en hielo.
    8. Repita los pasos 1.1.4 - 1.1.7.
    9. Centrifugar el tubo a 300 x g durante 5 min a 10 °C. Vuelva a suspender las células en 1 ml de tampón de lisis de 1 x glóbulo rojo (RBC). Mantenga las células en hielo durante 3 min.
    10. Diluir la suspensión celular con 2 mL de tampón B de Tyrode. Centrifugar el tubo a 300 x g durante 5 min a 10 °C.
    11. Retire el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 0,5 mL de tampón A13 de Tyrode.
    12. Cuente las células con un hemocitómetro. Ajuste el número de celdas a 5 x 106/mL con el tampón A de Tyrode.
  2. Preparación de PEC empobrecidas por mastocitos utilizando un sistema de purificación de pilas magnéticas14.
    1. Centrifugar 5 x 105 PEC crudos a 300 x g durante 5 min a 10 °C. Vuelva a suspender el pellet en 200 μL de tampón de purificación celular PBSBE (0,5% BSA, 2 mM EDTA, 1 x PBS, pH 7,4).
    2. Añadir 1 μL de bloqueador Fc (0,5 mg/mL) a las células para evitar la unión inespecífica del anticuerpo monoclonal (mAb) anti-c-kit que se añadirá a continuación. Mantenga las células en hielo durante 5 min.
    3. Añadir 1 μL de c-kit biotinilado anti-ratón mAb15 (0,5 mg/mL). Mantenga las células en hielo durante 10 minutos.
    4. Agregue 2 mL de tampón PBSBE. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min a 10 °C.
    5. Retire el sobrenadante. Lavar las células de nuevo con 2 mL de tampón PBSBE.
    6. Vuelva a suspender las células en 90 μL de tampón PBSBE. Añadir 10 μL de microperlas conjugadas con estreptavidina. Mantenga las células en hielo durante 15 min.
    7. Agregue 2 mL de tampón PBSBE. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min a 10 °C.
    8. Cargue 500 μL de tampón PBSBE en una columna magnética media durante el centrifugado. Permita que el búfer fluya a través de la columna.
    9. Retire el sobrenadante después de la centrifugación. Vuelva a suspender las células en 500 μL de tampón PBSBE.
    10. Cargue las celdas en la columna. Recoge las celdas que pasan libremente por la columna.
    11. Lave la columna con 500 μL de tampón PBSBE. Recoge de nuevo las celdas que pasan por la columna.
    12. Repita el paso 1.2.11.
    13. Combine las celdas de los pasos 1.2.9-1.2.11 en un tubo. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min a 10 °C.
    14. Vuelva a suspender las celdas en el búfer A de Tyrode. Cuenta las celdas. Ajuste el número de celdas a 5 x 106 celdas/mL.
  3. Preparar el lisado de las PEC.
    1. Placa PEC (por ejemplo, 5 x 105) en una placa de fondo redondo de 96 pocillos, respectivamente. Centrifugar la placa a 300 x g durante 2 min a 10 °C para recoger las células. Retire el sobrenadante con cuidado con una pipeta.
    2. Añada 100 μL de tampón de lisis celular al pellet de células. Vuelva a suspender las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces suavemente. Mantenga el plato en hielo durante 60 min.
    3. Centrifugar la placa a 300 x g durante 5 min a 10 °C para eliminar los restos de la célula. Transfiera el sobrenadante (el lisado celular) a una nueva placa de 96 pocillos.
  4. Medir la actividad enzimática de la β-hexosaminidasa16.
    1. Agregue el lisado celular (50 μL) a una solución de sustrato de β-hexosaminidasa precalentada (50 μL) en una microplaca de 96 pocillos. Mézclalos suavemente con una pipeta.
    2. Incubar la placa en una incubadora a 37 °C. Agregue 50 μL de solución de parada (100 mM de glicina, pH 10,7) después de 30 min para terminar la reacción enzimática.
    3. Lectura del diámetro exterior de las mezclas de reacción con un lector de microplacas de absorbancia UV-visible en un ajuste de longitud de onda dual; 405 nm para determinar el nivel de la reacción enzimática y 620 nm para la sustracción automática de fondo, respectivamente.
  5. Mide la concentración de histamina17.
    1. Transfiera 100 μL de los lisados celulares aclarados a la placa recubierta de mAb antihistamínico suministrada con el kit ELISA de histamina. Realice el ensayo ELISA de histamina competitivo siguiendo el manual del fabricante.
    2. Lea el diámetro exterior de las muestras con un lector de microplacas de absorbancia UV-visible a una longitud de onda de 450 nm.
  6. Determinar la proporción de mastocitos en PECs con citometría de flujo18.
    1. Transfiera 1 x 105 PEC crudos o empobrecidos en mastocitos en una placa de 96 pocillos de fondo redondo. Centrifugar la placa a 300 x g durante 2 min a 10 °C.
    2. Vuelva a suspender las células en 50 μL de tampón FACS. Añadir 1 μL de c-kit anti-ratón (0,5 mg/mL) y mAbs de IgE anti-ratón (0,5 mg/mL).
    3. Vórtice las células brevemente. Mantenga las celdas en hielo durante 20 minutos en la oscuridad.
    4. Llene los pocillos con 150 μL de tampón FACS. Centrifugar la placa a 300 x g durante 2 min a 10 °C. Deseche el tampón volteando rápidamente el plato.
    5. Vuelva a suspender las células con 150 μL de tampón FACS que contenga yoduro de propidio (1 μg/mL). Analice las células con un citómetro de flujo.

