Un enfoque para estudiar la transcriptómica dependiente de la forma a un nivel de celda única

Summary

Este artículo presenta métodos para el crecimiento de miocitos cardíacos con diferentes formas, que representan diferentes patologías, y la clasificación de estos miocitos cardíacos adherentes en función de su morfología a un solo nivel celular. La plataforma propuesta proporciona un enfoque novedoso para el alto rendimiento y la detección de drogas para diferentes tipos de insuficiencia cardíaca.

Abstract

Diferentes tipos de hipertrofia cardíaca se han asociado con un mayor volumen de miocitos cardíacos (CM), junto con cambios en la morfología de CM. Si bien los efectos del volumen celular en la expresión génica son bien conocidos, los efectos de la forma celular no se entienden bien. Este artículo describe un método que ha sido diseñado para analizar sistemáticamente los efectos de la morfología CM en la expresión génica. Detalla el desarrollo de una nueva estrategia de captura de una sola célula que luego es seguida por la secuenciación de ARNm de una sola célula. También se ha diseñado un chip micropatrínado, que contiene 3000 micropatrones de fibronectina de forma rectangular. Esto permite aumentar los CM en relaciones de aspecto distintas longitud:ancho (AR), correspondientes a diferentes tipos de insuficiencia cardíaca (HF). El documento también describe un protocolo que ha sido diseñado para recoger celdas individuales de su patrón, utilizando un selector de celdas micro-pipeteo semiautomático, e inyectarlas individualmente en un búfer de lysis separado. Esto ha hecho posible perfilar los transcriptomas de los CM individuales con morfotipos geométricos definidos y caracterizarlos de acuerdo con una serie de condiciones normales o patológicas: cardiomiopatía hipertrófica (HCM) o postcarga/concentric frente a cardiomiopatía dilatada (DCM) o precarga/excéntrica. En resumen, este documento presenta métodos para el cultivo de CM con diferentes formas, que representan diferentes patologías, y la clasificación de estos CM adherentes en función de su morfología a un nivel de una sola célula. La plataforma propuesta proporciona un enfoque novedoso para el alto rendimiento y la detección de drogas para diferentes tipos de HF.

Introduction

Según la Organización Mundial de la Salud, las enfermedades cardiovasculares (ECV) son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La ECV afecta dramáticamente la calidad de vida de las personas y tiene un enorme impacto socioeconómico. Las cardiomiopatías, como la MCM y la MDL, son trastornos primarios del músculo cardíaco y las principales causas de IC se han asociado con una alta morbilidad y mortalidad. Hay muchas causas de IC, incluyendo efectos ambientales, como infecciones y exposición a toxinas o ciertos medicamentos⁸. La IC también puede ser causada por la predisposición genética, a saber, las mutaciones⁹. Se cree que los cambios en la composición genética que afectan a las moléculas de matriz extracelular (ECM), integrinas o proteínas citoesqueléticas podrían ser responsables de la mechanosensación deteriorada y varios tipos de enfermedades cardíacas¹⁰.

La característica principal de la HCM es la hipertrofia inexplicable del ventrículo izquierdo^11,y a veces del ventrículo derecho^12,y esto se presenta con frecuencia con afectación predominante del tabique interventricular. La HCM también se caracteriza por la disfunción diastólica y el desorden de miocitos y la fibrosis^13. En la mayoría de los casos, el aparato contráctil del corazón se ve afectado por mutaciones en las proteínas sarcoméricas, lo que conduce a una mayor contractilidad de los miocitos¹⁴. Por el contrario, DCM se caracteriza por la dilatación de uno, o ambos, ventrículos y tiene una etiología familiar en 30% a 50% de los casos¹⁵. DCM afecta a una amplia gama de funciones celulares, lo que conduce a una contracción deteriorada de los miocitos, muerte celular y reparación fibrosa¹⁶.

