Preparación y Microinyección de embriones de Drosophila para microscopía de células vivas realizada mediante un analizador automatizado de alto contenido

Summary

Aquí se presenta un protocolo para microinyecyar y al mismo tiempo la imagen de múltiples embriones Drosophila durante el desarrollo embrionario utilizando un imager basado en placas y alto contenido.

Abstract

Los enfoques modernos en la imagen cuantitativa de células vivas se han convertido en una herramienta esencial para explorar la biología celular, al permitir el uso de estadísticas y modelado computacional para clasificar y comparar procesos biológicos. Aunque los sistemas de modelos de cultivo celular son ideales para imágenes de alto contenido, estudios de alto rendimiento de morfología celular sugieren que los cultivos ex vivo son limitados en la recapitulación de la complejidad morfológica que se encuentra en las células dentro de los organismos vivos. Como tal, hay una necesidad de un sistema de modelo escalable de alto rendimiento para poner imágenes de células vivas dentro de un organismo intacto. Aquí se describe un protocolo para utilizar un analizador de imágenes de alto contenido para adquirir simultáneamente múltiples videos de lapso de tiempo del desarrollo embrionario de Drosophila melanogaster durante la etapa de blastodermo sincitial. El blastodermo sincitial ha servido tradicionalmente como un gran modelo in vivo para la toma de imágenes de eventos biológicos; sin embargo, la obtención de un número significativo de réplicas experimentales para enfoques cuantitativos y de alto rendimiento ha sido intensiva en mano de obra y limitada por la obtención de imágenes de un solo embrión por repetición experimental. Aquí se presenta un método para adaptar los enfoques de imagen y microinyección para adaptarse a un sistema de imágenes de alto contenido, o cualquier microscopio invertido capaz de la adquisición automatizada de múltiples puntos. Este enfoque permite la adquisición simultánea de 6-12 embriones, dependiendo de los factores de adquisición deseados, dentro de una sola sesión de imagen.

Introduction

En los últimos 30 años, los avances en tecnologías de imagen y sondas moleculares para imágenes de células vivas han avanzado en nuestra comprensión de la complejidad y el funcionamiento interno de la célula. Acompañando este avance en la tecnología es una mayor dependencia del uso de modelos de cultivo celular ex vivo para la adquisición de datos de imágenes de alto rendimiento. Los modelos de cultivo celular proporcionan varias ventajas, incluido el control del microambiente a través de sistemas microfluídicos, y la capacidad de tomar imágenes simultáneamente de varias células, lo que permite el uso de enfoques cuantitativos necesarios para el cribado de alto rendimiento^1,2. Sin embargo, también hay desventajas significativas asociadas con los modelos de cultivo celular en el contexto de estudios morfológicos, tales como vidrio bidimensional o superficies plásticas que producen efectos confusos sobre la morfología celular y su regulación^3,4,5. Estos efectos pueden proporcionar datos falsos o engañosos con respecto al estudio de procesos biológicos que regulan la morfología celular.

Aunque la alternativa ha sido estudiar la morfología celular en el contexto de un organismo intacto⁶, pocos organismos intactos adecuados facilitan la toma de imágenes cuantitativas de células vivas de alto rendimiento debido a las dificultades para mantener vivos los organismos enteros a través de imágenes, y los desafíos asociados con la imagen dentro de un gran organismo multicelular. Como resultado, los estudios biológicos celulares en organismos intactos generalmente se han centrado en observar un solo organismo a lo largo del tiempo, lo que limita en gran medida el tamaño de la muestra. Además, esta limitación de un animal a la vez hace que la imagen en vivo sea difícil y costosa de emplear en forma de pantalla y restringe la capacidad de aplicar herramientas analíticas cuantitativas, ya que el número de muestras es generalmente demasiado pequeño. Por lo tanto, surge la necesidad de un organismo modelo multicelular que se puede utilizar para enfoques cuantitativos basados en alto contenido.

Este protocolo adapta el embrión Drosophila para imágenes de alto contenido basadas en placas para generar tamaños de muestra experimentales lo suficientemente grandes como para el análisis cuantitativo. Drosophila melanogaster es comúnmente conocido como el primer organismo modelo. La investigación con Drosophila ha dado lugar a avances en biología celular y molecular, incluyendo la transmisión de información genética, la identificación de vías de señalización celular y los requisitos genéticos del desarrollo embrionario^7,8,9. Además, el embrión Drosophila se ha utilizado para explorar la dinámica de microtúbulos in vivo durante la división celular^10,11,12. El uso de microinyección para entregar moléculas pequeñas y sondas moleculares proporciona un control temporal que hace que el desarrollo embrionario de Drosophila sea particularmente potente para sondear procesos celulares in vivo^13,14. Sin embargo, generar un número significativo de repeticiones experimentales con un enfoque de imagen tradicional es extremadamente laborioso y tiene un uso limitado en pantallas de imágenes de alto rendimiento y análisis cuantitativo. Nuestro enfoque hace uso de un analizador de alto contenido normalmente reservado para el análisis de una sola célula y adapta el análisis de imágenes in vivo en el sincitio de los primeros Drosophila embryo.

