Investigación de la función del gen diana en un modelo de colitis inducida por anticuerpos agonísticos CD40 utilizando tecnologías basadas en CRISPR/Cas9

Resumen

Aquí, describimos la metodología para eliminar un gen de interés en el sistema inmune utilizando tecnologías basadas en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR)/endonucleasa asociada a CRISPR (Cas9) y la evaluación de estos ratones en un modelo de colitis inducida por anticuerpos agonísticos de grupo de diferenciación 40 (CD40).

Resumen

El sistema inmunitario funciona para defender a los seres humanos contra invasores extraños, como bacterias y virus. Sin embargo, los trastornos del sistema inmunitario pueden provocar autoinmunidad, enfermedades inflamatorias y cáncer. Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII), la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU), son enfermedades crónicas caracterizadas por una inflamación intestinal recurrente. Aunque la EII es más prevalente en los países occidentales (1 de cada 1.000), las tasas de incidentes están aumentando en todo el mundo. A través de estudios de asociación, los investigadores han relacionado cientos de genes con la patología de la EII. Sin embargo, la elaborada patología detrás de la EII y el alto número de genes potenciales plantean desafíos significativos para encontrar las mejores dianas terapéuticas. Además, las herramientas necesarias para caracterizar funcionalmente cada asociación genética introducen muchos factores limitantes de la tasa, como la generación de ratones modificados genéticamente para cada gen. Para investigar el potencial terapéutico de los genes diana, se ha desarrollado un sistema modelo que utiliza tecnologías basadas en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR)/endonucleasas asociadas a CRISPR (Cas9) y un grupo de anticuerpos agonísticos de diferenciación 40 (CD40). El presente estudio muestra que la edición mediada por CRISPR/Cas9 en el sistema inmune se puede utilizar para investigar el impacto de los genes in vivo. Limitado al compartimento hematopoyético, este enfoque edita de forma fiable el sistema inmunitario reconstituido resultante. Los ratones editados con CRISPR/Cas9 se generan más rápido y son mucho menos costosos que los ratones modificados genéticamente tradicionales. Además, la edición CRISPR/Cas9 de ratones tiene ventajas científicas significativas en comparación con la generación y cría de ratones modificados genéticamente, como la capacidad de evaluar objetivos que son embrionariamente letales. Utilizando CD40 como diana modelo en el modelo de colitis inducida por anticuerpos agonísticos CD40, este estudio demuestra la viabilidad de este enfoque.

Introducción

Las enfermedades autoinmunes se refieren a afecciones en las que el sistema inmunitario de un paciente ataca sus propias células y órganos, lo que provoca inflamación crónica y daño tisular. Hasta la fecha se han descrito cerca de 100 tipos diferentes de enfermedades autoinmunes, que afectan al 3-5% de^{la población humana}. Muchas de las enfermedades autoinmunes, como el lupus eritematoso sistémico y la EII, carecen de tratamientos eficaces y presentan importantes necesidades médicas insatisfechas. La EII, que actualmente afecta a alrededor de 1,5 millones de personas solo en los EE. UU., es una enfermedad devastadora caracterizada por una inflamación intestinal progresiva, persistente y recurrente sin cura disponible. Es necesario desentrañar la patogénesis y la fisiopatología subyacentes para ofrecer las nuevas estrategias de tratamiento y prevención que requieren los pacientes con EII ^2,3.

Se han identificado más de 230 loci diferentes de EII a través de análisis de asociación de genoma completo (GWAS)⁴. Aunque estas asociaciones han dilucidado nuevos genes que son potencialmente actores importantes en los mecanismos y vías clave de la EII, solo se han estudiado unos pocos genes de estos loci . Algunos genes han sido implicados en vías específicas. Por ejemplo, la vía de detección de microbios se ha relacionado con la proteína 2 que contiene el dominio de oligomerización de unión a nucleótidos (NOD2); la vía de la autofagia se ha relacionado con la autofagia 16 como 1 (ATG16L1), la familia M de GTPasa relacionada con la inmunidad y el miembro de la familia 9 del dominio de reclutamiento de caspasas (CARD9); y la vía proinflamatoria se ha relacionado con las respuestas de las células T impulsadas por la interleucina (IL)-23⁴. Se han utilizado varios modelos de ratón in vivo para caracterizar funcionalmente los genes identificados a través de GWAS ^5,6.