La genética ha demostrado que ciertos tipos de mutaciones obligan a los CM individuales a adoptar características de forma específicas durante la HCM^3,a saber, las células de forma cuadrada con una AR de longitud: anchura que es casi igual a 1:1⁴ (AR1). Lo mismo es cierto para DCM, con las células alargadas con un AR que es casi igual a 11:1 (AR11). Además, la IC puede ser causada por un aumento de la carga posterior (por ejemplo, en hipertensión). En estos casos, las demandas hemodinámicas obligan a los CM a adoptar formas cuadradas, de acuerdo con la ley de Laplace, y la AR cambia de 7:1⁵ (AR7) a 1:1^6,7. La IC también puede deberse a un aumento de la precarga (por ejemplo, en condiciones que conducen a una sobrecarga de volumen). Cuando esto sucede, las restricciones biofísicas fuerzan a los CM a alargarse y la AR cambia de 7:1 a 11:1.

La actividad de señalización en las membranas depende de los parámetros globales de geometría celular, como la AR celular, el tamaño, el área de superficie de la membrana y la curvatura de la membrana¹⁸. Cuando los CM de rata neonatal fueron chapados en sustratos que fueron modelados para restringir las células en una longitud específica: ancho AR, demostraron la mejor función contráctil cuando las relaciones eran similares a las células en un corazón adulto sano. Por el contrario, tuvieron un mal desempeño cuando las proporciones eran similares a las de los miocitos en corazones fallidos¹⁹. En las primeras etapas de la hipertrofia, las células se vuelven más anchas, como lo refleja un aumento en el área transversal. La IC ocurre en las etapas posteriores de la hipertrofia y las células suelen parecer alargadas. Por lo tanto, no es de extrañar que los modelos de ratas in vivo de hipertrofia crónica hayan reportado un aumento en la longitud del miocito ventricular izquierdo de alrededor del 30%^20,pero los CM adultos del modelo de ratón transgénico que fueron tratados agudamente con estímulos hipertróficos in vitro demostraron aumentos similares en la anchura celular en lugar^{de 21}.

La secuenciación de ARN de una sola célula, que permite un análisis preciso del transcriptoma de células individuales, está revolucionando actualmente la comprensión de la biología celular. Esta tecnología fue el método preferido a la hora de responder a la pregunta de cómo las formas celulares individuales afectaron la expresión génica. Comparamos celdas individuales con diferentes formas, en particular con ARs de 1:1, 7:1 o 11:1. Esto se hizo sembrando los CM ventriculares de rata neonatal en un chip especialmente diseñado lleno de micropatrón recubiertos de fibronectina² con ARs definidos de 1:1, 7:1 o 11:1. Los micropatrón fueron fabricados utilizando tecnología de fotolitografía. Los micropatrón estaban recubiertos de fibronectina, rodeados de superficie citofóbica. Por lo tanto, los CM se fijarán, propagarán y capturarán la AR definida de los micropatrínes mediante el crecimiento exclusivo en el sustrato de fibronectina, evitando al mismo tiempo el área citofóbica. Los micropatrón no están en un formato bien formado. En su lugar, el nivel de fibronectina está exactamente a la misma altura de la zona citofóbica circundante. Esto proporcionó condiciones similares a las células de crecimiento en un plato de Petri, ya que no hay estrés de las paredes circundantes. Además, la superficie de los micropatrón con diferentes ARs es igual.

Hubo dos aspectos particularmente importantes del diseño experimental, lo que llevó al uso de la secuenciación de ARN de una sola célula en lugar de la secuenciación de ARN a granel. En primer lugar, sólo unos pocos porcentajes de los micropatrón pueden ser ocupados por una sola célula. En segundo lugar, a veces una sola célula no ocupa completamente la superficie del micropatrón. Las células individuales que cubren completamente una superficie de micropatrón deben seleccionarse para el análisis de ARN de una sola célula. Debido a que sólo un subgrupo de las células chapadas en un chip cumplía ambos criterios, no era factible simplemente probar todo el chip y recoger todas las células para la secuenciación de ARN a granel. Las celdas calificadas necesitaban ser recogidas individualmente usando un recolector de celdas semiautomático.