Este protocolo se utilizó para recoger, escenificar y microinyectar embriones Drosophila para explorar los mecanismos que impulsan los cambios morfológicos en el Retículo Endoplasmático (ER) durante la mitosis¹⁵. Aunque muchos estudios han esbozado la naturaleza dinámica de la sala de emergencias durante el ciclo celular^16,17,18,19, ha sido difícil comparar los efectos de múltiples perturbaciones a través del tiempo en la morfología de er er. Para identificar los componentes que impulsan los cambios en la morfología de ER a través de la división celular, los métodos enumerados en este protocolo se utilizaron para sondear el papel de los microtúbulos y otros factores citoesqueléticos en la reorganización mitótica de la ER utilizando la división sincitial cortical en el embrión de Drosophila temprano. En conjunto, la disponibilidad de perturbación genética dentro de la comunidad Drosophila, la capacidad de microinyección de fármacos y sondas moleculares en momentos precisos durante el desarrollo, y el costo económico de trabajar con Drosophila hace que este enfoque sea altamente susceptible de cribado basado en imágenes de alto rendimiento. Los métodos descritos aquí son aplicables para el estudio de una amplia variedad de procesos celulares y de desarrollo in vivo utilizando el embrión Drosophila ²⁰. Específicamente, este protocolo está bien adaptado para estudiar eventos biológicos que ocurren durante un período prolongado y dentro de 100 micras de la corteza embrionaria de Drosophila.

Protocol

NOTA: Consulte la Tabla 1 para obtener recetas de medios y soluciones.

1. Creación y mantenimiento de una jaula de recogida de embriones para el análisis en vivo²¹

1. Poblar una nueva jaula de recogida de embriones con moscas frescas.
   NOTA: Aunque se recomiendan jaulas de recogida disponibles comercialmente, las jaulas de recolección se pueden construir fácilmente a partir de botellas de mosca vacías²¹.
   1. Desechar o transferir moscas adultas de botellas cuando muchas pupas comienzan a oscurecer en la etapa p14; a 20oC esto ocurre aproximadamente 14 días después de que los huevos han sido puestos²².
   2. Deje que las pupas eclosionen y rellenen las botellas durante 12-24 h.
   3. Transfiera moscas frescas a una pequeña jaula de recolección usando un pequeño embudo sobre la abertura de la jaula de la colección para evitar que las moscas escapen. Combine hasta 3 botellas para producir una jaula densamente poblada que contenga de 200 a 500 moscas.
   4. Transfiera moscas a la jaula de recogida tocando una botella de mosca contra una superficie dura repetidamente (para aturdir a las moscas). A continuación, abra e invierta la botella de mosca sobre el embudo de la jaula de la colección. Toque la botella abierta en la jaula de la colección un par de veces para soltar moscas en la jaula de la colección.
   5. Cierre la botella de mosca abierta poniéndola rápidamente en su enchufe. Al transferir la botella de mosca abierta desde el embudo a su enchufe, asegúrese de que la abertura de la botella apunte hacia abajo, ya que las moscas tienden a arrastrarse hacia arriba de la fuente del roscado.
   6. Presione el embudo contra la abertura de la jaula de la mosca y toque la jaula repetidamente en una superficie dura para aturdir a las moscas dentro. Retire inmediatamente el embudo y asegure un plato de uva fresca a la abertura de la jaula de la mosca. Utilice cinta adhesiva para fijar el plato de uva. Repita este proceso para combinar hasta 3 botellas para producir una jaula de recolección densamente poblada.
      NOTA: Alternativamente, las moscas pueden ser anestesiada usando CO₂ u otros agentes durmientes de mosca; sin embargo, esto aumentará el período de aclimatación en el paso 1.2.
2. Aclimatar la nueva jaula de recogida para 24-48 h. Si se utilizó CO₂ o cualquier otro agente para dormir, aclimate la jaula de recogida durante al menos 48 h.
   1. Sustituya el plato de uva de la jaula de recogida por uno fresco que contenga pasta de levadura dos veces al día, con una separación de 8-10 h.
3. Configure una jaula de recogida fresca cada 5 días.

