Detección de alto rendimiento de compuestos químicos para dilucidar sus efectos sobre la persistencia bacteriana

Resumen

En este documento de método, presentamos una estrategia de cribado de alto rendimiento para identificar compuestos químicos, como los osmolitos, que tienen un impacto significativo en la persistencia bacteriana.

Resumen

Los persistentes bacterianos se definen como una pequeña subpoblación de variantes fenotípicas con la capacidad de tolerar altas concentraciones de antibióticos. Son un problema de salud importante, ya que se han asociado con infecciones crónicas recurrentes. Aunque se sabe que la dinámica estocástica y determinista de los mecanismos relacionados con el estrés juega un papel significativo en la persistencia, los mecanismos subyacentes al cambio fenotípico hacia / desde el estado de persistencia no se entienden completamente. Si bien los factores de persistencia desencadenados por las señales ambientales (por ejemplo, el agotamiento de las fuentes de carbono, nitrógeno y oxígeno) han sido ampliamente estudiados, los impactos de los osmolitos en la persistencia aún no se han determinado. Utilizando microarrays (es decir, 96 placas de pozo que contienen diversos productos químicos), hemos diseñado un enfoque para dilucidar los efectos de varios osmolitos en la persistencia de Escherichia coli de una manera de alto rendimiento. Este enfoque es transformador, ya que se puede adaptar fácilmente para otras matrices de cribado, como paneles de medicamentos y bibliotecas de eliminación de genes.

Introducción

Los cultivos bacterianos contienen una pequeña subpoblación de células persistentes que son temporalmente tolerantes a niveles inusualmente altos de antibióticos. Las células persistentes son genéticamente idénticas a sus parientes sensibles a los antibióticos, y su supervivencia se ha atribuido a la inhibición transitoria del crecimiento¹. Las células persistentes fueron descubiertas por primera vez por Gladys Hobby^2, pero el término fue utilizado por primera vez por Joseph Bigger cuando las identificó en cultivos de Staphylococcus pyogenes tratados con penicilina^3. Un estudio seminal pu....

Protocolo

1. Preparación de medio de crecimiento, solución de ofloxacina y acciones de células de E. coli

1. Medio regular Luria-Bertani (LB): Añadir 10 g/L de triptona, 10 g/L de cloruro de sodio (NaCl) y 5 g/L de extracto de levadura en agua desionizada (DI). Esterilizar el medio por autoclave.
2. Placas de agar LB: Añadir 10 g/L de triptona, 10 g/L de NaCl, 5 g/L de extracto de levadura y 15 g/L de agar en agua DI y esterilizar el medio por autoclave. A la temperatura deseada (~55 °C), verter ~30 mL de agar medio en placas cuadradas (10 x 10 cm). Secar las placas y conservar a 4 °C.
3. Medio LB modificado: Añadir 10 g/L de tript....

Resultados

La Figura 1 describe nuestro protocolo experimental. Los experimentos del ciclo de dilución/crecimiento (ver Protocolo 2) fueron adaptados de un estudio realizado por Keren et al.⁵ para eliminar los persistidores originarios de los cultivos nocturnos. La Figura 2A es una imagen representativa de las placas de agar utilizadas para determinar los niveles de UFC de los cultivos celulares antes y después del tratamiento con OFX. En estos expe.......

Discusión

El ensayo persistente de alto rendimiento descrito aquí se desarrolló para dilucidar los efectos de varios productos químicos sobre la persistencia de E. coli. Además de las placas PM comerciales, los microarrays se pueden construir manualmente como se describe en el paso 4.2. Además, el protocolo presentado aquí es flexible y se puede utilizar para examinar otros microarrays, como paneles de medicamentos y bibliotecas celulares, que están en formatos de placa de 96 pozos. Las condiciones experimentales, incluid.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de ensayo de 14 ml	Fisher Scientific	14-959-1B
Cepa de E. coli MG1655	Universidad		de Princeton Obtenido del laboratorio Brynildsen
Placa de fondo plano de 96 pocillos	USA Scientific	5665-5161
Membrana de sellado permeable al gas	VWR	102097-058	Esterilizada por irradiación gamma y libre de citotoxinas
Media área placa de 96 pocillos de fondo plano	VWR	82050-062
LB agar	Fisher Scientific	BP1425-2	Grado de genética molecular
Sal de ofloxacino	VWR	103466-232	HPLC ≥ 97.5
Microarray fenotipo (PM-9 y PM-10)	Biolog	N/A	placas PM-9 y PM-10 contenían varios osmolitos y tampones respectivamente
Placa de 96 pocillos de fondo redondo	USA Scientific	5665-0161
Cloruro de sodio	Fisher Scientific	S271-500	Grado ACS Certificado ACS
Nitrato de sodio	Fisher Scientific	AC424345000	ACS grado reactivo
Nitrito de sodio	Fisher Scientific	AAA186680B	98% de pureza
Placa de Petri cuadrada	Fisher Scientific	FB0875711A
Triptona	Fisher Scientific	BP1421-500	Grado de genética molecular
Lector de microplacas multimodo Varioskan lux	Thermo Fisher Scientific	VLBL00D0	Se utiliza para la medición de la densidad óptica a 600 nm
Extracto de levadura	Fisher Scientific	BP1422-100	Grado de genética molecular

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