Uno de los modelos clave utilizados para estudiar la patogénesis de la EII ^7,8 es el modelo CD40 de colitis, que induce una inflamación intestinal inmunitaria innata tras la inyección de un anticuerpo agonístico CD40 en ratones inmunodeficientes (células T y B). Utilizado principalmente para examinar la contribución de la inmunidad innata al desarrollo de la EII, principalmente macrófagos y células dendríticas⁹, no está claro si la enfermedad puede ser inducida en ratones de tipo salvaje (WT) totalmente inmunocompetentes. Además de los modelos animales, también se requieren herramientas específicas de genes para la caracterización funcional de un gen, incluidos los compuestos químicos y los productos biológicos. Más importante aún, los animales genéticamente modificados son esenciales para revelar la función de un gen específico. Sin embargo, las estrategias que se suelen utilizar para fabricar ratones modificados genéticamente (inyección de embriones y cría) suelen tardar más de un año e incurren en un coste financiero significativo. Este proceso de limitación de la tasa presenta un desafío significativo en la búsqueda de dilucidar las funciones de los genes relacionados con la EII identificados por GWAS.

El protocolo presentado aquí proporciona una alternativa viable a la cría de ratones modificados genéticamente. En primer lugar, como se muestra en el esquema de la Figura 1 , las células de linaje negativo, antígeno 1 de células madre, receptor de tirosina quinasa Kit positivo (linaje-Sca1+c-Kit+ o LSK) se aíslan de la médula ósea de ratones Cas9 knockin (KI) portadores de un alelo específico (CD45.2) para permitir el seguimiento de las células inmunitarias del donante. A continuación, estas células se exponen a lentivirus que contienen diferentes ARN guía (ARNg) y un marcador fluorescente, la proteína fluorescente verde excitada por violeta (VexGFP), para permitir el seguimiento de las células transducidas. Dos días después, las células VexGFP+ se clasifican y se inyectan en ratones Ly5.1 Pep Boy receptores irradiados letalmente, que son ratones C57Bl/6 que portan el alelo CD45.1 para permitir el seguimiento de las células inmunitarias receptoras. Doce semanas después, el sistema inmunitario está completamente reconstituido y los ratones pueden ser inscritos en modelos in vivo.

Además del beneficio del ahorro de costes y de un tiempo de generación más rápido en comparación con la generación y cría de animales modificados genéticamente, esta metodología es ideal para objetivos que son embrionariamente letales, ya que se dirige específicamente al compartimento hematopoyético. Además, para objetivos en los que no se dispone de herramientas, como un anticuerpo, este sistema proporciona un enfoque factible. En resumen, para abordar los desafíos descritos hasta ahora, se desarrolló una plataforma de edición genómica in vivo basada en CRISPR/Cas9 para generar de manera expedita modelos animales modificados genéticamente 10,11,12,13,14. Este estudio demuestra que la inflamación intestinal en ratones WT C57Bl/6 puede ser inducida por un anticuerpo agonista CD40. CD40 es un regulador clave de la enfermedad en este modelo y, por lo tanto, se utilizó como objetivo modelo para validar la eliminación y la pérdida de la función génica basadas en CRISPR/Cas9.

Protocolo

Todos los experimentos con animales que se realicen siguiendo este protocolo deben ser aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) respectivo. Todos los procedimientos descritos aquí fueron aprobados por AbbVie IACUC.

1. Generación de lentivirus necesarios y adquisición de animales donantes y receptores

NOTA: La Tabla de Materiales incluye detalles de la fuente y el número de pedido para todos los animales, instrumentos y reactivos utilizados en este protocolo.

