Aquí se informa un sistema para imágenes de calcio en Caenorhabditis elegans que se comportan libremente con vibración bien controlada y no localizada. Este sistema permite a los investigadores evocar vibraciones no localizadas con propiedades bien controladas a un desplazamiento a nanoescala y cuantificar las corrientes de calcio durante las respuestas de C. elegans a las vibraciones.
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Artículo de método
Imágenes de calcio en Caenorhabditis elegans de comportamiento libre con vibración no localizada y bien controlada
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Resumen
Resumen
Las fuerzas mecánicas no localizadas, como las vibraciones y las ondas acústicas, influyen en una amplia variedad de procesos biológicos desde el desarrollo hasta la homeostasis. Los animales hacen frente a estos estímulos modificando su comportamiento. Comprender los mecanismos subyacentes a dicha modificación del comportamiento requiere la cuantificación de la actividad neuronal durante el comportamiento de interés. Aquí, informamos un método para la obtención de imágenes de calcio en Caenorhabditis elegans de comportamiento libre con vibración no localizada de frecuencia, desplazamiento y duración específicos. Este método permite la producción de vibraciones bien controladas y no localizadas utilizando un transductor acústico y la cuantificación de las respuestas de calcio evocadas a resolución de una sola célula. Como prueba de principio, se demuestra la respuesta de calcio de una sola interneurona, AVA, durante la respuesta de escape de C. elegans a la vibración. Este sistema facilitará la comprensión de los mecanismos neuronales subyacentes a las respuestas conductuales a los estímulos mecánicos.
Introducción
Los animales suelen estar expuestos a estímulos mecánicos no localizados como vibraciones u ondas acústicas 1,2. Debido a que estos estímulos influyen en la homeostasis, el desarrollo y la reproducción, los animales deben modificar sus comportamientos para hacerles frente 3,4,5. Sin embargo, los circuitos neuronales y los mecanismos que subyacen a dicha modificación del comportamiento son poco conocidos.
El comportamiento mecanosensorial en el nematodo, Caenorhabditis elegans, es un paradigma conductual simple, en el que los gusanos generalmente cambian el comportamiento de un movimiento hacia adelante a una respuesta de escape hacia atrás cuando se encuentran con vibración no localizada6. El circuito neuronal subyacente a este comportamiento se compone principalmente de cinco neuronas sensoriales, cuatro pares de interneuronas y varios tipos de neuronas motoras 7,8. Además, los gusanos se habitúan a tales estímulos mecánicos después de un entrenamiento espaciado que implica estimulación repetida 9,10,11. Por lo tanto, esta respuesta conductual simple constituye un sistema ideal para investigar los mecanismos neuronales subyacentes tanto al comportamiento evocado por vibración no localizada como a la memoria. Se ilustra un protocolo para imágenes de calcio en gusanos que se comportan libremente bajo la influencia de vibraciones no localizadas. En comparación con los sistemas informados anteriormente, este sistema es simple en el sentido de que no requiere una cámara adicional para el seguimiento; sin embargo, nos permite cambiar la frecuencia, el desplazamiento y la duración de la vibración no localizada. Debido a que la activación de las interneuronas AVA induce la respuesta de escape hacia atrás, se utilizaron como ejemplo los gusanos que coexpresan GCaMP, un indicador de calcio, y TagRFP, una proteína fluorescente insensible al calcio, bajo el control de un promotor específico de AVA (ver Tabla de Materiales para más detalles). El protocolo demuestra la activación de las neuronas AVA a medida que un gusano cambia de movimiento hacia adelante hacia atrás. Este protocolo facilita la comprensión del mecanismo del circuito neuronal subyacente al comportamiento mecanosensorial.
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Protocolo
1. Cultivo de gusanos hasta la obtención de imágenes de calcio
- Cuatro días antes de un experimento de imágenes de calcio, transfiera dos gusanos ST12 adultos a una nueva placa de medio de crecimiento de nematodos (NGM) (Tabla de Materiales) en la que Escherichia coli OP50 se rayan en un patrón cuadrado (aproximadamente 4 mm x 4 mm) utilizando un esparcidor celular para que el gusano pase la mayor parte del tiempo en la bacteria durante las imágenes de calcio12.
- Incubar esta placa NGM durante 4 días a 20 °C en una incubadora (Tabla de Materiales).