Actualmente se desconoce si la forma cm, por sí misma, tiene un impacto intrafuncional en el sinictio miocárdico. El objetivo principal de los métodos propuestos en este documento era desarrollar una plataforma novedosa para estudiar si la forma celular per se tenía un impacto en el transcriptoma¹⁷. Aunque los estudios in vitro son diferentes de los estudios in vivo, el propósito de este estudio fue investigar el efecto de diferentes formas celulares en la expresión génica, teniendo en cuenta que comparar células con diferentes formas in vivo es extremadamente exigente. Estos experimentos fueron inspirados por Kuo et al.¹⁹, quienes utilizaron un enfoque similar e informaron que observaron cambios en los parámetros fisiológicos debido a los cambios en la forma celular.

Protocol

Todos los procedimientos relacionados con los animales se ajustaron a las regulaciones del comité de ética animal del Instituto Karolinska, Estocolmo, Suecia.

1. Diseño de chip micro-patrón

1. Utilice un chip diseñado a medida (Tabla de materiales) ( Figura1A): un cubreobjetos de 19,5 mm x 19,5 mm con micropatrnografía activada, impreso por fotolitografía en vidrio borosilicato.
   NOTA: Estos micropatrón están rodeados por un área citofóbica. Por lo tanto, una célula sembrada sólo puede unirse y crecer en uno de estos micropatrón y capturar la AR de ese micropatrón. El chip se divide en tres zonas y cada zona consta de micropatrón con un AR específico. El diseño del chip se muestra en la figura 1B. La geometría de los ARs definidos se presenta en la Tabla 1. Las imágenes fluorescentes magnificadas de las diferentes formas de los micropatrínes de fibronectina se muestran en las imágenes inferiores de la Figura 1B.

2. Recubrimiento de virutas micropatrnadas

1. Preparar 2x solución proteica de recubrimiento para cada chip añadiendo 80 g de fibronectina a 2 ml de solución salina tamponada por fosfato (PBS^-/-).
2. Transfiera un chip a un plato Greiner Petri de 35 mm y agregue inmediatamente 2 ml de PBS^-/-. A continuación, agregue 2 ml de la solución de proteína de recubrimiento 2x.
3. Incubar las virutas a temperatura ambiente durante 2 h.
4. Lave la solución de recubrimiento por sucesivos pasos de dilución con PBS^-/-. La superficie de la viruta siempre debe estar húmeda. A continuación, sustituya el PBS por 2 ml de medio de chapado e incubar a 37 oC hasta que las células siembran.

3. Aislamiento de los CM

1. Preparar el medio de chapado complementando DMEM:M199 (4:1) con 10% de suero de caballo, 4% suero bovino fetal, 2% HEPES (1 M) y 1% de penicilina/estreptomicina (10.000 U/ml)²².
2. Diseccionar el tejido del ventrículo izquierdo de corazones de rata neonatal de 2 días de edad y transferirlo a un plato de 10 cm que contenga PBS. Cortar el tejido en aproximadamente 1 mm³ piezas.
3. Transfiera el tejido cosechado a un tubo de rotor-tapa, equipado con un rotor en la tapa para la disociación de tejido (Tabla de materiales). Deje que el tejido se asiente y luego retire cuidadosamente el sobrenadante.
4. Añadir 2,5 ml de la mezcla de enzimas 1 y 2, preparada con el kit de disociación cardíaca neonatal(Tabla de materiales),al tubo C y cerrar la tapa firmemente.
5. Inserte el tubo de la tapa del rotor en el manguito del disociador, equipado con calentadores (Figura 2A y B) ( Tabla demateriales). Ejecute el programa de incubación 37C_mr_NHDK_1 (Figura 2C), que dura aproximadamente una hora.
6. Mientras se ejecuta el programa de incubación, prepare el tampón PEB que contiene 2 mM de EDTA y 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) en PBS, pH 7.2, y manténgala a 4oC.
7. Después de la terminación del programa de incubación, desprenda el tubo de la tapa del rotor(Figura 2D)y agregue 7,5 ml de medio de chapado precalentó.
8. Resuspender la muestra y filtrar la suspensión celular utilizando un colador de 70 m.
9. Lavar el colador con otros 3 ml de medio de chapado.
10. Centrifugar la suspensión celular a 600 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante por completo.
11. Resuspender el pellet celular en 60 ml de tampón de PEB frío.
12. Añadir 20 l de Cóctel de Aislamiento de Cardiomiocitos Neonatales(Tabla de Materiales),que contenga perlas del tamaño de micras que se dirijan a los no-CM.
13. Añadir 20 l de perlas de glóbulos rojos(Tabla de materiales).
14. Mezclar la suspensión e incubar a 4oC durante 15 min.
15. Agregue 400 l de búfer PEB.
16. Aplique la suspensión de celda sobre la columna LD(Tabla de materiales),que se ha insertado verticalmente en un soporte de imán y se ha lavado bien con tampón PEB.
17. Recoja las celdas sin etiquetar y la columna de lavado con 0,5 ml de búfer PEB.
18. Añadir 8 ml de medio de chapado y transferir la suspensión celular a un matraz de cultivo sin recubrimiento^{de 75 cm2} e incubar a 37oC durante 1,5 h. El resto de los no MC comenzarán a adherirse al cultivo celular sin recubrimiento y la suspensión celular será enriquecida por la población cm.