2. Recolectar y preparar embriones para la toma de imágenes

1. Obtención de embriones con desarrollo sincronizado
   1. Cambie el plato de uva en la jaula de recogida con uno fresco que contenga un toque de pasta de levadura en el centro. Permita que las moscas lay embryos durante 1 h. Reveste el viejo plato de uva.
      NOTA: Las moscas pueden fertilizar embriones antes de ponerlos. La primera placa de recogida contendrá muchos de estos embriones predesarrollados. Permitir que las moscas volcar primero embriones viejos mejore la sincronización del desarrollo entre embriones.
   2. Cambie el plato de uva por uno fresco que contenga un toque de pasta de levadura en el centro y deje que las moscas pongan embriones durante 10 minutos. Reveste el viejo plato de uva.
      NOTA: Para evitar ralentizar el desarrollo embrionario en placas frías, caliente el plato de uva y la pasta de levadura a temperatura ambiente antes de su uso.
   3. Cambiar el plato de uva con uno fresco (sin pasta de levadura) y guardar el plato de uva viejo, tiene los embriones para la toma de imágenes. Si es necesario, continúe recogiendo embriones de esta jaula repitiendo los pasos 2.1.2 y 2.1.3.
2. La edad recoge embriones durante 30-45 min para imágenes de las divisiones sincitiales²³.
   NOTA: Para imaginar la etapa de blastodermo sincitial en el desarrollo embrionario, los embriones deben montarse y en el microscopio dentro de los 90 minutos de la recolección. Al intentar este protocolo por primera vez, los embriones de edad 10-20 min en el paso 2.2 para proporcionar tiempo adicional para configurar entre pasos.
3. Embriones de descorionato con 50% de lejía en agua DI.
   1. Transfiera embriones envejecidos del paso 2.2 a un tamiz de 140 nm llenando la placa de uva con agua DI, desalojando suavemente los embriones con un cepillo de pintura y vertiendo el agua con embriones en el tamiz de 140 nm (Figura 1A).
      NOTA: Esto se puede hacer sobre un fregadero o un vaso de precipitados de 1.000 ml.
   2. Enjuague vigorosamente los embriones con un agua DI con una botella de chorro. Seque los embriones hinchando el tamiz en una toalla de papel seca. Blot el tamiz hasta que deje marcas de agua en la toalla de papel (Figura 1B).
      NOTA: Retire toda la pasta de levadura de los embriones, ya que puede hacer que el tratamiento de la lejía sea ineficaz en el siguiente paso.
   3. Llenar una placa vacía de 10 cm con 50% de lejía recién preparada diluida con agua DI (1:1 lejía: agua DI). Sumerja el tamiz en una lejía al 50% durante 2 min 45 s. Comienza un cronómetro tan pronto como el tamiz toque la lejía del 50%. Blot el tamiz dentro y fuera de la lejía 50% 3-4x en los primeros 15 s para romper los grumos embrionarios (Figura 1C).
   4. Enjuague vigorosamente los embriones con agua DI con una botella de chorro. Seque los embriones hinchando el tamiz en una toalla de papel seca. Repita el vigoroso proceso de enjuague y secado de manchas para 5x(Figura 1D).
      NOTA: Este es el paso más importante para eliminar el trabajo sobrante. Utilice una botella de chorro DI completa y use la mitad de la botella en este paso.
   5. Transfiera los embriones secos de la mancha del tamiz a una placa de uva de 10 cm utilizando un cepillo de pintura²¹ (Figura 1E)
      NOTA: La dicloración manual se puede utilizar como alternativa a la descorinación de lejía²⁴.

Figura 1: Descorionación de embriones. (A) Los embriones se recogieron utilizando una botella de chorro DI H20, un cepillo de pintura y un tamiz de 140 nm. (B) Los embriones se enjuagaron vigorosamente con una botella de chorro DI H20 y secaron sobre una toalla de papel. (C) La descorionación de embriones se realizó en un 50% de lejía durante 2 min y 45 s. (D) Los embriones se enjuagaron vigorosamente con una botella de chorro DI H20 y se secaron sobre una toalla de papel. Esto se repitió 4 veces para eliminar el exceso de coro. (E) Los embriones se transfirieron a una placa de uva de 10 cm utilizando un cepillo de pintura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Montaje de embriones en cubreobjetos

1. Bajo un estereomicroscopio equipado con iluminación de cuello de ganso superior, organice dos filas de 15-20 embriones en una sección limpia de la placa de uva utilizando una herramienta de recolector de huevos. Alinee los embriones en su lado ventral en la misma orientación con respecto a los extremos anterior y posterior. Para hacer que los recolectores de huevos doblen las pinzas de acero inoxidable de punta fina a un ángulo de 45o. Para revisar la orientación de los embriones D/V, véase Campos-Ortega et al.²⁰.
   NOTA: Es importante que la superficie ventral se siente en la placa de uva, ya que los embriones se prensarán sobre un resbalón de cubierta en el paso 3.5, exponiendo la superficie dorsal para la toma de imágenes. Dado que la superficie dorsal es mucho más plana que la superficie ventral, la imagen de la superficie lateral dorsal aumenta el número de núcleos presentes dentro de un solo plano Z.
2. Prepare el cubreobjetos espaciador de silicona de 75 mm x 25 mm.
   NOTA: Esto se puede preparar con anticipación. Prepare varios cubreobjetos y guárdelos en una caja deslizante para mantenerlos limpios.
   1. Trace el contorno de un cubreobjetos de 75 mm x 25 mm en una hoja espaciadora de silicona de 1,6 mm de espesor y corte el espaciador de silicona con tijeras (Figura 2A).
   2. Con una cuchilla de afeitar, corte un recuadro de 40 mm x 15 mm del espaciador (Figura 2A).
   3. Adherir el espaciador sobre el cubreobjetos y la raya 10 l de pegamento de heptano por el inserto de vidrio de cubierta expuesto (Figura 2A).
      NOTA: Poner abajo e incluso rayar asegurará la toma de imágenes de embriones en el mismo plano z.
3. Mientras que el pegamento de heptano del paso 3.2.3 se seca, cortar una sección rectangular de la placa de uva que contiene los embriones del paso 3.1.
   1. Utilice una cuchilla de afeitar para cortar un rectángulo (menor que 40 mm x 15 mm) alrededor de las dos filas de embriones. No quite el rectángulo todavía.
   2. Recorta un segundo rectángulo junto al primero. Retire el segundo rectángulo usando el borde recto de una espátula de acero inoxidable.
   3. Deslice cuidadosamente el borde recto de una espátula de acero inoxidable debajo del primer rectángulo y retírela(Figura 2B).
4. Coloque el corte de la placa de uva con embriones en el lado externo de un plato de 3,5 cm(Figura 2C).
5. Bajo un estereomicroscopio, baje un cubreobjetos preparado sobre los embriones y presione suavemente las dos filas de embriones sobre el pegamento (Figura 2D).
6. Si microinyecyen embriones, vaya al paso 4.1. Si no microinyección continuar al paso 3.7.
7. Cubra los embriones llenando el espaciador de silicona (a mitad de camino a la parte superior) con 1:1 - aceite de halocarbono 700: aceite de halocarbono 27.
8. Alinee los bordes inferiores de un adaptador de placa de 4 diapositivas con cinta adhesiva de doble cara para evitar que el resbalón de la cubierta se mueva, pero asegúrese de no colocar la cinta en la trayectoria de la lente objetivo. Esta cinta es crítica. Si el cubreobjetos solo está sentado en el adaptador, se moverá a lo largo de la adquisición. Monte el resbalón de la cubierta en el adaptador de placa deslizante 4.

