Artículo de método

Análisis de la red α-Actinin en cardiomiocitos humanos derivados de iPSC mediante microscopía de localización de molécula única

DOI:

10.3791/61605

⸱

3 de noviembre de 2020

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1Department of Cardiac Surgery, Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Rostock University Medical Center, 2Faculty of Interdisciplinary Research, Department Life, Light & Matter, University Rostock, 3Department of Cardiology, Rostock University Medical Center

En este artículo

Resumen

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La formación de una red adecuada de sarcomere es importante para la maduración de los cardiomiocitos derivados del iPSC. Presentamos un enfoque basado en la super resolución que permite la evaluación cuantitativa de la maduración estructural de los cardiomiocitos derivados de células madre, para mejorar las condiciones de cultivo promoviendo el desarrollo cardíaco.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La maduración de los cardiomiocitos derivados de iPSC es un problema crítico para su aplicación en la terapia regenerativa, las pruebas de drogas y el modelado de enfermedades. A pesar del desarrollo de múltiples protocolos de diferenciación, la generación de cardiomiocitos iPSC que se asemejan a un fenotipo similar a un adulto sigue siendo un reto. Un aspecto importante de la maduración de los cardiomiocitos consiste en la formación de una red de sarcomere bien organizada para garantizar una alta capacidad de contracción. Aquí, presentamos un enfoque basado en la superrescencia para el análisis semicuantitativo de la red α-actinina en cardiomiocitos. Mediante la microscopía de localización fotoactivada se realizó una comparación de la longitud de los sarcomos y el grosor del disco z de los cardiomiocitos derivados de iPSC y las células cardíacas aisladas del tejido neonatal. Al mismo tiempo, demostramos la importancia de las condiciones de imagen adecuadas para obtener datos fiables. Nuestros resultados muestran que este método es adecuado para monitorear cuantitativamente la madurez estructural de las células cardíacas con alta resolución espacial, permitiendo la detección de cambios incluso sutiles de la organización del sarcomere.

Introducción

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Las enfermedades cardiovasculares (ECV) como el infarto de miocardio o la miocardiopatía siguen siendo la principal causa de muerte en el mundo occidental1. Como el corazón humano sólo posee una mala capacidad regenerativa, es necesario establecer estrategias para promover la recuperación de las enfermedades cardiovasculares. Esto incluye terapias de reemplazo celular para reponer los cardiomiocitos perdidos (CM), así como el desarrollo de nuevos fármacos antiarrítmicos para una intervención farmacéutica eficiente y segura. Se ha demostrado que las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son una fuente celular prometedora para la generación ilimitada de CM humano in vitro, adecuada para terapias regenerativas, modelado de enfermedades y para el desarrollo de ensayos de detección de fármacos2,,3,,4.

Aunque existen muchos protocolos de diferenciación cardiaca diferentes, la CM derivada de iPSC todavía carece de ciertos aspectos fenotípicos y funcionales que impiden la aplicación in vitro e in vivo5,6. Además de los cambios electrofisiológicos, metabólicos y moleculares, el proceso de maduración cardíaca implica la organización estructural de los sarcomeres, que son las unidades fundamentales necesarias para la generación de fuerza y la contracción celular7. Mientras que los CM adultos exhiben un aparato contráctil bien organizado, los CM derivados de iPSC suelen demostrar filamentos de sarcomer desarbanados, asociados con una capacidad de contracción reducida y una dinámica de contracción alterada8,,9. A diferencia de la CM madura que muestra un patrón de contracción noxial, las estructuras desorientadas en CM inmaduro resulta en una contracción radial de toda la célula o promueven la aparición de puntos focales de contracción9,,10.