4. Patterning CMs

NOTA: Comparamos los CM individuales con los ARs de 1:1, 7:1 o 11:1. Esto se hace sembrando las CMs aisladas de rata neonatal en un chip especialmente diseñado lleno de micropatrón recubiertos de fibronectina con ARs definidos de 1:1, 7:1 o 11:1. Los micropatrón estaban recubiertos de fibronectina, rodeados de superficie citofóbica. Por lo tanto, los CM se fijarán, propagarán y capturarán la AR definida de los micropatrínes mediante el cultivo exclusivo en el sustrato de fibronectina. Patrón de los CM aislados de acuerdo con los siguientes pasos.

1. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml, cuente las células y diluya a una concentración de 100.000 células por ml añadiendo el medio de chapado adecuado.
2. Añadir 2 ml de suspensión celular sobre el chip, que ya ha sido sumergido en 2 ml de medio de chapado caliente dentro de un plato Greiner Petri de 35 mm.
3. Incubar el plato a 37oC con 5% de CO₂ para dejar que los CM se adhieran a los micropatrón recubiertos de fibronectina y permitir que cada CM adquiera el AR de su micropatrón de sustrato.
4. Después de 18 h, compruebe el chip. Si la mayoría de las celdas se han unido, desasocie y elimine los desechos y las celdas muertas que están unidas a la celda con patrón. Para ello, retire el medio de chapado y añada suavemente PBS^-/- dropwise, comenzando desde el centro de la viruta y luego moviéndose hacia los lados. Repita 2 veces.
5. Aspirar el PBS con medio de mantenimiento fresco complementando DMEM:M199 (4:1) con 4% de suero de caballo, 4% suero bovino fetal, 2% HEPES (1 M) y 1% de penicilina/estreptomicina (10.000 U/ml).

5. Selección de CMs adherentes

NOTA: Después de un período de cultivo de 72 horas, los CM individuales estampados se recogen de sus micropatrínes de fibronectina utilizando un selector de células semiautomático (Tabla de materiales) ( Figura3). El selector de células utiliza un software²³ para controlar la etapa motorizada(Figura 3A). Se utiliza un microcapilar de vidrio de 70 m(Figura 3B)para recoger e inyectar los CM de rata neonatales modelados. El selector de celdas ordena las células adherentes generando un vacío e inyectando las células aplicando presión. El vacío en la jeringa número 1 se aplica tirando de la jeringa utilizando la bomba de la jeringa(Figura 3C). La presión hidrostática se basa en la gravedad e inducida por la colocación de la jeringa número 2 a una distancia de 87 cm sobre el escritorio del microscopio. Las jeringas 1 y 2 se conectan respectivamente a través de tubos de PTFE, a las válvulas 1 y 2, que están incrustadas en la unidad de control(Figura 3D). Los tubos de PTFE están completamente llenos de agua libre de RNase. A continuación, se inyecta la célula única escogida al tubo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que contiene 3,55 l de tampón de lysis.