Figura 2: Preparación y montaje de coverslip. (A) Un contorno de 75 mm x 25 mm cubierta se rastreó sobre una hoja de silicona de 1,6 mm de espesor. Utilice tijeras para cortar el contorno. 40 mm x 15 mm insertado fueron cortados del espaciador de silicona y luego montados en el cubreobjetos. Estratenado 15 l por el centro del recuadro. (B) Se organizaron dos hileras de 15-20 embriones en una placa de uva en un área inferior a 40 mm x 15 mm, luego esa área se cortó con una maquinilla de afeitar y una espátula de acero inoxidable. (C) La placa de uva cortada se colocó en la parte superior de un plato vacío de 3,5 cm. (D) Bajo un estereomicroscopio, el cubreobjetos de (A) se bajó y los embriones se pegaron en la raya de pegamento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Desiccating and microinjecting embryos

1. Coloque el cubreobjetos con embriones sobre un portaobjetos para evitar que la parte inferior del cubreobjeto se ensucie durante la desicación y la microinyección.
   NOTA: El resbalón de la cubierta se tomará una imagen sin una diapositiva adjunta. Por lo tanto, un microscopio invertido es necesario para la toma de imágenes.
2. Desiccate embriones durante 5-10 min, dependiendo de la temperatura de la habitación. Los embriones utilizados para la toma de imágenes en los resultados representativos se deseicaron durante 7 min a 20oC en una cámara que contenía una capa 1:1 de perlas de gel de sílice sobre un agente de secado (Figura 3A).
3. Inmediatamente después de la desicación, cubra los embriones con 1:1 - aceite de halocarbono 700: aceite de halocarbono 27. Llene el espaciador de silicona hasta la parte superior.
   NOTA: Es importante mezclar un aceite de halocarbono de alta viscosidad con un aceite de halocarbono de baja viscosidad. El aceite de halocarbono puro 700 (alta viscosidad) ralentiza la progresión de los ciclos celulares 30 min después de la aplicación. Una mezcla 1:1 de aceite de halocarbono 700 y aceite de halocarbono 27 fijó este artefacto.
4. Cargue las agujas de microinyección con el inyector, luego monte una en el microinyector y ábrala bajo presión.
   NOTA: Practique el paso 4.4 unas cuantas veces antes de realizar el ensayo completo con cualquier reactivo valioso. Este es el paso más difícil en el proceso de microinyección.
   1. Cargue las agujas de microinyección con 2 ml de inyector utilizando una punta de carga extendida. Sólo se requiere una aguja de microinyección, pero es bueno tener agujas cargadas de repuesto cerca, así que prepare 2 o 3 agujas.
      NOTA: Consulte la Tabla de materiales para conocer las especificaciones de las puntas de carga extendidas. Las agujas de microinyección no se pueden cargar sin puntas de carga extendidas debido a la naturaleza única de nuestra técnica de microinyección, que se basa en la construcción de la presión de aire dentro de una aguja sellada y cargada antes de abrir su punta.
   2. Monte una aguja en el microinyector y presione el émbolo hasta la punta. El objetivo es aumentar la presión de aire dentro del capilar de vidrio(Figura 4A).
      NOTA: Utilice un microinyector a base de aceite mineral de émbolo sin aceite mineral. En lugar de aumentar la presión con aceite mineral, utilice el émbolo para aumentar la presión del aire.
   3. Baje la aguja de vidrio en un portaobjetos de vidrio y corte la punta de la aguja con una nueva #9 cuchillada. Corte la aguja en un ángulo de 45o para producir una punta abierta afilada. El inyector debe fluir hasta la parte inferior de la punta sin salir de la aguja. Añadir con cuidado 20 ml de aceite de halocarbono sobre la punta de la aguja y volver a cortarlo a 45o. El inyector debe comenzar a fluir rápidamente.
   4. Reduzca inmediatamente la presión del aire retrayendo el émbolo, pero asegúrese de mantener un caudal continuo para evitar que la aguja se obstruya con la membrana embrionaria entre las inyecciones. (Figura 4B).
      NOTA: Si el inyector está despejado, vea el caudal del inyector levantando la aguja de microinyección dentro y fuera del aceite de halocarbono y observando la velocidad de formación de las gotas de los inyectores bajo un estereomicroscopio. Ajuste la presión del aire presionando el émbolo unos pocos clics a la vez, luego sumerja la punta de microinyección dentro y fuera del aceite de halocarbono para ver la tasa de formación para el ajuste de nuevos postlets.
   5. Utilice el micromaniprógrafo para colocar la aguja en el centro del campo de visión, luego levante la aguja con el micromaniprógrafo y retire el portaobjetos de vidrio de debajo de él. La aguja ahora está calibrada para inyección.