Para mejorar la maduración cardiaca, se han aplicado múltiples enfoques, incluyendo métodos de cultivo celular 3D, estimulación eléctrica y mecánica, así como el uso de matrices extracelulares que imitan las condiciones in vivo11,,12,,13. Para evaluar el éxito y la eficiencia de estas diferentes condiciones de cultivo, se necesitan técnicas para monitorear y estimar el grado de maduración estructural del iPSC CM, por ejemplo, mediante técnicas microscópicas. A diferencia de las imágenes confocales convencionales, la resolución en caso de microscopía de localización fotoactivada (PALM) es aproximadamente 10 veces mayor. Esta técnica a su vez permite un análisis más preciso, detectando incluso alteraciones sutiles de las estructuras celulares14. Teniendo en cuenta la alta resolución de las imágenes basadas en PALM, el objetivo general de este método fue la evaluación microscópica de la madurez de los sarcomeres en los CM derivados de iPSC mediante la determinación precisa del espesor del z-Disc y la longitud del sarcomere. En estudios anteriores, se ha demostrado que estas características estructurales son parámetros adecuados para evaluar la madurez cardíaca15. Por ejemplo, el iPSC-CM enfermo que carece de distrofina de longitud completa exhibe una longitud reducida de sarcomere y ancho de banda z en comparación con las celdas de tipo salvaje16. Del mismo modo, se midió la longitud de los sarcomeres individuales para investigar el impacto de las señales topográficas en el desarrollo cardíaco16. Por lo tanto, aplicamos este enfoque para evaluar la maduración estructural de la red de sarcomere en iPSC-CM midiendo cuantitativamente la longitud de sarcomere y el espesor del disco z.

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Protocolo

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Todos los pasos de este protocolo que involucran ratones neonatales y adultos se realizaron de acuerdo con las pautas éticas para el cuidado animal del Centro Médico de la Universidad de Rostock.

1. Cultivo y disociación de cardiomiocitos derivados de iPSC

  1. Diferencie hiPSC-CMs durante 25 días utilizando un método monocapa 2D como se describió anteriormente17.
  2. Precalentamiento medio de disociación a 37 oC y soporte de temperatura media a ambiente.
  3. Lave las células dos veces con PBS.
  4. Añadir medio de disociación precalentado a las células e incubar durante 12 min a 37oC y 5% de CO2.
  5. Agregue un medio de soporte a las celdas.
    NOTA: El volumen del medio de soporte añadido debe ser el doble del volumen del medio de disociación utilizado en el paso 1.4.
  6. Desalojar las células con una pipeta serológica de 5 ml.
  7. Células centrífugas a 200 x g durante 5 min y resuspend el pellet en 3 ml del medio de cultivo hiPSC-CM17.
  8. Células de semillas en cámaras inferiores de vidrio de 8 pozos con una densidad celular de 75.000 células/pozo y cultivo durante 3 días.

2. Aislamiento de cardiomiocitos para adultos

  1. El aislamiento y cultivo de cardiomiocitos adultos a partir de ratones NMRI se realizó según se informó previamentede 18.
  2. Células de semillas en tobogán de cámara de vidrio de 8 pozos y cultivo durante un día.

3. Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales

  1. El procedimiento de aislamiento de los cardiomiocitos neonatales, obtenidos a partir de ratones NMRI, se realizó como se describió anteriormente19.
  2. Célula aislada de semilla en 8 biens de vidrio de la cámara de deslizamiento a una densidad celular de 75.000 células / pozo y cultivo durante 3 días en medio de cultivo de CM neonatal19.

4. Etiquetado de inmunofluorescencia de la red α-actinin

NOTA: Para obtener resultados óptimos, las células se cultivan en cámaras inferiores de vidrio de 8 pozos. El etiquetado debe realizarse un día antes de la toma de imágenes.