1. Después de un período de cultivo de 72 horas, retire el medio viejo y lave suavemente la superficie de la viruta con DPBS caliente^-/-.
   1. Mantenga el plato plano y aspire suavemente el medio viejo con una pipeta de 1000 l de un lado del plato. Asegúrese de que el chip permanezca mojado en todo momento.
   2. Añadir 2 mL de DPBS^-/- suavemente y gotas separar la mayoría de las células muertas que están unidas a las celdas modeladas, comenzando desde el centro del chip y luego moviéndose a sus lados.
   3. Aspirar la mayoría de los DPBS para eliminar tantas células flotantes separadas como sea posible, comenzando desde el centro del chip y luego moviéndose a los lados.
   4. Repita los pasos 5.1.2 y 5.1.3 una vez más.
2. Utilice fórceps en ángulo para agarrar el borde del chip y transfiera inmediatamente a un nuevo plato estéril Greiner Petri de 35 mm para reducir el número de células flotantes durante la recolección.
3. Añadir inmediatamente 1,5 ml de DPBS^-/- para que el chip no se seque.
4. Agregue 1.5 l de vibrante ciclo de tinte verde para visualizar los núcleos de las células vivas.
5. Coloque el chip en el centro del plato Greiner Petri usando la punta de los fórceps.
6. Coloque una cámara(Tabla de materiales)sobre el chip. La cámara fijará el chip en la parte inferior de la placa, sin bloquear el acceso a los patrones celulares.
7. Monte el plato Greiner Petri en el porta platos de la etapa del recolector de células e inserte la tapa magnética.
8. Calibre la inyección automatizada.
   1. Localice el punto de mira, que está grabado en el escenario motorizado en el centro de la imagen en la ventana Vista en vivo.
   2. Enfócate en la cruz y selecciona el botón Calibración para inyección automatizada en la ventana Escaneado y clasificación.
9. Sustituya el DPBS^-/- por 1,5 ml de DPBS/trypsin^-/- (1:1) mientras el plato está en el escenario, para aflojar las células de la fibronectina de modo que se pueda utilizar un vacío fluido para recoger las células.
10. Escanee todo el chip usando la pestaña Escaneado en la ventana Escaneado y clasificación. Localice la esquina superior izquierda del chip en el campo de visión y haga clic en Obtener la posición actual del microscopio en la fila de la esquina superior izquierda.
    1. A continuación, mueva la etapa motorizada a la esquina inferior derecha del chip. Enfoque el microscopio y haga clic en Obtener la posición actual del microscopio en la fila de la esquina inferior derecha.
11. Haga clic en el botón Establecer plano más nítido y en la ventana emergente haga clic en Ir a la esquina superior derecha. Enfoque el microscopio y haga clic en Ir a la esquina inferior izquierda y establecer el enfoque. Cuando haya terminado, haga clic en el botón Finalizar y comience a escanear.
12. Cuando finalice el análisis, vaya a la pestaña Análisis y seleccione las celdas individuales que pasan los criterios de estudio.
13. Asegúrese de que el microcapilar de vidrio esté en medio de la vista en vivo del microscopio.
14. Controle la bomba de la jeringa utilizando la ventana de la bomba del software. Cree un vacío retirando 4 ml de una jeringa de 50 ml número 1, que tiene un diámetro de 27 mm.
15. En la pestaña Ordenación
    1. Ajuste los parámetros de inyección de las válvulas. Se calculó que el volumen de inyección que entregaba una celda única escogida era de 1 l, si la válvula 2 se abría durante 120 milisegundos y luego la válvula 1 se abría durante 20 fue de milisegundos después de un lapso de tiempo de 200 milisegundos. Debido a la elasticidad de los tubos, abra la válvula 1 para dejar de inyectar el flujo.
    2. Ajuste los parámetros de recogida de las válvulas. Se calculó que si la válvula 1 se abría durante 20 milisegundos y luego la válvula 2 se abría durante 10 milisegundos, después de un lapso de tiempo de 10 milisegundos, la mayoría de las celdas con patrones se pueden recoger. Esto se debe a que sus fijaciones de fibronectina se aflojaron después de haber sido tratadas por trippsina.
    3. Haga clic en el botón Calcular la ruta. El software calcula la ruta más rápida de una celda a una celda, para recoger e inyectar las celdas seleccionadas en todo el chip.
    4. Enfoque el microscopio en una célula con patrón en la superficie de la viruta.
    5. Usando el joystick, mueva el microcapilar hacia abajo con cuidado, de modo que se pueda obtener la imagen más nítida de la punta del microcapilar sin tocar la celda.
    6. Haga clic en el botón Establecer en la sección Desplazamiento de micropipeta. Aparecerá una nueva ventana que muestra la sección transversal microcapilar. Haga clic en el centro exacto del capilar. A continuación, el software registrará el desplazamiento de la punta del capilar en las coordenadas x, y y z.
    7. Inicie la ordenación con el botón Iniciar ordenación.