2. Ensayo de degranulación de mastocitos utilizando PEC crudos

  1. Determinar el grado de degranulación de los mastocitos (% de degranulación).
    1. Inyecte 3 ratones BALB/C (8 semanas de edad, machos) por vía intravenosa (i.v.) con 3 μg de mAb anti-DNP (IgE de ratón). Aísle las PEC un día después de la inyección de Ab (consulte el paso 1.1).
    2. Placa de 90 μL de PEC crudos (5,5 x 106/mL) en una placa de fondo plano de 96 pocillos (4 pocillos en total). Incubar la placa en una incubadora deCO2 humidificada a 37 oC durante 30 minutos.
    3. Agregue 10 μL de DNP-BSA (5 ng/mL en 1x PBS) a los pocillos que contienen PEC. Incubar la placa durante 10 min en una incubadora deCO2 a 37 °C.
    4. Centrifugar la placa a 300 x g durante 5 min a 10 °C inmediatamente después de la incubación. Tome los sobrenadantes (100 μL) cuidadosamente con una pipeta. Guárdelos en una nueva placa de 96 pocillos de fondo redondo sobre hielo.
    5. Añadir 100 μL de tampón de lisis celular (0,1% Triton X-100 en 1 x PBS, pH 7,4) a los pocillos de microplacas que contienen PEC. Mantenga el plato en hielo durante 60 min.
    6. Realizar el ensayo de β-hexosaminidasa.
      1. Tome dos juegos de los sobrenadantes y los lisados celulares correspondientes, respectivamente, de los cuatro que se han almacenado en hielo después del ensayo de degranulación (consulte los pasos 2.1.4 y 2.1.5). Divida el sobrenadante y el lisado celular en dos pocillos separados (50 μL cada uno) para duplicar el ensayo.
      2. Agregue 50 μL de solución de sustrato de β-hexosaminidasa a cada pocillo. Incubar la placa a 37 °C durante 30 min. Añadir 50 μL de solución de parada (100 mM de glicina, pH 10,7) a la mezcla de reacción.
      3. Lea el diámetro exterior de las mezclas de reacción (consulte el paso 1.4.3). Calcule el grado de degranulación de los mastocitos de la siguiente manera.
        % Degranulación =OD sobrenadante /(OD sobrenadante +OD lisado) X 100%
    7. Realice el ensayo de histamina.
      1. Añada 100 μL de 1x PBS a otros dos pocillos de los sobrenadantes y los lisados celulares correspondientes guardados después de la degranulación para llevar el volumen total de las muestras a 200 μL. Divida cada muestra en dos pocillos separados en una placa ELISA de histamina provista con el kit ELISA de histamina.
      2. Realice el ensayo ELISA siguiendo el manual del fabricante. Lea el diámetro exterior de las muestras con un lector de microplacas de absorbancia UV-visible a una longitud de onda de 450 nm. Calcule el grado de degranulación como en 2.1.6.3.
        % Degranulación = [histamina]sup /([histamina]sup + [histamina]lisado) X 100%
  2. Evaluar los efectos de los medicamentos antialérgicos sobre los mastocitos ejercidos in vivo con el ensayo de degranulación de mastocitos ex vivo.
    1. Administrar por vía oral (p.o.) 200 μL de dexametasona19 (DEX) y ketotifeno20 (KET), respectivamente, a ratones (6 semanas de edad, machos) una vez al día durante 3 días (6 ratones/grupo).
    2. Inyectar a los ratones por vía intravenosa (i.v.) 3 μg de IgE anti-DNP después deltercer tratamiento. Divida cada grupo de ratones en dos jaulas separadas (3 ratones/jaula); uno para el ensayo de PSA y el otro para el ensayo de degranulación de mastocitos ex vivo.
    3. Realizar el ensayo de PSA
      1. Inyecte a los ratones DNP-BSA (80 μg) un día después de la inyección de IgE anti-DNP. Mida la temperatura corporal con un termómetro rectal cada 15 minutos durante 1 h a partir de la inyección de DNP-BSA.
      2. Tome la sangre un día después de la inyección de DNP-BSA. Mida los niveles de MCPT-1 en el suero con ELISA.
    4. Realizar un ensayo de degranulación de mastocitos ex vivo.
      1. Aísle las PEC de los ratones un día después de la inyección de IgE anti-DNP. Cuente el número de PEC aisladas.
      2. Placa de 90 μL de PEC crudos (5,5 x 106/mL) en una placa de 96 pocillos (4 pocillos por ratón). Incubar las placas en una incubadora deCO2 humidificada a 37 °C durante 30 min.
      3. Añadir 10 μL de DNP-BSA (5 ng/mL). Incubar la placa durante 10 min a 37 °C incubadora humidificada deCO2 .
      4. Centrifugar la placa a 300 x g durante 5 min a 10 °C. Tome los sobrenadantes (100 μL) con cuidado, dejando las células en los pocillos.
      5. Añadir 100 μL de tampón de lisis celular a los pocillos. Incuba la placa en hielo durante 60 min.
      6. Llevar a cabo el ensayo de β-hexosaminidasa y el ensayo ELISA de histamina como se describe en los puntos 2.1.6 y 2.1.7. Calcule el % de degranulación como en el paso 2.1.6.3.

