Distinción de las células inmunitarias intrapulmonares de las poblaciones de células inmunitarias intravasculares: el enfoque intrayugular

Resumen

El objetivo del presente estudio es describir un protocolo para diferenciar entre células inmunes intravasculares e intraparenquimatosas en estudios de inflamación pulmonar. Utilizamos una inyección intrayugular de un anticuerpo marcado con fluorescencia antes de la extracción de pulmón. Además, utilizamos un proceso de digestión pulmonar basado en la inflación para mejorar el rendimiento de los leucocitos del pulmón.

Resumen

Los ritmos circadianos se refieren a oscilaciones en diversos procesos biológicos que ocurren con un período de 24 horas. A nivel molecular, estos ritmos están formados por una red de bucles de retroalimentación transcripcional-traduccional (TTFL) de genes reloj centrales. Los tejidos y sistemas de órganos individuales, incluido el sistema inmunitario, tienen su propio reloj. En la circulación sistémica, varios miembros de la población CD45⁺ oscilan a lo largo del día; sin embargo, muchos de estos ritmos no son idénticos o incluso similares en la población de leucocitos CD45⁺ residentes en los tejidos. Al estudiar el papel de la regulación circadiana de la inflamación pulmonar, puede ser necesario investigar el CD45⁺ dentro del pulmón. Sin embargo, a pesar de los métodos de perfusión optimizados, los leucocitos atrapados en la circulación persisten en los pulmones. El objetivo del diseño de este protocolo fue distinguir entre leucocitos intravasculares e intraparenquimatosos. Con este fin, a los ratones se les inyecta un anticuerpo CD45 marcado con fluorescencia por vía intrayugular poco antes de la extracción de pulmón. A partir de entonces, el pulmón se digiere mediante una técnica de digestión pulmonar personalizada para obtener una suspensión de una sola célula. La muestra se tiñe para el panel regular de anticuerpos para células inmunitarias intraparenquimatosas (incluido otro anticuerpo CD45). Los análisis de clujocitometría muestran una clara elucidación de las poblaciones. Por lo tanto, el método de etiquetado y definición de las células CD45⁺ intrapulmonares será particularmente importante cuando el comportamiento de las células inmunitarias intrapulmonares y circulantes sea numérica y funcionalmente distinto.

Introducción

Describimos aquí métodos eficientes y fiables para diferenciar los leucocitos intravasculares de los pulmonares. Incluso con las mejores técnicas de perfusión, los estudios han revelado que los residuos de CD45⁺ de la circulación persisten en el pulmón. Esto afecta la capacidad de distinguir entre los ritmos de la circulación y los del pulmón. Este efecto se amplifica aún más en casos de inflamación pulmonar. Esto es particularmente relevante para el estudio de la regulación circadiana de la inflamación.

Los ritmos circadianos se refieren a las oscilaciones diurnas en diversos procesos biológicos que ocurren con un período de 24 h. El sistema circadiano es un mecanismo anticipatorio conservado evolutivamente que confiere protección al huésped cuando se enfrenta a cambios en su entorno, como la amenaza de infecciones. A nivel celular, el reloj está organizado en bucles de retroalimentación transcripcional-traduccional autosostenidos que comprenden los genes del reloj central¹. El sistema inmunitario tiene su propio reloj que influye en su respuesta a los patógenos y a las agresiones inflamatorias ^2,3. Al ser un órgano expuesto al medio ambiente constantemente, los ritmos circadianos son particularmente importantes en el pulmón⁴. Varios procesos inmunológicos en el pulmón están bajo control ^5,6,7. Sin embargo, la fase de varios procesos biológicos en el pulmón y la circulación sistémica no son las mismas⁸, lo que por extensión, también sugiere que las oscilaciones de los leucocitos en el pulmón y la circulación pueden no ser idénticas. Por lo tanto, tener un método para distinguir de manera eficiente entre leucocitos pulmonares e intravasculares será fundamental en el contexto circadiano.

El objetivo de este estudio fue diseñar un método que permita diferenciar de forma fiable entre leucocitos intravasculares e intraparenquimatosos. Para ello, se utilizó un método de marcaje de leucocitos intravasculares y digestión pulmonar. Para el marcaje de leucocitos intravasculares, utilizamos la inyección intrayugular, que se dirige a un vaso sanguíneo grande y puede utilizarse de forma reproducible en ratones de todas las cepas y tamaños. Muchos otros métodos han utilizado la inyección de la vena de la cola ^9,10, que es notoriamente más difícil de realizar en ratones Bl6¹¹. La inyección intrayugular requiere el uso de anestesia y se realiza mejor bajo visualización directa con microscopio de disección o lupas de aumento. Por lo tanto, la facilidad y fiabilidad de la inyección intrayugular deben sopesarse frente a la necesidad de anestesia y equipo especial. Sin embargo, dada la disponibilidad inmediata de estos equipos en la mayoría de los laboratorios de investigación, no consideramos que esto sea un factor limitante. Sin embargo, parece prudente considerar caso por caso.