  1. Precalienta el 4% de PFA a 37oC.
  2. Fijar iPSC-CM añadiendo un 4% de paraformaldehído directamente en los medios de cultivo (1:1 dilución) e incubar a 37 oC durante 15 min. La concentración final de PFA para la fijación es del 2%.
  3. Incubar células fijas en 0.2% Tritón-X, diluidas en PBS, durante 5 min a temperatura ambiente.
  4. Lave las células dos veces con PBS, 5 min cada una.
  5. Añadir 1% de solución de BSA (diluido en PBS) e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente.
  6. Preparar 150 l de solución primaria de anticuerpos diluyendo α anticuerpo-actinina 1:100 en 1% de BSA, que contiene 0,05% Tritón-X. Añadir a las células e incubar a temperatura ambiente durante 60 min.
  7. Lave las células dos veces con una solución de BSA al 0,2%, 5 min cada una.
  8. Preparar 150 l de solución secundaria de anticuerpos diluyendo el anticuerpo Alexa647 anti-ratón de cabra 1:100 en 1% de BSA, que contiene 0,05% Tritón-X. Añadir a las células e incubar a temperatura ambiente durante 40 min.
  9. Lave las células dos veces con una solución de BSA al 0,2%, 5 min cada una.
  10. Lave las células dos veces con PBS, 5 min cada una. Mantenga las células etiquetadas en la oscuridad a 4 oC hasta que se realicen imágenes PALM.

5. Preparación del búfer de imágenes PALM

NOTA: Es fundamental preparar recién el búfer de imágenes PALM para cada experimento.

  1. Preparar una solución de glucosa al 50% disolviendo 25 g de glucosa en 50 ml de agua destilada.
  2. Preparar tampón básico que contenga 50 mM de Tris-HCl, 10% de glucosa y cloruro de sodio de 10 mM.
    1. Ajuste el nivel de pH a 8,0 con ácido clorhídrico.
  3. Preparar la solución de piranose oxidasa disolviendo 0,6 mg de piranosa oxidasa en 316 l de tampón básico.
  4. Preparar la solución de catalasa disolviendo 7 mg de catalasa en 500 ml de tampón básico. Mezclar bien y centrifugar a 10.000 x g durante 3 min. Mantenga el sobrenadante para su uso posterior. La solución de catalasa se puede mantener a 4 oC durante varios días.
  5. Preparar 500 l de tampón de imágenes PALM mezclando 316 l de solución de piranose oxidasa, 25 l de solución de catalasa, 100 l de solución de glucosa al 50%, 50 ml de cistemina, 5 l de ciclooctato y 3,5 l de β-Mercaptoetanol. La actividad catalítica final de la piranosa oxidasa y la catalasa debe ser de 7,5 U, 35,00U respectivamente.
    NOTA: El búfer de imágenes PALM proporciona condiciones óptimas de imagen durante 3-5 h. Si la capacidad de parpadeo del tinte fluorescente disminuye, prepare una nueva alícuota tampón.

6. Adquisición de imágenes PALM

  1. Encienda el microscopio al menos 3 horas antes de su uso y lleve la muestra a temperatura ambiente antes de la toma de imágenes para permitir el equilibrio térmico. Si el microscopio está equipado con una cámara de incubación, ajuste la temperatura a 30 oC.
  2. Limpie el objetivo y la parte inferior del portaobjetos de la cámara con un disolvente de limpieza adecuado.
  3. Agregue 300 l de tampón de imágenes PALM en un pocóculo de células etiquetadas e inserte la diapositiva de la cámara en el soporte de escenario del microscopio.
  4. Establezca los parámetros de adquisición de imágenes PALM.
    1. Seleccione 1.57 N.A. 100x objetivo de petróleo para la adquisición.
    2. Seleccione el modo PALM y active la configuración de TIRF.
    3. Ajuste el número de fotogramas que se van a adquirir. Por lo general, 5,000-10, 000 tramas son suficientes para obtener resultados óptimos. Sin embargo, el número de fotogramas adquiridos depende en gran medida de la eficiencia de etiquetado y la capacidad de parpadeo del tinte fluorescente y puede ser ajustado por el usuario.
    4. Establezca la potencia del láser UV en 0.1% y 647 láser a 0.2%.
    5. Establezca el nivel de ganancia en 50-100.
    6. Encienda la iluminación láser y seleccione una celda de destino. El nivel de ganancia se puede aumentar si la intensidad de la señal es baja (dependiendo del etiquetado de fluorescencia).
    7. Apague la iluminación láser
  5. Adquisición de imágenes PALM
    1. Reduzca la ganancia a 0 y aumente la potencia del láser (ex 647) al 100%.
    2. Blanquee la celda de destino durante 5 s.
    3. Aumente la ganancia a 50 e inicie la adquisición de imágenes PALM.
      NOTA: La ganancia debe ajustarse para obtener suficiente intensidad de señal, mientras que se deben evitar los píxeles sobresaturados. Si la intensidad de la señal se reduce, aumente el nivel de ganancia.
  6. Opcionalmente, mejorar constantemente la potencia del láser UV (0,1%-10%) para aumentar la intensidad de la señal y promover el parpadeo del fluoróforo.