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Resultados

Determinación del número óptimo de PEC para el ensayo de degranulación de mastocitos ex vivo

Mastocitos (c-kit+· Las células IgE+ dobles positivas)15 representan solo alrededor del 2% de las PEC (Figura 1A). Estimando los niveles máximos de moléculas específicas de mastocitos que se detectarían en los sobrenadantes de cultivo partiendo del supuesto de que el 100% de los gránulos eran liberados por los ...

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Discusión

El hallazgo de que el ensayo de degranulación de mastocitos puede llevarse a cabo con un número relativamente pequeño de PEC crudas de ratón es significativo. A pesar de que las PEC deben ser una excelente fuente de mastocitos primarios de ratón, es difícil purificar las mastocitos en las PEC. Aunque un medio de gradiente de densidad como Percoll25 se ha utilizado con éxito para la purificación de mastocitos a partir de PEC de rata, su uso para la purificación de ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Damos las gracias al Sr. Wonhee Lee y a la Sra. Eunjoo Lee por su asistencia técnica y administrativa. También agradecemos a la Dra. Thi Minh Nguyet Nguyen por sus atentos comentarios. Este trabajo fue apoyado por las becas de investigación de la Universidad Nacional de Chungnam (CNU Research Grant 2017-2098-01) y de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF-2019R1F1A1061894 y NRF-2019M3A9G4067293).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jeringa1757589701
Micro tubo de 1,5 mLHisolMT-15003
Jeringa1757593161
Tubo cónico de 15 mLThermo Fisher scientific14-959-53A
20xPBSTech & InnovaciónBPB-9121-500mL
4-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminidaSIGMAN9376
5 mL tubo de poliestireno de fondo redondode la vida352003
tubo cónico de 50 mLThermo Fisher scientific14-959-49A
Aluminio FiolBioFactTS1-3330
Anti-ratón CD117(c-kit)Biolegend135129mantener a 2-8 grados; C
Anti-ratón IgE mAbsThermo Fisher scientific11-5992-81mantener en 2-8° C
Antiti-DNP-IgESIGMAD8406-.2MGmantener en -20°
C CentrífugaHANIL396150
D-(+)-gluouseSIGMAG8270
DexametasonaSIGMAD2915-100MG
DNP-BSAInvitrogen2079360mantener a -20° C
EDTABiofactPB131-500
Suero fetal bovinoThermo Fisher scientific11455035
GelatinaSIGMAG1890
GlycineJUNSEI27185-0350
hemocitómetroZEISS176045
HEPESThermo Fisher scientific15630130
Kit ELISA de histaminaAbcamGK3275957-4mantener a 2-8° C
Agitador de placa calefactoraLab teachzso-9001
IsofluranceTroikaaI29159
sal de fumarato de ketotifenSIGMAK2628
MCPT-1 kit ELISAThermo Fisher scientific88-7503-22mantener a 2-8° C
Mouse Fc bloqueBD Biosciences553141mantener en 2-8° C
Propidium iodioleSIGMA81845mantener a 2-8° Tampón
lisis C RBCBiolegend420301
Fondo redondo de 96 pocillosSPL-ciencias de la vida30096
Filtro de jeringa de un solo usoStartoriusag16555
Microperlas de estreptavidinaMilteryiBiotec130-048-101mantener a 2-8° C
Triton X-100JUNSEIchemical49415-1601
TWEEN 20SIGMA9005-64-5
Baño de aguaCHANGSHINSCIENCE 190107
de 1 mL de 10 mL Ciencias de

