Tinciones histológicas con secciones de tejido flotante libre

Summary

La técnica de flotación libre permite a los investigadores realizar tinciones histológicas, incluida la inmunohistoquímica en secciones de tejido fijo para visualizar estructuras biológicas, tipo de célula y expresión y localización de proteínas. Esta es una técnica histoquímica eficiente y confiable que puede ser útil para investigar una multitud de tejidos, como el cerebro, el corazón y el hígado.

Abstract

La inmunohistoquímica es una técnica ampliamente utilizada para visualizar estructuras tisulares específicas, así como la expresión y localización de proteínas. Dos enfoques alternativos son ampliamente utilizados para manejar las secciones de tejido durante el procedimiento de tinción, un enfoque consiste en montar las secciones directamente en portaobjetos de vidrio, mientras que un segundo enfoque, el de flotación libre, permite mantener y teñir secciones fijas mientras están suspendidas en solución. Aunque los enfoques montados en diapositivas y flotantes libres pueden producir resultados similares, la técnica de flotación libre permite una mejor penetración de anticuerpos y, por lo tanto, debe ser el método de elección cuando se van a utilizar secciones más gruesas para la reconstrucción 3D de los tejidos, por ejemplo, cuando el enfoque del experimento es obtener información sobre proyecciones dendríticas y axonales en regiones cerebrales. Además, dado que las secciones se mantienen en solución, una sola alícuota puede acomodar fácilmente de 30 a 40 secciones, cuyo manejo es menos laborioso, particularmente en estudios biomédicos a gran escala. Aquí, ilustramos cómo aplicar el método de flotación libre a la tinción inmunohistoquímica fluorescente, con un enfoque principal en las secciones del cerebro. También discutiremos cómo la técnica de flotación libre puede modificarse fácilmente para adaptarse a las necesidades individuales de los investigadores y adaptarse a otros tejidos, así como a otras tinciones basadas en histoquímica, como hematoxilina y eosina y violeta de cresil, siempre que las muestras de tejido se fijen correctamente, generalmente con paraformaldehído o formalina.

Introduction

La inmunotinción es una práctica de investigación popular que comenzó hace 130 años con el descubrimiento de los anticuerpos séricos en 1890 por Von Behring¹. A principios del^siglo XX, los colorantes se unieron a antígenos y más tarde a anticuerpos como una forma de cuantificar y visualizar reacciones¹, y en 1941 Albert Coons desarrolló las primeras etiquetas de anticuerpos fluorescentes, un descubrimiento que revolucionó la microscopía de luz ^2,3. El término "inmunotinción" abarca muchas técnicas que han sido desarrolladas utilizando este principio, i....

Protocol

1. Preparación del tejido para criosección

1. Incruste tejidos fijos en un molde de incrustación apropiado (consulte la Tabla de materiales) para crear un bloque de muestra utilizando una matriz de muestra apropiada (consulte la Tabla de materiales) y congele en hielo seco. Almacene los bloques de muestras a -80 °C hasta que estén listos para seccionar.
   NOTA: Los tejidos fijos se preparan típicamente perfundiendo roedores machos o hembras adultos (aprox. 2,5 – 30 meses de edad) (ratón o rata)³⁴, de acuerdo con el permiso ético disponible, con un fijador apropiado (por ejemplo, formalina al 10%), segui....

Results

El esquema general del uso del método de flotación libre para realizar un ensayo inmunohistoquímico fluorescente se ilustra en la Figura 1. En la Figura 2 se muestra un ejemplo representativo de IHQ fluorescente utilizando el método de flotación libre en cerebro de ratón que examina la expresión de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) con un aumento menor y más alto para ilustrar la calidad general de la tinción. Este enfoque también es apropiado para revelar.......

Discussion

La inmunohistoquímica (IHC) es una técnica versátil que se ha vuelto crucial para identificar la expresión y localización de proteínas dentro de las secciones de tejido. Este ensayo se utiliza en toda la comunidad científica para comprender mejor las características del tejido a través de las etapas de la función normal a los estados de enfermedad. La IHQ se emplea en una variedad de campos, desde el diagnóstico clínico de enfermedades como el cáncer hasta los descubrimientos iniciales en la investigación preclínica

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placas de 12 pocillos	Corning	3513
Placas de 6 pocillos	Corning	3516
Esmalte de uñas transparente	Preferencia del usuario	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Moldes de incrustación	Thermo Scientific	1841
Etilenglicol	Preferencia del usuario	N/A
Solución de formalina	Fisher Scientific	SF98-4
Suero de caballo, inactivado por calor	Gibco	26050088
Cajas de portaobjetos para microscopio	Servicios de microscopía electrónica	71370
PBS	Preferencia del usuario	N/A
Anticuerpo primario	Preferencia del usuario	N/A
Cubreobjetos rectangulares	VWR	48393-081	24 x 50 mm
Plato de tinción rectangular	Servicios de microscopía electrónica	70312
Pincel artístico redondo #2	Princeton Select Series	3750R	La marca no es importante
Anticuerpo secundario	Preferencia del usuario	N/A
Matriz de muestras para incrustar	OCT Tissue-Tek, Sakura	4583
Bandeja de manchas – sistema de tinción de portaobjetos	Electrónica Microscopía Servicios	71396-B	Usar tapa oscura
Sacarosa	Preferencia del usuario	N/A
Superfrost Plus Micro Portaobjetos	VWR	48311-703
TBS Preferencia del	usuario	N/A Triton
X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield medio de montaje antidecoloración	Vector Laboratorios	H-1000	No endurecedor
Insertos de pocillos para placas de 12 pocillos	Corning Netwells	3477
Insertos de pocillos para placas de 6 pocillos	Corning Netwells	3479
Papel de filtro Whatman	Millapore-Sigma	WHA1440042