Results

El tejido fue diseccionado del ventrículo izquierdo de los corazones de ratas neonatales de 2 días de edad y dividido en células individuales. Luego, los CM enriquecidos se siembran en un chip que contiene patrones de fibronectina con ARs distintos. Después de 72 horas de cultivo, el medio fue reemplazado por 1:1000 Vibrant Dye Cycle green en DPBS^-/- durante 2 min para visualizar los núcleos de las células vivas. A continuación, las células fueron tratadas con DPBS^-/-/trypsin (1:1) para aflojar las células de la fibronectina, de modo que se pudiera utilizar un vacío fluido para facilitar la recolección celular. Mientras tanto, todo el chip fue escaneado a un aumento de 10x, utilizando un microscopio invertido conectado al recolector de células. Esto se llevó a cabo antes de que las células se redondeen debido al tratamiento con trippsina. Las celdas calificadas fueron seleccionadas, en función de la imagen escaneada, y sus coordenadas se guardaron en el software de selector de celdas. Los micropatrón solo se seleccionaron si contenían una célula única mononucleada y sólo cuando la célula cubría completamente su micropatrón de fibronectina. El clasificador de células escogió las células seleccionadas una por una y cada célula que fue escogida con éxito se inyectó inmediatamente en un tubo de PCR individual y se colocó en la etapa del microscopio. Cada tubo de PCR contenía 3,55 l de tampón de lelisis(Tabla 2). El proceso de clasificación, que comenzó con la eliminación de los medios, se completó en 40 minutos. La síntesis complementaria de ácido desoxirribonucleico (ADNb), la preamplificación y la purificación de PCR se realizaron en las células individuales de lesed, sobre la base del protocolo Smart-Seq2²⁴ (Tabla 3). La calidad del ADNc purificado fue comprobada por un analizador automatizado de electroforesis. El electroferograma del ADNc preamplificado de una célula única escogida se presenta en la Figura 4. Las bibliotecas RNA-Seq se prepararon de acuerdo con el protocolo Smart-Seq2²⁴.

Para observar la estructura de sarcomere de los CM modelados, los CM estampados se mancharon con anticuerpos sarcoméricos α-actinin. Las células fueron incubadas con Burro Anti-Ratón IgG Alexa Fluor 488 1:800 durante 1 hora a temperatura ambiente para la tinción secundaria. Los núcleos se teñiron con DAPI de 1 g/ml. Las imágenes inmunofluorescentes se adquirieron con un microscopio confocal invertido, utilizando un objetivo de inmersión de aceite 63x (NA 1.4) (Figura 5).