Referencias

  1. Amin, K. The role of mast cells in allergic inflammation. Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).
  2. Holgate, S., et al. The anti-inflammatory effects of omalizumab confirm the central role of IgE in allergic inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 115 (3), 459-465 (2005).
  3. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nature Medicine. 18 (5), 693(2012).
  4. Roth, K., Chen, W. M., Lin, T. J. Positive and negative regulatory mechanisms in high-affinity IgE receptor-mediated mast cell activation. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 56 (6), 385-399 (2008).
  5. Finn, D., Walsh, J. Twenty-first century mast cell stabilizers. British Journal of Pharmacology. 170 (1), 23-37 (2013).
  6. Lu, Y., et al. Emodin, a naturally occurring anthraquinone derivative, suppresses IgE-mediated anaphylactic reaction and mast cell activation. Biochemical Pharmacology. 82 (11), 1700-1708 (2011).
  7. Demo, S., et al. Quantitative measurement of mast cell degranulation using a novel flow cytometric annexin-V binding assay. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 36 (4), 340-348 (1999).
  8. Passante, E., Ehrhardt, C., Sheridan, H., Frankish, N. RBL-2H3 cells are an imprecise model for mast cell mediator release. Inflammation Research. 58 (9), 611-618 (2009).
  9. Fukuishi, N., et al. Does β-hexosaminidase function only as a degranulation indicator in mast cells? The primary role of β-hexosaminidase in mast cell granules. The Journal of Immunology. 193 (4), 1886-1894 (2014).
  10. Malbec, O., et al. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells. The Journal of Immunology. 178 (10), 6465-6475 (2007).
  11. Arock, M., Le Nours, A., Malbec, O., Daëron, M. Innate Immunity. , Springer. 241-254 (2008).
  12. Befus, A., Pearce, F., Gauldie, J., Horsewood, P., Bienenstock, J. Mucosal mast cells. I. Isolation and functional characteristics of rat intestinal mast cells. The Journal of Immunology. 128 (6), 2475-2480 (1982).
  13. Yoon, S. C., et al. Anti-allergic and anti-inflammatory effects of aqueous extract of Pogostemon cablin. International Journal of Molecular Medicien. 37 (1), 217-224 (2016).
  14. Mierke, C. T., et al. Human endothelial cells regulate survival and proliferation of human mast cells. Journal of Experimental Medicien. 192 (6), 801-812 (2000).
  15. Hermes, B., et al. Altered expression of mast cell chymase and tryptase and of c-Kit in human cutaneous scar tissue. Journal of Investigative Dermatology. 114 (1), 51-55 (2000).
  16. Wendeler, M., Sandhoff, K. J. Hexosaminidase assays. Glycoconjugate Journal. 26 (8), 945-952 (2009).
  17. Russell, M., et al. Learned histamine release. Science. 225 (4663), 733-734 (1984).
  18. Darzynkiewicz, Z., et al. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13 (8), 795-808 (1992).
  19. Kitamura, Y., et al. Dexamethasone suppresses histamine synthesis by repressing both transcription and activity of HDC in allergic rats. Allergology International. 55 (3), 279-286 (2006).
  20. Grant, S. M., Goa, K. L., Fitton, A., Sorkin, E. M. Ketotifen. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic use in asthma and allergic disorder. Drugs. 40 (3), 412-448 (1990).
  21. Cook, E., Stahl, J., Barney, N., Graziano, F. Mechanisms of antihistamines and mast cell stabilizers in ocular allergic inflammation. Current Drug Targets-Inflammation & Allergy. 1 (2), 167-180 (2002).
  22. Schoch, C. In vitro inhibition of human conjunctival mast-cell degranulation by ketotifen. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 19 (1), 75-81 (2003).
  23. Franchimont, D., et al. Inhibition of Th1 immune response by glucocorticoids: dexamethasone selectively inhibits IL-12-induced Stat4 phosphorylation in T lymphocytes. The Journal of Immunology. 164 (4), 1768-1774 (2000).
  24. Simmons, C. P., et al. The clinical benefit of adjunctive dexamethasone in tuberculous meningitis is not associated with measurable attenuation of peripheral or local immune responses. The Journal of Immunology. 175 (1), 579-590 (2005).
  25. Cavalher-Machado, S. C., et al. The anti-allergic activity of the acetate fraction of Schinus terebinthifolius leaves in IgE induced mice paw edema and pleurisy. International Immunopharmacology. 8 (11), 1552-1560 (2008).
  26. Dhakal, H., et al. Gomisin M2 inhibits mast cell-mediated allergic inflammation via attenuation of FcεRI-mediated Lyn and Fyn activation and intracellular calcium levels. Frontiers in Pharmacology. 10, 869(2019).
  27. Galli, S. J., Wedemeyer, J., Tsai, M. Analyzing the roles of mast cells and basophils in host defense and other biological responses. International Journal of Hematology. 75 (4), 363-369 (2002).

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