Figura 3: Diagrama de la cámara de desicación. (A) Este es un diagrama de una cámara de desicación. La cámara consiste en una capa 1:1 de cuentas de gel de sílice sobre una capa de drierite. Para realizar la desicación, los embriones se colocaron encima de una sola tapa de placa de pozo. La cámara de desicación se cerró 7 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Embriones microinyectivos
   1. Coloque los embriones en la etapa estereomicroscopio bajo la aguja de microinyección, pero no baje la aguja.
   2. Concéntrese en embriones con aumento de 50x.
   3. Baje la aguja hasta que entre en el mismo plano de enfoque que los embriones. Mover la diapositiva con una mano y operar el microinyector con la otra, inyectar una fila de embriones.
   4. Levante la aguja y gire el portaobjetos 180o para exponer la segunda fila de embriones a la aguja de microinyección. Baje la aguja e inyecte la segunda fila de embriones.
      NOTA: Intente hacer esto en menos de 10 min. Deje que algunos embriones no inyectados se utilicen como controles.

Figura 4: Preparación de la aguja de microinyección. (A) En estailustración, la intensidad del magenta en la aguja es representativa de la presión del aire. Se montó una aguja cargada en el microinyector y el émbolo se amplió 50% para aumentar la presión de aire dentro de la aguja. Asegúrese de que el émbolo esté retraído al máximo antes del montaje. (B) La punta de la aguja se cortó bajo presión y el émbolo se retrajo para disminuir la presión del aire y el caudal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Imágenes en un analizador de alto contenido

1. Antes de ejecutar este ensayo, cree un mapa de placas para un adaptador de diapositivas. Utilice el editor de soportes de placa que se encuentra en el menú Administrador de mapas de placas para introducir la dimensión de un adaptador de placa personalizado.
   NOTA: Se hizo un mapa de placas personalizado para el adaptador de placa disponible comercialmente (consulte Tabla de materiales). El mapa de placas contiene los siguientes ajustes; Grosor de la diapositiva: 1000 m, Altura inferior: 1.607 mm, variabilidad de la altura de la parte inferior: 100 m, material de sustrato: vidrio, espesor del cubrelip: 150 m, posición del cubrelip: inferior – filas: 1 – espaciado: 56.987 mm, columnas: 4 – espaciado 28.391, tamaño y forma: rectángulo, ancho 23.00 mm, altura: 73.00 mm, desplazamiento a A1 21.29 mm – 42.74 mm)
2. Cargue el adaptador de diapositivas en el microscopio y utilice la función Vista previa para teselar una imagen de campo brillante 10x del cubreobjetos.
3. Seleccione un embrión en la parte superior o inferior de una fila, seleccione Objetivo y cambie a 60x (NA 0.95). Determine una exposición adecuada para el canal de fluorescencia deseado.
   NOTA: Mantenga la intensidad del láser por debajo del 25% para la toma de imágenes de células vivas.
4. En el panel principal, utilice la función Vista previa para crear mosaicos de una imagen fluorescente de 60x que contenga ambas filas de embriones.
5. En el panel principal, seleccione el menú desplegable Binning y establezca el binning en 1 x 1 para una resolución óptima.
6. Utilice la pestaña z Stack Setup para definir parámetros para pilas z.
   1. En la pestaña z Stack Setup, utilice las flechas Arriba y Abajo para encontrar los límites de la pila z superior e inferior. Una vez definidos los límites superior e inferior, seleccione el icono del lápiz verde para guardar la posición de la pila z. Tenga en cuenta la posición de la pila z, ya que se utilizará en el paso 5.6.5.
   2. En la pestaña z Stack Setup, utilice el cuadro de entrada z Step define el espaciado entre los sectores z.
      NOTA: El número total de sectores se determina modulando los pasos 5.6.1 y 5.6.2.
   3. En el panel principal, haga clic con el botón derecho en el canal fluorescente y utilice el menú desplegable Modo de imagen para establecer el modo de imagen en 3D.
   4. En el panel principal, seleccione la caja de enfoque automático láser para deshabilitar el enfoque automático.
   5. En el panel principal, defina el enfoque inicial con la posición de la pila z del paso 5.6.1 y, a continuación, seleccione el cuadro de enfoque inicial para deshabilitar la función"Reenfocar en cada puntode tiempo".
7. En la pestaña Campos, utilice el menú desplegable Ubicación de campos para habilitar Puntos personalizadosy, a continuación, utilice las flechas para seleccionar puntos para la creación de imágenes.
   NOTA: El intervalo de tiempo entre adquisiciones (paso 5.8) determinará cuántos puntos personalizados se pueden crear imágenes simultáneamente.
8. En la ficha Serie temporal, seleccione el cuadro Adquirir serie temporal para habilitar la función de serie temporal y, a continuación, defina el número total de puntos de tiempo.
   NOTA: 6 puntos personalizados x 5 z sectores x 80 pilas a 2.400 imágenes, 2.400 imágenes x 8,2 MB por imagen a 19,68 GB de espacio en disco.
9. En el panel principal, use el cuadro de entrada Nombre para asignar un nombre a la configuración de adquisición y, a continuación, seleccione Archivo y Guardar para guardar la configuración de adquisición.
10. En el panel principal, seleccione el botón Analizar para ejecutar la adquisición.

