Derivación, expansión, criopreservación y caracterización de células endoteliales microvasculares cerebrales de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Sovannarath Pong; Paulo Lizano; Rakesh Karmacharya

doi:10.3791/61629

Artículo de método

Derivación, expansión, criopreservación y caracterización de células endoteliales microvasculares cerebrales de células madre pluripotentes inducidas por humanos

DOI:

10.3791/61629

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19 de noviembre de 2020

Sovannarath Pong¹^,²^,³ , Paulo Lizano¹^,²^,³^,⁴ , Rakesh Karmacharya¹^,³^,⁴^,⁵

¹Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, ²Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center, ³Chemical Biology and Therapeutic Science Program, Broad Institute of MIT and Harvard, ⁴Department of Psychiatry, Harvard Medical School, ⁵Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital

En este artículo

Resumen

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Este protocolo detalla un método adaptado para derivar, expandir y criopreservar las células endoteliales microvasculares cerebrales obtenidas diferenciando las células madre pluripotentes inducidas por humanos, y para estudiar las propiedades de la barrera hematoencefálica en un modelo ex vivo.

Resumen

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Las células endoteliales microvasculares cerebrales (BMECs) se pueden diferenciar de las células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) para desarrollar modelos celulares ex vivo para estudiar la función de barrera hematoencefálica (BBB). Este protocolo modificado proporciona pasos detallados para derivar, expandir y criopreservar BMECs de iPSCs humanos utilizando un donante y reactivos diferentes a los notificados en protocolos anteriores. Los iPSC se tratan con esencial 6 medios durante 4 días, seguido de 2 días de cultivo endotelial humano libre de suero medio complementado con factor de crecimiento fibroblasto básico, ácido retinoico, y suplemento B27. En el día 6, las células se sub-cultivan en una matriz de colágeno / fibronectina durante 2 días. La inmunocitoquímica se realiza en el día 8 para el análisis de marcadores BMEC utilizando CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 y SLC2A1. La hinchazón occidental se realiza para confirmar la expresión del marcador BMEC y la ausencia de SOX17, un marcador endodérmico. El potencial angiogénico se demuestra con un ensayo que brota. La resistencia eléctrica transdotelial (TEER) se mide utilizando electrodos de palillo y voltohmómetro a partir del día 7. La actividad del transportador Efflux para la subfamilia de casete de enlace ATP miembro B 1 y miembro C del cassette de unión ATP se mide utilizando un lector multiplaque en el día 8. La derivación exitosa de BMECs se confirma mediante la presencia de marcadores celulares relevantes, bajos niveles de SOX17, potencial angiogénico, actividad transportadora y valores TEER ~2000 Ω x cm^2. Los BMECs se expanden hasta el día 10 antes de pasar a placas de colágeno/fibronectina recién recubiertas o criopreservadas. Este protocolo demuestra que los BMECs derivados de iPSC se pueden ampliar y pasar al menos una vez. Sin embargo, se observaron valores TEER más bajos y una localización más pobre de los marcadores BMEC después de la criopreservación. BMECs se puede utilizar en experimentos de co-cultivo con otros tipos de células (neuronas, glia, pericitos), en modelos cerebrales tridimensionales (organ-chip e hidrogel), para la vascularización de organoides cerebrales, y para el estudio de la disfunción BBB en trastornos neuropsiquiátricos.

Introducción

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Función de barrera hematoencefálica
La barrera hematoencefálica (BBB) forma un límite que limita el movimiento de sustancias desde la sangre hasta el cerebro. El BBB se compone de células endoteliales microvasculares cerebrales (BMECs) que forman una monocapa que recubre la vasculatura. Los BMECs, junto con astrocitos, neuronas, pericitos, microglia y matriz extracelular, forman la unidad neurovascular. Los BMECs tienen una estructura paracelular estrictamente regulada que permite al BBB mantener una alta resistencia eléctrica transdotelial (TEER), que limita la difusión pasiva y sirve como indicador de la integridad de la barrera^....

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Protocolo

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Los iPSC humanos fueron reprogramados de los fibroblastos de donantes sanos utilizando un protocolo aprobado por las Juntas de Revisión Institucional del Hospital General de Massachusetts y el Hospital McLean, y caracterizados como descritos en estudios anteriores^44,⁴⁵^,⁴⁶.