Figura 1: Disposición del chip con micropatrón de fibronectina.
(A) Imagen del chip diseñado a medida. El chip es un cubreobjetos de 19,5 mm x 19,5 mm con micropatrón de fibronectina, impreso por fotolitografía sobre un vidrio borosilicato. (B) Diseño de chip. El chip se divide en tres zonas y cada zona consta de micropatrínes de fibronectina con AR específica. Esta figura ha sido modificada de "material suplementario 1" por Haftbaradaran Esfahani et al.², utilizado bajo http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Disociador equipado con aparatos de calentadores.
(A) Todo el instrumento disociador utilizado para la disociación totalmente automatizada de los ventrículos izquierdos de rata neonatal de 2 días de edad. (B) Unidad de calefacción. (C) Tubo de tapa de rotor. (D) Programas listos para usar para un flujo de trabajo totalmente automatizado de disociación de tejidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Aparato selector de células.
(A) Vista ampliada de la etapa motorizada del selector de celdas. Un soporte Petri-dish y 80 agujeros para 10 tiras de PCR y un agujero para la mira de calibración está incrustado en el escenario. (B) Vista ampliada de un microcapilar de vidrio. (C) La bomba de la jeringa. (D) La unidad de control, que controla la ventana de tiempo de apertura y cierre de las válvulas 1 y 2, montada dentro de la unidad de control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: El electroferograma del ADNn previamente amplificado de una sola célula escogida.
Se utilizaron 19 ciclos de PCR de preamplificación para obtener un rendimiento de ADNc purificado de 1 ng/L. Se observa una banda clara en la gráfica de densitometría similar a un gel que corresponde al pico a 1852 bp en el electroferograma. El tamaño promedio de los fragmentos es 1588 bp. Además, la pequeña cantidad de fragmentos que son más cortos que 300 bp indica una buena biblioteca cDNA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Tinción inmunofluorescente de α-actinina estructura sarcomerica (verde) y núcleo (azul) de CM patrón con diferentes ARs.
La cromatina fue manchada por DAPI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Morfotipo	Ar	Longitud (m)	Anchura (m)	Superficie de la fibronectina (m2)
AR1	1:1	47	47	2209
AR7	7:1	126	18	2268
AR11	11:1	155	14	2170

Tabla 1: Geometría de los CM modelados.

Componente	Volumen (L)
Agua sin nucleas	0.65
(0,4% vol/vol) Tritón X-100	1.8
mezcla dNTP (25 mM)	0.8
Inhibidor de la RNase (40 U-L-1)	0.1
Oligo-dT30VN oligonucleótidos (100 m)	0.1
Mezcla de espiga de ARN ERCC (2,5 x 105 dilución)	0.1
Inyectado de una sola célula	1
Volumen total	4.55

Tabla 2: Búfer de lelisis personalizada de celda única.

Componente	Volumen (L)
Búfer de primera cadena Superíndice II (5x)	2
TDT (100 mM)	0.5
Betaína (5 M)	2
Mgcl2 (1 M)	0.1
Inhibidor de la RNase (40 U-L-1)	0.25
Superíndice II transcripción inversa (200 U-L-1)	0.5
TSO (100 m)	0.1
Volumen total	5.45

Tabla 3: Mezcla de transcripción inversa (RT) para una reacción RT para sintetizar el ADNr de primera hebra del izado de un solo CM.

Discussion

Este estudio utilizó la secuenciación de ARN de una sola célula, que es una tecnología novedosa y potente que puede detectar el transcriptoma de células individuales. Se combinó con un enfoque innovador para el cultivo de CM individuales, de modo que asumieron diferentes ARs que, de lo contrario, sólo podrían haberse observado in vivo.

El estudio tenía algunas limitaciones. Por ejemplo, los CM neonatales tuvieron que ser utilizados para generar diferentes morfotipos, ya que es excepcionalmente difícil cultivar suficientes CM adultos vitales durante 72 horas en formas definidas. Además, los CM se cultivaron durante 72 horas ex vivo, lo que podría haber tenido un impacto en el patrón de expresión génica. Sin embargo, este cultivo era necesario, para que las células pudieran formar morfotipos específicos. Además, sólo se seleccionaron células individuales que fueron mononucleadas y cubrieron completamente el micropatrón de fibronectina para la clasificación. Las celdas modeladas en cada chip deben ordenarse simplemente en una ronda de clasificación. Finalmente, alrededor de 50 células que es aproximadamente un tercio de las celdas seleccionadas fueron recogidas con éxito de cada chip. Hay dos razones que restringieron el número de celdas seleccionadas correctamente. En primer lugar, algunas células estaban demasiado unidas al patrón de fibronectina y el flujo de recogida no era lo suficientemente forzosa como para recogerlas con éxito. En segundo lugar, debido al tratamiento de la trippsina, la unión entre algunas células y la fibronectina se volvió demasiado suelta. En consecuencia, estas células fueron empujadas lejos de sus micropatrínes de fibronectina, cuando el microcapilar se acercó a ellos, y no fueron recogidos. Los autores no afirman que esta configuración es la misma que un entorno in vivo, pero resultó ser un enfoque viable para responder a la pregunta de investigación.