1. Construya los plásmidos utilizando un vector lentiGuide-puro modificado a VexGFP o mCherry.
   1. Clone el ARNg no dirigido codificado (SgNone) o el ARNg dirigido a CD40 en el vector modificado.
      NOTA: En este estudio, las secuencias para cada ARNg fueron las siguientes: SgNone, CTATGATTGCAACTGTGCAG; SgCD40.1, AGCGAATCTCCCTGTTCCAC; SgCD40.2, GACAAACAGTACCTCCACGA; y SgCD40.3, ACGTAACACACTGCCCTAGA.
   2. Producen las partículas lentivirales como se describió anteriormente¹⁵.
      1. Co-transfecte los plásmidos que codifican el ARNg en células 293T con plásmidos de empaquetamiento VSV-G y pLEX.
      2. Cambie el medio de cultivo después de 18 h de la transfección y recoja los sobrenadantes que contienen el virus después de 24-48 h después del cambio de medio.
      3. Para evaluar la eficiencia del ARNg CD40, genere una línea celular 293T estable a CD40 mediante la transfección de un plásmido pcDNA3.1 que codifica para CD40.
   3. Transfectar las células utilizando los lentivirus descritos y evaluarlas mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) dos semanas después.
      NOTA: Se utilizaron ratones Cas9 KI como ratones donantes. Asegúrese de que los ratones Cas9 KI estén en un fondo C57Bl/6 (y que expresen el alelo CD45.2) cuando utilicen ratones C57Bl/6-Ly5.1 Pep Boy (que expresan el alelo CD45.1) como receptores, de modo que se evite la EICH y se realice un seguimiento de las células donantes y receptoras.
2. Diseña el experimento. Para la eliminación de genes (KO), use de 3 a 6 ARNg por gen. Por cada ARNg, prepare un 20% de ratones receptores adicionales para tener en cuenta la pérdida de animales durante y después del trasplante.
   NOTA: El modelo de colitis inducida por anticuerpos agonísticos CD40 requiere un mínimo de 8 ratones por grupo para la alimentación estadística. Por lo tanto, se prepararon 10 ratones por ARNg en este estudio. El número de ratones necesarios para otros modelos in vivo variará en función del modelo utilizado.
3. Utilice ratones donantes y receptores del mismo sexo que tengan entre 8 y 12 semanas de edad.
   NOTA: Los ratones fueron sacrificados bajo las pautas aprobadas por la IACUC utilizando un mínimo de 5% de isoflurano y se confirmó con dislocación cervical como método secundario.

2. Recolección de médula ósea y preparación para la clasificación celular

1. Con pinzas y tijeras, extraiga huesos de cada ratón donante (fémur, tibia, húmero y cúbito), extrayendo con cuidado la mayor cantidad de músculo/tejido posible.
2. Perfore la parte inferior de un tubo de microcentrífuga de 0,6 ml con una aguja de 23 g y coloque el tubo dentro de un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Haz 2 juegos por animal.
3. Corte un extremo de los huesos y coloque de 4 a 8 huesos dentro del tubo de microcentrífuga con los extremos abiertos hacia el orificio de la aguja de 23 G.
   NOTA: El número de huesos por tubo depende del hueso, por ejemplo, caben 8 tibias, húmeros y cúbitos o 4 fémures.
4. Centrifugar los tubos (con el tubo de microcentrífuga de 0,6 mL que contiene los huesos dentro del tubo de centrífuga de 1,5 mL) a 300 × g durante 2 min a temperatura ambiente (RT).
5. Deseche el tubo de microcentrífuga de 0,6 mL, que ahora contiene huesos sin médula, dejando solo el tubo de centrífuga de 1,5 mL lleno de médula. Agregue 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (que contiene cloruro de amonio) a cada tubo de centrífuga y vuelva a suspender el pellet de celda mediante pipeteo. Incubar en RT durante 1 min. Repita el paso de lisis si es necesario.
6. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 50 mL y agregue la solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco sin calcio y magnesio (al menos el doble del volumen de la suspensión celular) para neutralizar el tampón de lisis. Pellets a 300 × g durante 5 min. Aspire el sobrenadante por completo.
7. Cargue un filtro de 70 μm en un tubo cónico de 50 ml y filtre las celdas a través de él, utilizando DPBS para lavar el tubo y el filtro. Deseche el filtro y cuente las celdas.
   NOTA: El uso de 30 ratones donantes (12 semanas de edad) producirá 200-300 × 10⁶ células en promedio.