2. Configuración de hardware
- Prepare un microscopio equipado con un dispositivo piezoeléctrico para la estimulación13, una lente de objetivo 2x, una cámara sCMOS de alta velocidad, óptica de división de imágenes, una etapa motorizada x-y, una fuente de luz LED para excitación y una computadora (Figura 1). Las especificaciones esenciales de la cámara sCMOS incluyen 2560 x 2160 píxeles activos, 6,5 μm de tamaño, con un enlace de cámara de 10 toques como opción de interfaz. Las especificaciones clave de la etapa motorizada X-Y incluyen un rango de recorrido de 110 mm x 75 mm, velocidad máxima de 250 mm / s, aceleración máxima de 2,000 mm / s2 y repetibilidad unidireccional de 0.25 μm.
- Encienda la computadora y el controlador de etapa motorizado x-y.
- Encienda el amplificador y ajuste el ajustador de volumen a 10 y los ajustadores de graves y agudos a 8.
- Para excitar GCaMP y TagRFP, encienda las luces de 488 nm y 560 nm de la fuente de luz LED. Ajuste los medidores de 470 nm y 550 nm de la cápsula de control en la fuente de luz al 5% para que la intensidad de la luz LED sea adecuada para la obtención de imágenes.
NOTA: A esta intensidad de LED, el fotoblanqueo de la fluorescencia GCaMP y TagRFP no ocurre durante la grabación.
3. Configuración de software para imágenes de calcio
- Descargue e instale tres paquetes de software en Windows: software de macros de mouse, software para controlar la propiedad de vibración, software para ejecutar software de seguimiento y software para análisis de datos (Tabla de materiales).
- Haga doble clic en el archivo de software de seguimiento.
- Presione el botón Ejecutar y espere 5 minutos para estabilizar el software (Figura 2A).
- Proporcione la información sobre el tiempo de exposición y el binning. El tiempo de exposición de 0.033 s con 2 x 2 binning garantiza una adquisición de imagen fluida (Figura 2B).
NOTA: Solo se muestra cada10ª imagen adquirida para reducir la carga de memoria. - Proporcione la información para la adquisición de imágenes (Figura 2C). Por ejemplo, cuando se graban 500 imágenes dos veces con un intervalo de 10 s, escriba 1.000 en el cuadro Total de imágenes, 500 en el cuadro Imágenes y 10 en el cuadro Intervalo (s).
- Active el botón Adquisición (Figura 2D).
- Divida la imagen de fluorescencia utilizando la óptica de división de imágenes y las dos imágenes (canal GCaMP, 500-525 nm (Figura 2E); El canal TagRFP, 584-676 nm (Figura 2F)) se proyecta en dos mitades de la cámara sCMOS. Calibrar las coordenadas de los canales GCaMP y TagRFP (Figura 2G). Guarde la configuración del software.
- Establezca el directorio para generar el archivo de datos (Figura 2H).
- Desactive el botón Adquisición (Figura 2D).
- Haga doble clic en el software del sistema de macros del ratón (Figura 3A) y establezca las propiedades de vibración (Figura 3B). Lea el archivo Assay.txt con el sistema de macros del mouse para que el cursor del mouse se controle en función de las coordenadas y la programación de ese archivo (Figura 3A). Establezca las coordenadas del cursor del ratón (cuadrados magenta en la Figura 3A) y espere el tiempo hasta la estimulación después de iniciar la grabación (magenta en la Figura 3A). Establezca los valores de frecuencia y amplitud en el software para el control de vibraciones (Figura 3B).
4. Preparación de gusanos para imágenes de calcio
- Transfiera un solo gusano que exprese tanto GCaMP como TagRFP de la placa incubada a una nueva placa NGM fresca en la que se haya rayado E. coli OP50.
- Conecte la placa NGM al transductor acústico piezoeléctrico con cinta adhesiva transparente (Figura 4). No presione la placa sobre el actuador porque esto altera la frecuencia de vibración.
5. Imágenes de calcio bajo el control de propiedades de vibración específicas
- Active el botón Adquisición (Figura 2D).
- Encuentra el gusano bajo luz brillante y luz de excitación (488 nm y 560 nm).
- Establezca el valor de zoom de la microscopía en 2,5x. El campo de visión es de 1,1 mm x 1,1 mm con una resolución de 2,6 μm/píxel.
- Apague la luz brillante y encienda el botón Homing (Figura 2I) para rastrear el punto fluorescente de un gusano. Este botón de localización inicia el movimiento de la etapa X-Y para mantener la región de máxima intensidad del gusano en el centro del campo de visión en la imagen TagRFP.