El método propuesto es aplicable a diferentes tipos de células (por ejemplo, para hiPS-CM). Sin embargo, los siguientes factores deben optimizarse para estudiar otros tipos de células. Se deben utilizar moléculas adhesivas ECM adecuadas para la fijación del tipo celular específico para recubrir los micropatrón. La geometría de los micropatrón debe modificarse de acuerdo con la pregunta del estudio y el tipo de célula. El período de cultivo se puede modificar en función de la cuestión del estudio. El reactivo de desprendimiento y su tiempo de incubación deben optimizarse con precisión para el tipo de célula de estudio. Por ejemplo, Accutase se puede utilizar en lugar de TryplE para el desprendimiento de células madre embrionarias y neuronales. Los parámetros de tiempo de apertura de las válvulas deben ser examinados para recoger las células con éxito, pero suavemente. En resumen, diseñamos una plataforma novedosa para estudiar la forma celular que puede proporcionar un recurso valioso para los investigadores en el campo. En este contexto, diseñamos un enfoque experimental que imitaba las formas características in vitro impuestas a CM in vivo por restricciones hemodinámicas para identificar la interacción entre la arquitectura celular y la expresión génica. También informamos del desarrollo de una plataforma novedosa para estudiar la IC in vitro y la identificación de la forma celular como un poderoso determinante de la expresión génica. Se trata de una observación novedosa con implicaciones de gran alcance para la biología y la medicina.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies	G2939BA	Analizador de electroforesis automatizado
Microperlas anti-glóbulos rojos	Miltenyi Biotec	130-109-681
Axio Microscopio Observer	Zeiss	Z1	Microscopio invertido
Solución de betaína (5 M)	Sigma-Aldrich, MERCK	B0300
CellSorter	CELLSORTER	https://www.singlecellpicker.com/	Selector de células
CYTOOchamber	CYTOO	30-010	Chip diseñado a medida
CYTOOchip	CYTOO	10-950-00-18	Cámara
DMEM	Thermo Fisher Scientific	31966-021	alta glucosa, GlutaMAX Supplement
dNTP mix (25 mM)	Thermo Fisher Scientific	R1122
Burro Anti-Ratón IgG Alexa Fluor 488	Abcam PLC	ab150105
TDT (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	18064071
ERCC RNA Spike-In Mix	Thermo Fisher Scientific	4456740
Suero fetal bovino	Thermo Fisher Scientific	10082-147
Fibronectina	Sigma-Aldrich, MERCK	F4759
gentleMACS C Tubo	Miltenyi Biotec	130-093-237	Tubo de rotor
gentleMACS Octo Disociador con calentadores	Miltenyi Biotec	130-096-427	Disociador con calentador
Greiner CELLSTAR Placa de Petri	Sigma-Aldrich, MERCK	P6987
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630-056
Suero de caballo	Sigma-Aldrich, MERCK	H0146
Columna LD	Miltenyi Biotec	130-042-901
Medio 199	Thermo Fisher Scientific	31150-022
NE-1000 bomba de jeringa	New Era Pump Systems	NE-1000	Bomba de jeringa
Cóctel de aislamiento de cardiomiocitos neonatales, rata	Miltenyi Biotec	130-105-420
Kit de disociación cardíaca neonatal, ratón y rata	Miltenyi Biotec	130-098-373
Oligo-dT30VN oligonucleótidos	IDT Technology	5′ – AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3 y cebado;
Inhibidor de la ARNasa (40 U y micro; L-1)	Clontech	2313A
sarcomérico &alfa;-actinina	Sigma-Aldrich, MERCK	EA-53
SP8 Microscopio confocal	Leica Microsystems	SP8
Tampón de primera cadena Superscript II (5x)	Thermo Fisher Scientific	18064071
Superscript II transcriptasa inversa (200 U y micro; L-1)	Thermo Fisher Scientific	18064071
Triton X-100	Sigma-Aldrich, MERCK	T9284
Enzima TryplE Express, sin rojo fenol	Thermo Fisher Scientific	12604013
TSO (100 µ M)	QIAGEN	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3′
Ciclo de tinte vibrante verde	Thermo Fisher Scientific	V35004