3. Clasificación de células para aislar células LSK para la transducción

1. Vuelva a suspender las células contadas en el paso 2.7 en el tampón de clasificación magnética de células (MACS) (DPBS, 2 mM de ácido etilendiamina tetraacético, 0,5% de albúmina sérica bovina, 10 μg/mL de penicilina-estreptomicina) en el volumen deseado (90 μL por 10⁷ células).
2. Agregue 10 μL de perlas CD117+ por cada 10⁷ celdas. Mezclar bien, proteger de la luz e incubar a 4 °C durante 15 min.
3. Prepare la columna MACS LS colocando la columna en el campo magnético y enjuagándola con tampón MACS.
4. Lave las células del paso 3.2 con un volumen adecuado de tampón MACS (al menos el doble de su volumen) y centrifugue a 300 × g durante 10 minutos.
5. Aspire el sobrenadante por completo. Vuelva a suspender el pellet para que la concentración final sea de 10^{a 8} celdas en 500 μL de tampón MACS.
6. Aplique la suspensión de celdas en la columna LS. Lavar 3 veces con 3 mL de tampón MACS.
   NOTA: Una columna LS puede contener hasta 10⁸ celdas etiquetadas y 2 × 10⁹ celdas en total.
7. Retire la columna del separador magnético y colóquela en un tubo de recolección adecuado. Agregue 5 mL de tampón MACS e inmediatamente enjuague las celdas marcadas magnéticamente empujando firmemente el émbolo en la columna.
8. Granular las células a 300 × g durante 10 min. Aspire el sobrenadante por completo.
9. Vuelva a suspender las células en 100 μL de tampón MACS por cada 10⁷ células y agregue los anticuerpos de tinción para el linaje (CD3, B220, Ter119, Gr-1, CD11b) y Sca-1.
   NOTA: El uso de 30 ratones donantes (12 semanas de edad) producirá 100-180 × 10⁶ células en promedio.
10. Mezclar bien, proteger de la luz e incubar a 4 °C durante 20 min.
11. Lave las células añadiendo 5-10 mL de tampón MACS y centrifugue a 300 × g durante 10 min. Aspire el sobrenadante por completo.
12. Vuelva a suspender hasta 10⁸ celdas en 500 μL de tampón MACS
13. Filtre las células con un filtro de células de 70 μm y realice FACS para la población de linaje Sca1+.
    NOTA: Aproximadamente el 1,8-2,6% de la población debe ser de linaje-Sca1+.
14. Recoja las células en un medio de cultivo LSK (100 μL por 10.000 células): medio de expansión sin suero, 100 ng/mL de trombopoietina, factor de células madre de ratón, ligando de tirosina quinasa 3 relacionado con Fms e IL-7 con 100 μg/mL de penicilina-estreptomicina.
15. Células de pellets a 300 × g durante 10 min. Aspire el sobrenadante por completo.