6. Procesamiento posterior de imágenes

1. Arrastre y suelte el archivo xdce en Fiji para abrir la serie de imágenes como una hiperpilar multidimensional.
2. Guarde la hiperapila como un archivo tif.
3. Cree proyecciones de intensidad máxima y guárdelas como archivos tif.
4. Ensamble una biblioteca de proyecciones de intensidad máxima y cree una canalización para la extracción y el análisis de datos.

Results

El enfoque presentado en este protocolo se utilizó para examinar el papel de los microtúbulos en la reorganización del Retículo Endoplasmático (ER) durante la mitosis en el embrión Drosophila ¹⁵. Durante la mitosis, la estructura de la sala de emergencias muestra una reorganización dramática, sin embargo, las fuerzas que impulsan estos cambios se entienden mal. Recientemente, se demostró que una familia de proteínas de moldeo de Urgencias promueve la formación de tubos de ER^25,26,27,28,que son conocidos por su proximidad con microtúbulos^28. Para estudiar el rollo de microtúbulos sobre la morfología de urgencias, se utilizaron los métodos proporcionados en el protocolo para generar datos para comparar cuantitativamente los efectos de varios tratamientos farmacológicos microinyecidos en la reorganización de la ER durante la mitosis. Se encontró que la colchicina, que previene la polimerización de nuevos microtúbulos, reduce drásticamente la reorganización de la er durante la mitosis, como se muestra en la Figura 5 y la Figura 6. Además, el enfoque descrito aquí permitió la producción de datos de imágenes de vueltas de tiempo para 32 embriones. Se realizaron mediciones de intensidad media y máxima a partir de 12.800 regiones de interés utilizando un script MATLAB personalizado, que también generó estadísticas descriptivas e inferenciales vitales para realizar comparaciones entre tratamientos farmacológicos. Debido a la disponibilidad de sondas moleculares y la facilidad de las microinyeccións, los métodos descritos aquí son fácilmente adaptables para estudiar una variedad de procesos biológicos a través de la cuantificación de la intensidad de la fluorescencia.

Figura 5: Imágenes representativas del enriquecimiento Rtnl1-GFP y ReepB-GFP en los polos del husillo durante la mitosis. (A) Campo de visión 60x de ReepB-GFP durante la mitosis en el ciclo celular 10. El cuadrado azul representa el campo de visión utilizado para los paneles B-E. El panel A se procesa con un filtro binario de umbral. Este filtro no se aplicó a los paneles B-E, ya que excluye los datos de píxeles por debajo del umbral establecido. (B,D) ReepB-GFP en control, y en colchicina. (C,E) Rtnl1-GFP en control, y en colchicina. Esta cifra ha sido modificada de Diaz et al.¹⁵. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Cantidad del enriquecimiento Rtnl1-GFP y ReepB-GFP en los polos del husillo durante la mitosis. Se analizaron 20 husillos y 20 ROI de citoplasma en 10 cuadros en busca de 32 embriones en las siguientes condiciones. (A) Inyecciones de control DMSO del 10% para los embriones Rtnl1-GFP. Los embriones de control mostraron un aumento de 0,1 veces en el enriquecimiento (p<0.001 para todas las muestras en T210) en comparación con las muestras no inyectadas (p < 0.001 para todas las muestras en T210). (B) Embriones ReepB-GFP inyectados con 10% DMSO para servir como control. Los embriones de control mostraron un aumento de 0,1 veces en el enriquecimiento (p<0.001 para todas las muestras en T210) en comparación con las muestras no inyectadas(Figura 1E; p < 0.001 para todas las muestras en T210). (C) Embriones Rtnl1-GFP inyectados con 5 M de Colchicina. Aquí medimos una reducción en el enriquecimiento Rtnl1-GFP a husillos (p < 0.001 para todas las muestras en T210) en comparación con los controles (A) (p < 0.001 para todas las muestras en T210). (D) Embriones ReepB-GFP inyectados con 5 M de Colchicina. Medimos una reducción en el enriquecimiento ReepB-GFP a los husillos (p<0.001 para todas las muestras en T210) en comparación con los controles (B) (p<0.001 para todas las muestras en T210). Esta cifra ha sido modificada de Diaz et al.¹⁵. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Pasta de levadura21	2. Placas de uva21	3. Pegamento de heptano24
1.1 Añadir 7 gramos de levadura seca activa a un cónico de 50 ml. Agregue 9 mililitros de agua DI y mezcle hasta la constancia con una espátula metálica.	2.1 Hacer solución a: Añadir 6 gramos de agar a 140ml de agua DI en un matraz de 250 ml y autoclave.	3.1 Llene un vial de centelleo de vidrio con 50 pulgadas de cinta adhesiva de doble cara.
1.1 Añadir 7 gramos de levadura seca activa a un cónico de 50 ml. Agregue 9 mililitros de agua DI y mezcle hasta la constancia con una espátula metálica.	2.2 Hacer solución b: Mezclar 0,1 gramos de parabeno de metilo en 2 ml de etanol, luego añadir esta solución a 60 ml de concentrado de jugo de pomelo.	3.2 Añadir 20 ml de heptano y sellar el vial de centelleo de vidrio con parafilm. Gire durante la noche a temperatura ambiente.
	2.3 Inmediatamente después de la solución de autoclave a, mezclar en la solución b y verter la mezcla en 10 x 35 mm de platos perti. (hace 35 placas de uva)	3.3 Retire los residuos de cinta de plástico transfiriendo pegamento a 2 tubos cónicos de 15 ml y centrifugando a 3000 RPM durante 15 minutos.
	2.4 Deje que las placas de uva se ajusten a temperatura ambiente durante la noche sin tapa. Cubra las placas con tapas y guárdelas en 4C después de que se ajusten.	3.4 Transfiera el sobrenadante de pegamento en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para su almacenamiento.