Protocolo

Todos los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pensilvania y cumplieron con las estipulaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

NOTA: El proceso general puede dividirse en 1) marcaje intravenoso de CD45, 2) recolección, 3) digestión y 4) tinción y citometría de flujo. Estos pasos se han resumido en la Figura 1.

1. Preparación de soluciones/reactivos

1. Prepare los medios de disociación agregando 5 mL de L-glutamina 2 mM, 20 mL de Suero Fetal Bovino (FBS), 1 mL de 2-mercaptoetanol y 10 mL de Pen/Strep a 500 mL de DMEM.
   NOTA: Los medios de disociación son estables hasta 2 meses cuando se almacenan a 2-4 °C.
2. Prepare el tampón de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) añadiendo 10 mL de FBS y 500 mg de azida de sodio a 500 mL de PBS sin magnesio ni calcio.
   NOTA: Con la adición de azida de sodio, FACS Buffer se puede almacenar a 2-4 °C durante meses.
3. El día de la recolección de la muestra, agregue las soluciones de DNasa y Liberasa a los medios de disociación en una dilución de 1:100 (es decir, agregue 10 μL de DNasa y Liberasa por cada 1 mL de medios de disociación).
   NOTA: Para cada ratón, la digestión de todo el pulmón requiere 10 mL/ratón y la mitad del pulmón requiere 5 mL/ratón.

2. Marcaje intravenoso de CD45

1. Para este experimento, utilice ratones C57Bl6 adultos de entre 8 y 12 semanas de edad.
2. Anestesiar a los ratones con los agentes de su elección. Se utilizó una combinación de xilacina y ketamina para este propósito, pero también se aceptan otros agentes. El objetivo es conseguir un nivel de anestesia de moderado a profundo que dure unos 5-10 minutos.
   NOTA: La mezcla de anestesia con xilacina y ketamina se administra por vía intraperitoneal. Use 10-15 mg/kg de xilacina y 120-150 mg/kg de ketamina.
3. Una vez que el reflejo pedal sea negativo, coloque al animal boca arriba y pegue sus extremidades suavemente para mantener la cabeza lo más central posible.
4. Exponga la vena yugular y el músculo pectoral levantando la piel con fórceps y cortando con tijeras quirúrgicas afiladas.
5. Inyectar 200 μL de anticuerpo anti-CD45 (anticuerpo de grado citométrico de flujo; diluido 1:300 en PBS) en la vena yugular con una aguja de 28 G. Espere de 2 a 4 minutos para que el anticuerpo pueda circular por toda la vasculatura.
   NOTA: La entrada a través del músculo pectoral en la vena yugular desde un ángulo poco profundo evita que se produzca un sangrado considerable.
6. A continuación, eutanasiar al animal mediante la exposición al CO₂ durante 10 minutos. Proceda a la perfusión pulmonar y extraiga pulmones y otros tejidos.
   NOTA: Cualquier otro método de eutanasia humanitaria que se adhiera a las pautas de AVMA para la eutanasia de animales también es aceptable.

3. Disección/Cosecha (Figura 1)

1. Coloque al animal boca arriba sobre una tabla plana y sujete las patas hacia abajo, manteniendo la cabeza en el centro.
2. Rocíe el cuerpo con etanol al 70%. Abra la cavidad torácica con fórceps y tijeras para exponer el pulmón, el corazón y la tráquea.
3. Perfundir el pulmón haciendo una pequeña incisión en el ventrículo izquierdo del corazón e inyectando 10 ml de PBS frío a través del ventrículo derecho.
4. Cortar una abertura en la tráquea e insertar una cánula intravenosa. Una vez que la cánula esté colocada, pase una cuerda de sutura de unos 6-8 cm de largo por debajo de la tráquea y átela dos veces a la cánula.
5. Mete el hilo quirúrgico en la cánula y conecta una jeringa que contenga medios de disociación (5 mL para medio pulmón o 10 mL para todo el pulmón) como se muestra en la Figura 1B.
6. Separe suavemente el pulmón del resto del cuerpo y coloque la jeringa con el pulmón conectado en un tubo cónico de 50 ml.