4. Transducción y cultivo de LSK para generar células de control y knockout

1. Resuspender las células en el medio de cultivo LSK.
2. Siembre 10.000 células por pocillo en placas de cultivo de tejidos (TC) de fondo plano de 96 pocillos en medio de cultivo LSK.
3. Incubar durante la noche a 37 °C con 5% de CO₂ y 95% de humedad en condiciones asépticas.
4. Prepare 50 μg/mL de solución de retronectina en DPBS y agregue 300 μL a cada pocillo de una placa de poliestireno de 24 pocillos no tratada con TC. Incubar durante la noche a 4 °C.
5. Al día siguiente, deseche la solución de retronectina, enjuague la placa recubierta con 300 μL de DPBS y repita.
6. Transfiera 50.000 células LSK en 500 μL de medio (5 pocillos de la placa de 96 pocillos en el paso 4.2) a cada pocillo recubierto de retronectina de la placa de poliestireno de 24 pocillos del paso 4.4.Utilice 100 μL adicionales de medio LSK por cada 5 pocillos para enjuagar y recoger las células adicionales que queden en la placa de 96 pocillos. Asegúrese de que 600 μL sea el volumen por pocillo en la placa de 24 pocillos después de este paso (5 × 100 μL de pocillos de la placa de 96 pocillos + 100 μL utilizados para lavar esos 5 pocillos).
   NOTA: Después de la transferencia, observe bajo un microscopio la placa de 24 pocillos ahora vacía para confirmar que se recolectaron todas las células. Utilice el medio LSK para recolectar las células que no se transfirieron para minimizar la pérdida de células de esta pequeña población.
7. Agregue 300 μL de sobrenadante de virus a cada pocillo y agite la placa a un valor de ajuste de 500 durante 5 min. Girar la placa a 600 × g y 37 °C durante 20 min. Use al menos 5 × 10⁶ partículas virales por ml.
   NOTA: En este estudio, se utilizó un vector modificado de pLentiPuro, en el que el elemento de resistencia a puromicina se intercambió por VexGFP. El virus se añadió a una multiplicidad de infecciones de 50-100.
8. Incubar durante 1 h. Añadir 500 μL de medio LSK precalentado.
9. Incubar durante 2 días a 37 °C con 5% de CO₂ y 95% de humedad en condiciones asépticas.

5. Irradiación animal para preparar el injerto de células madre de un donante

1. Después de 2 días de incubación, irradiar a los animales receptores con 475 cGy dos veces en un intervalo de 4 h. Después de la segunda ronda de irradiación, coloque a los animales en jaulas esterilizadas en autoclave y trátelos como animales inmunodeficientes durante 12 semanas. Los ratones recibieron enriquecimiento, hidrogel y monitoreo en el lado de la jaula para brindar atención de apoyo e intervención según fuera necesario. Los ratones pueden recibir antibióticos, alimentos o agua, además de cuidados de apoyo y métodos de intervención.
   NOTA. Las dosis de irradiación pueden diferir según los diferentes irradiadores. Realice una valoración de la dosis del irradiador para identificar la mejor dosis. Se ha encontrado que dosis entre 700 y 1300 cGy para ratones C57Bl/6 son efectivas en varios ejemplos de literatura¹⁷. Seleccione 3-4 dosis en este rango y evalúe 5 ratones por dosis para determinar la supervivencia y el injerto. Si el injerto no tiene éxito o la dosis de radiación es demasiado alta, los ratones no vivirán más de 3 semanas después del injerto. A las 4 semanas después del injerto, se sangró a los ratones supervivientes para evaluar el injerto por FACS. Realizamos colectas de sangre retroorbitales (RO) de ~50-100 μL por ratón para evaluar el injerto. Los ratones estuvieron bajo anestesia (isoflurano al 2-3%) durante la recolección y recibieron lubricante ocular y 1,0 mL de solución salina subcutánea como cuidados de apoyo después de las recolecciones de sangre por ósmosis inversa.

6. Preparación celular e inyección en animales receptores irradiados

1. Pipetear las células de cada pocillo del paso 4.9, manteniendo los grupos separados ahora que las células se han transducido con diferentes ARNg, y granularlas a 300 × g durante 10 minutos.
2. Vuelva a suspender las células en el búfer MACS, filtre con un filtro de 70 μm y clasifique la población de VexGFP+.
   NOTA: Aproximadamente el 10-15% de las celdas deben ser VexGFP+.
3. Granular las células a 300 × g durante 10 min. Vuelva a suspenderlos en la solución salina equilibrada de Hank: 5.000 o más células por ratón en 200 μL.
   NOTA: HBSS es de grado no farmacéutico. También puede considerar el uso de una solución salina estéril de grado farmacéutico para la inyección.
4. Inyectar las células por vía intravenosa 3 h después de la última dosis de irradiación.
   NOTA: Doce semanas después, los ratones tendrán un sistema inmunitario completamente injertado y podrán ser inscritos en modelos in vivo.