Tabla 1: Recetas de medios y soluciones.

Discussion

El protocolo descrito aquí es altamente versátil y fácilmente adaptable para el estudio de eventos biológicos en una variedad de etapas en el desarrollo embrionario de Drosophila. Este protocolo es adecuado para el estudio de procesos biológicos que se producen durante largos períodos de tiempo. Por ejemplo, los estudios de celularización^29,30 o la formación de dominios de heterocromtina en Drosophila^31,32 podrían beneficiarse de la utilización de los métodos descritos en este protocolo ya que estos procesos se producen durante un período prolongado de tiempo. Además, el tamaño de la muestra se puede aumentar disminuyendo el aumento para estudiar preguntas que requieren menos resolución óptica, como el tiempo entre las divisiones sincitiales³³ o la duración de la gastrulación³⁴.  Del mismo modo, un objetivo de 20x permite que dos embriones se toten dentro de un plano de imagen. Los métodos de este protocolo proporcionan una plataforma dinámica para hacer preguntas biológicas utilizando el desarrollo embrionario como sistema modelo para el análisis cuantitativo.

Hay 3 pasos críticos en este protocolo. Post descorionación en 50% lejía es imperativo que los embriones se enjuaguen y se secan vigorosamente 5 veces (2.3.4). Este paso elimina cualquier resto de pequeños trozos de chorion. La tarea sobrante obstruirá el campo de visión al tomar imágenes del embrión. Al montar los embriones en el cubreobjetos de vidrio (3.5), es importante presionar los embriones sobre el pegamento con una presión uniforme. Esto colocará los embriones en el mismo plano z. Al abrir la aguja de microinyección, es importante retraer el émbolo inmediatamente para ajustar el caudal de la aguja o perderá todo el inyector.

Nuestro estudio estuvo limitado por dos factores. El primer factor fue no tener un proceso de segmentación automatizado. Diseñamos un script de segmentación manual usando MATLAB, sin embargo; con un marcador de husillo genéticamente codificado este proceso podría ser automatizado. En el futuro nos gustaría producir CNN-RFP^21,Rtln1-GFP y CNN-RFP; Líneas transgénicas ReepB-GFP para permitir la segmentación automatizada del husillo. Para obtener más información sobre nuestro script y canalización de análisis de MATLAB, consulte materiales suplementarios de Diaz et al.¹⁵. En segundo lugar, también estábamos limitados por nuestro intervalo de adquisición de 35 s, que sólo nos permitió imaginar 6 embriones simultáneamente. Un intervalo de adquisición más largo nos permitiría hacer una imagen simultánea de más embriones. Aunque el rendimiento de la entrega de medicamentos puede aumentar mediante la sustitución de la microinyección por un paso de permeación, nos pareció innecesario ya que nuestro tamaño de la muestra ya estaba limitado por el intervalo de adquisición.

Si bien este protocolo se utilizó para crear imágenes del desarrollo embrionario de Drosophila, el enfoque general es adaptable para estudiar el desarrollo embrionario en otros sistemas de modelos multicelulares, como C. elegans,Sea Urchins y Xenopus. Los embriones son extremadamente útiles para el análisis cuantitativo, ya que se sincronizan fácilmente a través de la recolección o fertilización. Además, los embriones no se alejan ni nadan lejos de un campo de visión, lo que permite el uso de un software simple con capacidad de adquisición multipunto para producir múltiples videos de lapso de tiempo para el análisis cuantitativo. Aunque utilizamos un analizador de alto contenido en nuestro estudio, cualquier sistema de microscopio invertido capaz de adquisición multipunto puede ser emparejado con los métodos mencionados en el presente documento.