4. Digestión a suspensión unicelular

1. Incubar el pulmón a 37 °C durante 30-40 minutos, instilando 1 mL (para la mitad del pulmón) o 2 mL (para todo el pulmón) de medios de disociación cada 5 minutos.
2. Una vez que se hayan instilado todos los medios, retire la jeringa y la cánula, y coloque el tubo cónico de 50 ml en un baño de agua agitable a 180 rpm durante el resto de la incubación para un mejor rendimiento.
   NOTA: Alternativamente, los tubos se pueden agitar manualmente cada 5 minutos.
3. Agregue 10 ml de PBS y agite vigorosamente durante 1 minuto para detener la reacción.
4. Pase la solución a través de un filtro de células (70 μm) a un nuevo tubo cónico de 50 mL. Use un tapón de goma para jeringa de 5 ml para pasar cualquier grumo de tejido a través del colador. Agregue PBS para que el volumen final sea de 30 mL.
5. Centrifugar las muestras durante 10 minutos a 1.200 x g y 4 °C. Deseche el sobrenadante sin alterar la pellet. Pipetea cualquier solución restante.
6. Agregue 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) y mezcle con el pellet de celda mediante pipeteo.
7. Incubar a temperatura ambiente durante 60-90 s. Agregue PBS para que el volumen final sea de 30 mL para detener la reacción.
   NOTA: El tiempo de incubación depende de la cantidad de sangre en el gránulo de la célula; Cuanto más rojo sea el pellet de la célula, mayor será el tiempo de incubación.
8. Centrifugar las muestras durante 10 minutos a 1.200 x g y 4 °C. Deseche el sobrenadante sin alterar la pellet. Pipetea cualquier solución restante.
9. Agregue 1 mL de tampón FACs al pellet de la celda y mezcle mediante pipeteo.

5. Células de tinción para citometría de flujo

1. Utilice un contador de células para determinar el número total de células en la suspensión celular.
2. Transfiera la suspensión celular a cada tubo FACS marcado para que haya un total de 3 x 10⁶ celdas por muestra.
3. Añadir Fc Block (diluido 1:100) e incubar durante 15 minutos en hielo.
4. Centrifugar los tubos durante 5 minutos a 1.200 x g y 4 °C. Deseche el sobrenadante sin alterar la pellet.
5. Tiñir las muestras con una mezcla de anticuerpos especificada e incubar durante 20 minutos en hielo protegido de la luz (es decir, cubriéndolo con papel de aluminio). Mezcle colocando los tubos contra el soporte del tubo a mitad de la incubación.
6. Añadir 1 mL de tampón FACS para lavar y mezclar mediante pipeteo.
7. Transfiera la suspensión de la célula a otro tubo FACS pipeteando la suspensión lentamente a través de un filtro de 35 μm.
8. Centrifugar los tubos durante 5 minutos a 1.200 x g y 4 °C. Deseche el sobrenadante sin alterar la pellet.
9. Añadir 150 μL de tampón FACS y mezclar mediante pipeteo.
10. Añada 10 μl de DAPI (1:100) a cada tubo inmediatamente antes de utilizar las muestras.
    NOTA: Las muestras ya están listas para ser ejecutadas en el citómetro de flujo.

Resultados

Con esta técnica, el recuento total de células de los pulmones disociados naïve (solo se utilizaron los lóbulos izquierdos para los datos representativos) estuvo entre 27,3 x 10⁶ y 71,1 x 10⁶ células/mL. Después de la delimitación del tamaño y la exclusión de los dobletes y las células muertas (esquema de compuerta en la Figura 2), los recuentos de leucocitos oscilaron entre 6,9 x 10⁶ y 13,5 x 10⁶ células/mL. Los leucocitos circulantes que permanec...

Discusión

Los estudios cuidadosos de la inflamación pulmonar y las respuestas inmunitarias pulmonares son cruciales para la comprensión de muchas enfermedades. La citometría de flujo se utiliza de forma rutinaria para enumerar y atribuir relevancia funcional a los leucocitos pulmonares. La función de los leucocitos depende, al menos en parte, del lugar donde se encuentren. Aunque se acumulan pruebas que respaldan que, incluso después de protocolos de perfusión perfectos, muchos leucocitos intravas...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Boekel Scientific Baño de agua mediano	Boekel Grant	Scientific 290200
Jeringas BD de 10 mL con punta BD Luer-Lok BD	Biosciences	309604
5 mL Jeringas BD con punta BD Luer-Lok BD	Biosciences	309646
Anti-CD45- Pac Blue	Biolegend	103114
Anti-CD45- Pe/Cy7	Biolegend	103114
Filtro de células 70 µ m Nylon	Fisher	352350
Corning Tubo de centrífuga de fondo cónico 50 mL	Avantor	21008-714
Corning Falcon Tubo de ensayo con filtro de células Snap Cap	EMSCO	Microscopio de
	Olympus	SZX-SDO2
DMEM, alta glucosa	Life Technologies	11965084
Dnase	Roche
DPBS sin Ca++ & Mg++		14190136
Fc Block	Biolegend	101320
HyClone Suero fetal bovino	GE Healthcare	SH30071.03
L-Glutamina (200 mM)	Life Technologies	25030-081
Liberase Research Grade	Sigma	5401127001
Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122
Baño de agua agitador de precisión	Thermo Fisher	TSSWB15
tampón de lisado de glóbulos rojos	Sigma	R7757
Sutura Silk 4-0	Roboz	SUT-15-2

disección 10004637 10104159001