NOTA: En términos del promotor flp-18 , la intensidad fluorescente de las neuronas AVA es más fuerte y las de otras neuronas son débiles o no se detectan. Por lo tanto, el sistema de baja ampliación no es necesario para el seguimiento y el escenario se mueve a lo largo de la grabación. - Asegúrese de que los valores de las barras de intensidad de las figuras 2E y 2F sean aproximadamente 1.000. Si no lo están, ajuste los medidores de 470 nm y 550 nm de la cápsula de control en la fuente de luz.
- Pulse el botón Ejecutar en el sistema de macros del ratón para permitir el control del cursor del ratón de acuerdo con una programación descrita en la Figura 3A. Esto comienza a registrarse utilizando el software de seguimiento y estimula el software de genes de onda mientras rastrea el gusano.
- Compruebe si el archivo BMP de salida se ha creado correctamente.
6. Análisis de datos
- Cree una carpeta en el escritorio y asígnele el nombre CalciumImaging.
- Cree una carpeta dentro de la carpeta CalciumImaging y asígnele el nombre CIResult, para los archivos de resultados de salida.
- Haga doble clic en el archivo DualViewImaging.nb escrito en el software de análisis de datos para Windows.
- Inserte la ruta del archivo en la carpeta CIResult (por ejemplo, DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]) (Figura 5).
- Inserte la ruta del archivo en la carpeta, incluido el archivo BMP (por ejemplo, SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (Figura 5), en la que XXX indica el nombre de la carpeta, incluidos los archivos BMP.
- Presione las teclas Mayús y Retorno simultáneamente para iniciar un análisis automático. Este análisis utiliza el valor de una región de campo de visión de intensidad máxima en la imagen TagRFP (consulte la leyenda de la Figura 6 para obtener un procedimiento de cálculo detallado en el programa).
- Compruebe si los siguientes archivos de salida se han creado correctamente en la carpeta CIResult.
XXX-GCaMP.tif (archivo de imagen que ilustra los rastros de intensidades GCaMP para todas las imágenes)
XXX-GCaMP.xls (archivo de hoja de cálculo que enumera las intensidades GCaMP en todas las imágenes)
XXX-TagRFP.tif (archivo de imagen que ilustra rastros de intensidades de TagRFP para todas las imágenes)
XXX-TagRFP.xls (archivo de hoja de cálculo que enumera las intensidades de TagRFP en todas las imágenes)
XXX-Ratio.tif (archivo de imagen que ilustra los rastros del valor de la relación para todas las imágenes)
XXX-Ratio.xls (archivo de hoja de cálculo que enumera el valor de la relación en todas las imágenes)
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Resultados
Aquí, un gusano que expresa tanto GCaMP como TagRFP bajo el control del promotor específico de interneurona AVA se utiliza como ejemplo de imágenes de calcio en C. elegans que se comporta libremente. Los datos de los canales GCaMP y TagRFP se obtuvieron como una serie de imágenes, algunas de las cuales se muestran en la Figura 6 y como una película (Película suplementaria 1). También se cuantificó el desplazamiento de la placa de Petri inducido por nuestro sistema d...
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Discusión
En general, la cuantificación de la actividad neuronal requiere la introducción de una sonda y / o restricciones en el movimiento del cuerpo animal. Sin embargo, para los estudios del comportamiento mecanosensorial, la introducción invasiva de una sonda y las restricciones en sí mismas constituyen estímulos mecánicos. C. elegans proporciona un sistema para eludir estos problemas, porque sus características son transparentes y porque tiene un circuito neuronal simple y compacto que comprende solo 302 neuronas. Co...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al Centro de Genética Caenorhabditis por proporcionar las cepas utilizadas en este estudio. Esta publicación fue apoyada por JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific research (B) (Grant no. JP18H02483), sobre áreas innovadoras del proyecto "Science of Soft Robot" (Grant no. JP18H05474), el PRIME de la Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médico (número de subvención 19gm6110022h001), y la fundación Shimadzu.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Software de análisis de datos | |||
| DualViewImaging.nb | author | Para el análisis de los datos adquiridos | |
| Mathematica12 | Wolfram | Para ejecutar el software de análisis de datos DualViewImaging | |
| Escherichia coli y C. elegans cepas | |||