7. Modelo de colitis inducida por anticuerpos agonísticos CD40 en ratones de tipo salvaje

NOTA: Pesar y evaluar a los animales diariamente. Proporcionar atención de apoyo según sea necesario: 1,0 ml de solución subcutánea de cloruro de sodio al 10% de pérdida de peso o si están deshidratados. El control positivo para este modelo es anti-p40 dosificado por vía intraperitoneal a 25 mg/kg dos veces por semana a partir del día -1.

NOTA: En este estudio, los grupos experimentales incluyeron grupos de control naïf, control vehículo (negativo) y grupo de control anti-p40 (positivo). Juntos, estos grupos controlan el comportamiento normal del modelo de colitis inducida por anticuerpos agonísticos CD40. Grupos Vector, SgNone y SgRNA: Los controles vectoriales para el vector lentiviral común, SgNone es un control guía codificado no dirigido, y los grupos SgRNA son los grupos de "tratamiento" que tienen una expresión reducida del ARNg diana.

1. Día 0: Inyectar el anticuerpo agonístico CD40 a 10 mg/kg por vía intraperitoneal en DPBS en todos los animales, excepto en el control no aviado.
2. Días 3 y 6: Realizar videoendoscopia para evaluar la progresión de la enfermedad como se ha descrito anteriormente¹⁶.
   1. Anestesiar a los ratones con isoflurano al 2-3%. Proporcionar soporte térmico a través del mecanismo de la máquina de anestesia interna y/o una almohadilla térmica externa durante la recuperación.
   2. Una vez que los ratones estén bajo anestesia, administre un enema DPBS (sin calcio y magnesio) para preparar el colon para la endoscopia.
      NOTA: Se requieren aproximadamente 1-2 mL para realizar un enema.
   3. Después de un enema y mientras está bajo anestesia, mueva el ratón al cono de la nariz de la máquina de anestesia.
   4. Inserte suavemente el endoscopio en el colon, avance lentamente hasta el colon proximal mientras mantiene la cámara centrada y el colon inflado con aire (utilizando la bomba de aire incluida o conectando un tubo/jeringa para inflar manualmente), luego retire lentamente el endoscopio y recoja un video e imágenes a 3 cm, 2 cm y 1 cm del ano.
      NOTA: Para minimizar la irritación del colon, se puede agregar lubricante estéril a la punta del endoscopio.
   5. Puntúe cada imagen individualmente en función del patrón vascular y el engrosamiento de la mucosa, como se describe en la Tabla 1. Combine las puntuaciones de las 3 imágenes por ratón para asignar una puntuación de suma a cada animal.
3. Día 7: Eutanasia a todos los ratones mediante sobredosis de isoflurano o cámara de CO₂ , y recolectar la mayor cantidad de sangre posible mediante punción cardíaca para suero. Pesar el bazo para medir la esplenomegalia y recolectar para la citometría de flujo, y recolectar el colon para la histopatología.
   NOTA: Se prepararon y utilizaron secciones de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina de colon de ratón para la inmunohistoquímica (IHQ) como se describió previamente por Wang et al¹⁹.

Resultados

Siguiendo el procedimiento descrito anteriormente, se generaron ratones que expresaban ARNg dirigido a CD40. En la semana 2, se injertaron células B, macrófagos CD11b+ y células dendríticas (CD) CD11c+ (Figura 2). Sin embargo, las células T, como se esperaba en base a la literatura previa¹⁸, tardaron más en injertarse completamente y requirieron 12 semanas después del injerto para alcanzar ~90% (Figura 2)....