7. Reconstrucción de los datos de PALM

  1. Abra el software Image J e importe los datos PALM.
  2. Abra Thunderstorm Plugin y "Ejecutar análisis"
    1. En el menú"Configuración de la cámara"introduzca el tamaño de píxel y la ganancia em.
      NOTA: Cuando se utilizan objetivos de 100x y lente de aumento de 1,6x, el tamaño de píxel de 100 nm es adecuado. Sin embargo, dado que el tamaño del píxel depende de las características de hardware del microscopio y la cámara utilizadas para las imágenes PALM, los usuarios deben comprobar y adaptar cuidadosamente este parámetro. Los valores de ganancia EM se pueden obtener de los metadatos.
    2. En el"Menú de análisis de ejecución"establecer parámetros de la siguiente manera: orden B-spline: 3, escala B-spline: 2.0, umbral de intensidad máxima: stf (Wave.F1), radio de ajuste: 3, sigma inicial: 1.6, ampliación: 5.0, frecuencia de actualización: 50, desplazamientos laterales: 2. Confirme haciendo clic en el botón "Ok".
  3. Postprocesamiento de la imagen PALM reconstruida
    1. En el menú "Histograma de trazado" seleccione el parámetro "Sigma".
    2. Utilice la herramienta"Rectángulo"para seleccionar un ROI, excluyendo posibles artefactos y aplicar ROI al filtro. Los valores de ROI aparecerán en el cuadro de comando de filtro.
    3. Agregue "& uncertainty <25" a los valores de ROI. Un posible comando de filtro tendrá este aspecto: "(sigma > 48.6821 & sigma < 1117.40) & uncertainty <25". Aplique los valores de sigma seleccionados.
    4. En el menú"Eliminar duplicados",introduzca un umbral de distancia de "10 nm" y aplique.
    5. En el"Menú de fusión",establezca la distancia máxima en "20", los fotogramas máximos por molécula en "0" y los fotogramas máximos apagados en "1". Aplique la configuración.
    6. En el"Menú de corrección de deriva",seleccione correlación cruzada y establezca "Número de bins" en "5" y"Ampliación"en "5.0". Aplique ajustes de corrección de deriva.
    7. Guarde la imagen PALM final y exporte los datos posteriores a los procesados si lo desea.

8. Análisis de filamentos de sarcomere

  1. Análisis de la longitud del sarcomere
    1. Abra el software Image J e importe la imagen PALM reconstruida.
    2. Dibuje una línea entre las estructuras de sarcomer seleccionadas perpendiculares al disco z para medir la distancia más corta entre los filamentos de actinina.
    3. Seleccione "Trazar perfil" en el menú "Analizar" y adquirir la longitud entre dos picos. Dado que la longitud del sarcomere puede variar dentro de una célula, se debe medir un mínimo de 20 sarcomeres en diferentes áreas de la célula objetivo.
  2. Análisis del espesor de z-Disc
    1. Abra el software Image J e importe la imagen PALM reconstruida.
    2. Convierta la imagen PALM reconstruida en una imagen en modo de 8 bits.
    3. Abra el plugin de detección de crestas e introduzca los siguientes parámetros: ancho de línea: 20, alto contraste: 230, contraste bajo: 10, sigma: 0.79, umbral inferior: 25.84, longitud mínima de línea: 20.
    4. Establezca "Anchura de estimación", "Extender línea"y "Mostrar resultados".
    5. Haga clic en "Aceptar"y utilice "Ancho de línea medio" de la tabla de resultados para análisis adicionales.