Se pueden obtener resultados similares utilizando un microscopio confocal invertido capaz de adquisición multipunto; sin embargo, las ventajas de un analizador de alto contenido surgen a medida que se aumenta el tamaño de la muestra para estudiar preguntas que requieren menos resolución en el tiempo. Una ventaja obvia al usar un analizador de alto contenido es la capacidad de crear imágenes de 4 diapositivas separadas simultáneamente en comparación con 1 diapositiva en sistemas tradicionales. Con un conjunto completo de 4 diapositivas y 40 embriones en cada diapositiva, 160 embriones se pueden obtener imágenes durante varias horas, siempre y cuando el intervalo de adquisición sea de al menos 15 minutos entre fotogramas. Otra ventaja importante del uso de un analizador de alto contenido es que las muestras están completamente selladas de cualquier fuente de luz externa, lo que es necesario para las mediciones basadas en la intensidad de fluorescencia. Por último, el analizador de alto contenido utilizado en nuestro estudio tiene una cámara CMOS de 5,5 megapíxeles que proporciona un generoso campo de visión de 221,87 m con un aumento de 60x. Este campo de visión más grande nos permitió imaginar la mitad de un embrión por punto de adquisición.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 x 35mm Micro Plato	VWR	Cat #: 10799-192	N/A
100% Jugo de Uva Concentrado	Welch's, 100% Concentrado Jugo de Uva	N/A	Compra en la tienda de comestibles
Matraces Erlenmeyer de 250 ml, boca estrecha	VWR	Cat #: 10536-914	N/A
Tamiz no metálico de 3" No. 140	Gilson Company	SV-165 #140	N/A
4 Imágenes de portaobjetos Bandeja	Grace Biolabs	SKU: 400104	N/A
ACROS Organics, n-heptano, 99+%, para espectroscopía	Fisher Scientific	Cat #: AC411255000	N/A
Acros Organics, Etanol, 99.5%, reactivo ACS, absoluto, 200 pruebas	Fisher Scientific	Cat# : AC615095000	N/A
Acros Organics, 4-hidroxibenzoato de metilo, 99% . (metilparabeno)	Fisher Scientific	Cat#: AC126961000	N/A
Cubrecubierta, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Vidrio Flotado	Fisher Scientific	Cat #: 50-143-782	N/A
la lámina de silicona Culture Well: 1,6 mm de grosor	Grace Biolabs	SKU: 664273	n/a
DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Scintillation Vials Fisher	Scientific	Cat #: 03-341-71A	N/A
Jaula de recolección de embriones-Mini	Genesee Scientific	Cat #: 59-105	N/A Puntas
pipeta Eppendorf Microloader	Fisher Scientific	Código de producto: 10289651	N/A
Centrífuga cónica Falcon 15mL	Fisher Scientific Cat	#: 05-527-90	N/A
Tubos de centrífuga cónicos Falcon 50mL	Fisher Scientific	Cat #: 14-432-22	N/A
Fleischmann's, Levadura seca activa	Fleischmann's	N/A	Compra en el supermercado
Platos de	uva REFFER A LA PREPARACIÓN DE RECETAS	N/A	N/A
Aceite Halocarbon 27 Genesee	Scientific	Cat #: 59-133	N/A
Aceite Halocarbon 700	Genesee Scientific	Cat #: 59-131	N/A
Pegamento de heptano	REFFER A LA PREPARACIÓN DE RECETAS	N/A	N/A
Hojas de afeitar industriales (acero al carbono quirúrgico) de un solo filo n.º 9	VWR	Cat #: 55411-050	N/A
Película de sellado de laboratorio Parafilm M, 4 pulgadas x 250 pies Roll	Fisher Scientific	Cat #: 50-998-944	N/A
de doble cara con dispensador, ancho estrecho, diseñada para pegar, 1/2" x 7 yardas, paquete de 3 Caddy	Fisher Scientific	Cat #: NC0879005	N/A
Perlas de gel de sílice, desecante ~ 2 - 5 mm	Millipore Sigma	SKU: 1077351000	N/A
Cuchara/espátula de acero inoxidable	VWR	Cat #: 470149-044	N/A
W.A. Hammond Drierite Indicadora Absorbentes Fisher	Scientific	Cat #: 23-116582	N/A
Pasta de levadura	REFFER TO RECIPE PREP	N/A	N/A
EQUIPMENT
Allegra X-12 Sobremesa, Centrífuga	Beckman Coulter	N/A	Necesitará acceso a insertos de centrífuga cónicos de 15 ml.
Autoclave	N/A	N/A	Cualquier autoclave funcionará bien.
Microinyector Drummond Nanoject II.	Drummond Scientific	N/A	Este es un sistema de inyección a base de aceite mineral.
Analizador de células GE Healthcare IN 6000.	GE healthcare	N/A	Se puede sustituir por un microscopio confocal rápido capaz de adquisición multipunto.
Refrigerador (4C°)	N/A	N/A	Los medios para moscas y la pasta de levadura deben almacenarse a (4C°).
Microscopio estereoscópico Zies Stemi 508 con base de transiluminación 300 e iluminación cenital de cuello de cisne.	Microscopía Zeiss	N/A	La base de transiluminación y la iluminación de cuello de cisne son necesarias.