Discusión

Los resultados mostrados aquí introducen una nueva plataforma de edición del genoma basada en CRISPR/Cas9 capaz de investigar la función génica en este modelo de colitis inducida por anticuerpos agonísticos CD40. La clasificación celular enriqueció el grupo de células LSK modificadas genéticamente, lo que resultó en una reducción de más del 90% en la expresión de CD40 dentro de los animales reconstituidos, en solo 4 meses. Además, la reducción de la expresión de CD40 dentro del sistema i...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos	Corning/Costar	#3506
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR 2300/5/6
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)	Miltenyi Biotec	130-091-221
0.45 µ m unidad de filtro	Millipore	#SLHV013SL
0,6 mL microcentrífuga Tubo	Axygen	MCT-060-C-S
1,5 mL Tubo Eppendorf	Axygen	MCT-150-C-S
15mL Cónico	VWR	21008-918
23 g Aguja	VWR	#305145
24 pocillos Placas no TC	Falcon	#351147
Placas TC de 24 pocillos	Falcon	#353047
50 mL Tubo cónico	VWR	21008-951
Jeringa de 5 mL	BD Biosciences	#309647
70 µ m Filtro	Miltenyi	#130-098-462
Placas de fondo plano de 96 pocillos	Corning	#3599
Placas de fondo en U de 96 pocillos	Corning/Costar	#3365
Máquina de anestesia	VetEquip - COMPAC5	#901812
Anticuerpo monoclonal anti-CD40 agonista	BioXcell	BE-0016
Anticuerpo monoclonal anti-p40	BioXcell	BE-0051
B220 PE Anticuerpo	BioLegend	#103208
Albúmina sérica bovina	Sigma Aldrich	A7906-100G
Cas9 Knock-in Ratones	Jackson Labs	#026179	C57Bl/6 fondo
CD117+ Perlas	Miltenyi	#130-091-224
CD11b Anticuerpo PE	BioLegend	#101208
CD3 PE Anticuerpo	BD Biosciences	#553240
Centrífuga	Beckman Coulter	Allegra 6KR Centrífuga
mostrador	Centrífuga Eppendorf	5424
DPBS	ThermoFisher	#14190136
Dulbecco' s Medio Eagle modificado	Mediatech	#10-013-CV
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Invitrogen	AM9260G
Endoscopio	Karl Storz	N/A	Torre Coloview personalizado
Citómetro de flujo	BD Biosciences	FACS Aria II
Ligando 3 de tirosina quinasa relacionada con Fms (Flt-L)	PeproTech	#250-31L
Gr-1 Anticuerpo PE	BD Biosciences	#553128
Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)	ThermoFisher	#14170120
Suero bovino fetal inactivado por calor	HyClone	#SH30071.03
IL-7	PeproTech	#217-17
Aglutinante de incubadora		#9040-0116
Isoflurano	HenrySchein	#6679401710
LS Columna	Miltenyi	#130-042-041
Ly5.1 Ratones Pepboy	Jackson Labs	#002014	C57Bl/6 fondo
factor de células madre de ratón (mSCF)	PeproTech	#250-03
Cloruro de sodio (NaCl)	Hospira	#00409488850
OPTI-MEM medios sin suero	Invitrogen	#31985-070
Penicilina-estreptomicina (PenStrep)	ThermoFisher	#15140-122
Agitador de placas	ThermoFisher	#88880023
pLentiPuro	Addgene	#52963
Polybrene (10 µ g/µ L)	Sigma Aldrich	#TR-1003-G
Tampón de lisis de glóbulos rojos	eBioscience	#00-4333
Retronectin	Takarbio	#T100B
Sca-1 APC Anticuerpo	BioLegend	#108112
StemSpan	StemCell Technologies	#09600
Ter119 PE Anticuerpo	eBioscience	#12-5921
Trombopoyetina (TPO)	PeproTech	#315-14
Irradiador de rayos X	Precision X-Ray X-Rad	320