| E. coli OP50 | Centro de Genética de Caenorhabditis | OP50 | Alimento para C. elegans. Uracilo auxótrofo. E. coli B. |
| lite-1(ce314) cepa | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Mutante insensible |
| lite-1(ce314) cepa que expresa NLS-GCaMP-NLS y TagRFP bajo el control del autor del promotor especírico | AVA ST12 | lite-1(ce314) mutante que lleva los genes que expresan NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; señal de localización nuclear) y TagRFP bajo el control del flp-18 promotor como matrices extrachoromosomas | |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | Para cuantificar la frecuencia y el desplazamiento generados por el transductor acústico |
| Mouse | |||
| Assay.txt | Autor | Script para controlar temporalmente y especialmente el cursor del ratón en Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Software de descarga gratuita para controlar el cursor del ratón basado en un script |
| Nematodo placa de medios de crecimiento | |||
| Agar purificado, polvo | Nakarai tesque | 01162-15 | para preparación de placas NGM |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | Para la preparación de placas NGM |
| Cloruro de calcio | Wako | 036-00485 | Para la preparación de placas NGM |
| Colesterol Wako | 034-03002 | Para la preparación de placas NGM | |
| hidrogenofosfato di-Photassio | Nakarai tesque | 28727-95 | Para la preparación de placas NGM |
| Caldo LB, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | Para el cultivo de E. coli OP50 |
| Sulfato de magnesio anhidro | TGI | M1890 | Para la preparación de placas NGM |
| Dihidrogenofosfato de potasio | Nakarai tesque | 28720-65 | Para la preparación de placas NGM |
| Cloruro de sodio | Nakarai tesque | 31320-05 | Para la preparación de placas NGM |
| Placas de Petri (60 mm) | Nunc | 150270 | Para la preparación de placas NGM |
| Dispositivo de vibración no localizado | |||
| Amplificador | LEPY | LP-A7USB | Para la estimulación con vibración controlable |
| Transductor acústico | MinebeaMitsumi | LVC25 | Para la estimulación con vibración controlable |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Descarga gratuita de software para controlar la propiedad de vibración |
| no invasiva de imágenes de calcio | |||
| 2 canales de sobremesa 3fásico sin escobillas servocontrolador de CC | Thorlabs | BBD202 | Controlador compatible para etapas MLS203-1 |
| 479/585 nm Filtro de paso de banda de doble banda BrightLine | Semrock | FF01-479/585-25 | Para la adquisición de imágenes de dos canales (GCaMP y TagRFP) |
| Divisoror de haz dicroico de epifluorescencia estándar de doble borde BrightLine de 505/606 nm | Semrock | FF505/606-Di01-25x36 | Para la adquisición de imágenes de dos canales (GCaMP y TagRFP)Filtro de paso de |
| banda de banda BrightLine de 512/25 nm | Semrock | FF01-512/25-25 | Para la adquisición de imágenes de dos canales (GCaMP y TagRFP) |
| Filtro de paso de banda monobanda BrightLine de 630/92 nm | Semrock | FF01-630/92-25 | Para la adquisición de imágenes de dos canales (GCaMP y TagRFP) |
| Ordenador | Dell | Precision T7600 | Windows7 con CPU Intel Xeon ES-2630 y 8 GB de RAM |
| Etapa motorizada x-y de alta velocidad | Thorlabs | MLS203-1 | Etapa de escaneo XY rápida |
| Óptica de división de imágenes | Hamamatsu photonics | A12801-01 | Para la adquisición de imágenes de dos canales (GCaMP y TagRFP) generadas por W-VIEW GEMINI Óptica de división de imágenes |
| Fuente de luz LED | CoolLED | pE-4000 | Para generar luz de excitación de 470 nm y 560 nm |
| Microscopio | Cámara Olympus | MVX10 | |
| sCMOS | Andor | Zyla | |
| x 2 Objetivo | Olympus | MVPLAPO2XC | Distancia de trabajo 20 mm y numérico Apertura 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 autor de plásmido | pKDK66 | Marcador de coinyección | |
| pTAK83 autor de plásmido | pTAK83 | Plásmido para la expresión de TagRFP bajo el control de el promotor flp-18 | |
| pTAK144 autor de plásmido | pTAK144 | Plásmido para la expresión de NLS-GCaMP5G-NLS bajo el control de el flp-18 promotor | |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | autor | Archivo SubVi para el seguimiento de un punto fluorescente de un gusano a través del control de retroalimentación de la cámara sCMOS y la etapa motorizada x-y | |
| LabVIEW | Instrumentos | Para ejecutar el software de seguimiento | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | autor | Para el seguimiento de un punto fluorescente de un gusano a través del control de retroalimentación de la cámara sCMOS y la etapa motorizada x-y |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