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Resultados

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Para estimar el grado de maduración estructural de CM, neonatal, adulto completamente maduro, y iPSC CM fueron etiquetados inicialmente el CM con anticuerpos α-actinin para visualizar la red de sarcomere. Después de la adquisición de PALM, se reconstruyeron imágenes y se midió el grosor del disco z utilizando un software de procesamiento de imágenes basado en plugins para la detección automática del ancho de los filamentos individuales. La longitud de los sarcomeres se calculó midiendo la distancia entre dos picos de int...

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Discusión

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La generación de CM in vitro funcional derivada de iPSC es importante para las terapias regenerativas, el modelado de enfermedades y el desarrollo de plataformas de detección de fármacos. Sin embargo, la madurez insuficiente de estos CM es un obstáculo importante en la investigación cardiovascular20. En este sentido, se necesitan técnicas de imagen de alta resolución que permitan supervisar el estado de maduración estructural de la CM derivada de iPSC. Al mismo tiempo, la microscopía de superrescí...

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Divulgaciones

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Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio contó con el apoyo del Fondo Estructural de la UE (FSE/14-BM-A55-0024/18). Además, H.L. cuenta con el apoyo del Programa FORUN del Centro Médico de la Universidad de Rostock (889001 y 889003) y la Fundación Josef y Klinz (T319/29737/2017). C.I.L. es apoyado por el Programa Científico Clínico del Centro Médico de la Universidad de Rostock. R.D cuenta con el apoyo de la DFG (DA1296/6-1), la fundación DAMP, la Fundación Alemana del Corazón (F/01/12) y la BMBF (VIP+ 00240).

Agradecemos a Madeleine Bartsch por su apoyo técnico en el cultivo celular iPSC y la diferenciación cardíaca.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
línea celular iPSC humanaTakaraY00325
µ-Slide 8 Pocillos Fondo de Vidrio ibidi80827
0.5ml Tubo EppendorfEppendorf 30121023
Albúmina sérica bovinaSigma AldrichA906
Kit de disociación de cardiomiocitosTecnologías de células madre05025
CatalasaSigma AldrichC40-1G
CiclooctatetraenoSigma Aldrich138924-1G
CisteaminaSigma Aldrich30070-10g
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin Ca2+ y Mg2+Thermo Fisher14190169
F(ab')2-Cabra anti-ratón IgG Alexa Fluor 647Thermo FisherA-21237
Software de procesamiento de imágenes de Fiji (Imagen J)
GlucosaCarl RothX997.2
Ácido clorhídricoSigma AldrichH1758
LSM 780 ELYRA PS.1Sistema Zeiss
Paraformaldehído Merck8187150100
Piranosa oxidasaSigma AldrichP4234-250UN
anticuerpo sarcomérico &alfa;-actinina [EA-53]Abcamab9465
Cloruro de sodioSigma AldrichS7653
agua estérilCarl Roth3255.1
Triton X-100Sigma AldrichX100
Trizma baseSigma AldrichT1503
β-MercaptoetanolSigma Aldrich63689

Referencias

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Alpha Actinin NetworkPhotoactivated Localization MicroscopySarcomere Length AnalysisZ Disc Thickness MeasurementCardiomyocyte Maturation AssessmentSuper Resolution ImagingPALM Image ReconstructionFluorescent Molecule Localization

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