Construcción de mutantes en el serotipo 1 Streptococcus pneumoniae cepa 519/43

Resumen

Aquí, describimos una cepa 519/43 del serotipo 1 de S. pneumoniae que puede modificarse genéticamente utilizando su capacidad para adquirir ADN de forma natural y un plásmido suicida. Como prueba de principio, se hizo un mutante isogénico en el gen de la neumolisina (ply).

Resumen

Streptococcus pneumoniae serotipo 1 sigue siendo un gran problema en los países de ingresos bajos y medios, particularmente en el África subsahariana. A pesar de su importancia, los estudios en este serotipo se han visto obstaculizados por la falta de herramientas genéticas para modificarlo. En este estudio, describimos un método para modificar genéticamente un aislado clínico de serotipo 1 (cepa 519/43). Curiosamente, esto se logró explotando la capacidad del neumococo para adquirir ADN de forma natural. Sin embargo, a diferencia de la mayoría de los neumococos, el uso de ADN lineal no tuvo éxito; Para mutar esta importante cepa, se tuvo que usar un plásmido suicida. Esta metodología ha proporcionado los medios para una comprensión más profunda de este esquivo serotipo, tanto en términos de su biología como de patogenicidad. Para validar el método, la principal toxina neumocócica conocida, la neumolisina, fue mutada porque tiene un fenotipo bien conocido y fácil de seguir. Demostramos que el mutante, como era de esperar, perdió su capacidad de lisar los glóbulos rojos. Al poder mutar un gen importante en el serotipo de interés, pudimos observar diferentes fenotipos para la pérdida de función mutantes en infecciones intraperitoneales e intranasales de los observados para otros serotipos. En resumen, este estudio demuestra que la cepa 519/43 (serotipo 1) puede ser modificada genéticamente.

Introducción

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, el neumococo) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial. Hasta hace poco, se han descubierto cerca de 100 serotipos de S. pneumoniae 1,2,3,4,5,6,7. Anualmente, la enfermedad neumocócica invasiva (EPI) se cobra alrededor de 700.000 muertes, de niños menores de 5 años⁸. S. pneumoniae es la principal causa de....

Protocolo

1. Generación del amplicón mutante por SOE-PCR²³ y amplificación del casete de espectinomicina

1. Comience realizando PCR para la amplificación de los brazos de homología (ply 5' (488 pb) y ply3' (715 pb) respectivamente) de las regiones flanqueantes del gen ply de la cepa 519/43. Use imprimaciones plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGCGGATCC AGAACCAAACTTGTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTGTGTCTATATTTCG) y plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTACCACC).
2. Utilice las siguientes condiciones de PCR para la capa 5': desnaturali....

Resultados

El protocolo descrito aquí comienza utilizando PCR para amplificar los brazos de homología izquierda y derecha, mientras que simultáneamente elimina 191 pb de la región media del gen ply . Durante la realización de la PCR se introduce un sitio BamHI en los 3' del brazo de homología izquierdo y en el extremo 5' del brazo de homología derecho (Figura 1A). Esto es seguido por PCR-SOE donde los brazos de homología izquierda y derecha se fusionan en un amplicón (Figu.......

Discusión

Streptococcus pneumoniae, en particular el serotipo 1, sigue siendo una amenaza mundial que causa enfermedad neumocócica invasiva y meningitis. A pesar de la introducción de varias vacunas que deberían ser protectoras contra el serotipo 1, en África, este serotipo todavía es capaz de causar brotes que conducen a una alta morbilidad y mortalidad¹³. La capacidad de manipular genéticamente este serotipo es de importancia crítica debido a su relevancia clínica. El método descrito en este estu.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
AccuPrime Pfx ADN polimerasa	Invitrogen	12344024	Se utiliza para la amplificación de los fragmentos
Ampicilina sódica sal	Sigma Aldrich	A9518	Se utiliza para la selección bacteriana en la etapa 1(pSD1)
Agar sanguíneo Base	Oxoid	CM0055	Se utiliza para colocar en placas S. pneumoniae
transformantes Albúmina sérica bovina	sigma	55470	utilizado para células S. pneumoniae Transformación
Brain Heart Infusion	Oxoid	CM1135	utilizado para cultivar células S. pneumoniae
Cloruro de calcio Cacl2	Sigma	449709	utilizado para S. pneumoniae Transformación
Péptido estimulante de la competencia 1	AnaSpec	AS-63779	utilizado para la transformación S. pneumoniae Agar
de caldo Luria	Gibco	22700025	utiliza para el recubrimiento y la selección de pSD1 y pSD2 Base de
caldo Luria (formulación de Miller)	Gibco	12795027	utilizado para el recubrimiento y la selección de pSD1 y pSD2 Kit de
extracción de gel Monarca	NEB	T1020S	Se utiliza para extraer las bandas del gel de ADN
Plásmido Monarca Miniprep Kit	NEB	T1010S	Se utiliza para extraer el plásmido de las células
pGEM T-easy	Promega	A1360	utilizado como plásmido suicida
S.O.C.	Invitrogen	15544034	utiliza para la recuperación de células después de la transformación
Hidróxido de sodio (NaOH)	Sigma	S0899	utilizado para la transformación de S.pneumoniae
Clorhidrato de espectinomicina	SigmaAldrich	PHR1426	utilizado para la selección bacteriana
Eficiencia de subclonación DH5 y alfa; Células competentes	Invitrogen	18265017	utiliza para la creación de pSD1 y pSD2