NOTA: Brevemente, los fibroblastos fueron reprogramados a iPSC a través de la reprogramación genética basada en ARNM^47. Los iPSC se mantuvieron en el medio de células madre (SCM) (ver lista de materiales) y se almacenaron a una densidad de ~1.2 x 10^2<....

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Resultados

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Diferenciación BMEC
Algunos pasos críticos en este protocolo deben seguirse con precisión (Figura 1). E6 uso medio en el día 1 es importante, ya que se utiliza a menudo para derivar linaje neuroectoderm de iPSCs dentro de un período relativamente corto de tiempo que produce resultados reproducibles a través de múltiples líneas celulares^36. Otro paso importante es el día 4 de la diferenciación, donde el medio E6 debe cambiarse a hESFM con B27 diluid.......

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Discusión

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Modificaciones y solución de problemas

En este protocolo, hicimos algunas modificaciones en el uso de una matriz extracelular de uso común y medios de cultivo celular durante la culturing iPSC para la derivación de BMECs (Figura 1). Estos cambios no afectaron a la capacidad de derivar BMECS de iPSC humanos como se describe en el Protocolo Lippmann¹. Se utilizó una línea iPSC de un donante sano diferente para demostrar que e.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por un Premio R01MH113858 del Instituto Nacional de Investigación Biobehavioral de Salud Mental para Nuevos Científicos Innovadores (BRAINS) R01MH113858 (a R.K.), premio KL2 TR002542 (PL) de los Institutos Nacionales de Salud. un Premio del Instituto Nacional de Desarrollo Científico Clínico de Salud Mental K08MH086846 (a R.K.), una Beca de la Fundación R Baer Jr de Sídney (a P.L.) el Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (a R.K.), la Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (a R.K.), la Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (a R.K.), el Instituto de Células Madre de Harvard (a R.K.) y por Steve Willis y Elissa F....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo
2′,7′-diclorodihidrofluoresceína diacetato Sigma	Aldrich	D6883-50MG
Accutase	Sigma Aldrich	A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Burro anti-Ratón IgG	Life Technologies	A-21202
Alexa Fluor 555 Burro anti-Conejo IgG	Life Technologies	A-31572
B27 Suplemento	Thermo Fisher Scientific	17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Señalización de células mAb de ratón		3528S
CLDN5 (Claudin-5)	Thermo Fisher Scientific	35-2500
Colágeno IV de placenta humana	Sigma Aldrich	C5533-5mg
Corning 2 mL Vial criogénico de polipropileno roscado interno	Corning	8670
Corning Placas de cultivo celular de fondo plano Costar (6 pocillos)	Corning	353046
Corning Placas de cultivo celular de fondo plano Falcon (24 pocillos)	Placa de	353047
Corning Transwell con insertos de membrana de poliéster permeable (12 pocillos)	Correderas Corning	3460
Countess	Thermo Fisher Scientific	C10228
DMEM/F12 (sin rojo fenol)	Thermo Fisher Scientific
DMSO	Sigma Aldrich	D2438-50mL
Suero de burro	Sigma Aldrich	D9663-10ML
DPBS (+/+)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	14040-117
Voltímetro epitelial/ohmio (TEER) (EVOM2) STX2	World Precision Instruments	N/A
Essential 6 Medio (Thermo Fisher)	Thermo Fisher Scientific
Suero Fetal Bovino (FBS)	Sigma Aldrich	F2442
Fibronectina	Sigma Aldrich	F2006-2mg
Geltrex Factor de Crecimiento Reducido Libre de LDEV Matriz de Membrana Basal	Thermo Fisher Scientific	A1413202
Hanks' Balance Solución salina con calcio y magnesio	Thermo Fisher Scientific	24020-117
Hoechst 33342, triclorhidrato, trihidrato	Thermo Fisher Scientific	H3570
Medio libre de suero endotelial humano	Thermo Fisher Scientific	11111044
InCell Analyzer 6000	General Electric	N/A
Invitrogen Contador de células automatizado Countess	Thermo Fisher Scientific N	/A
MK-571	Sigma Aldrich	M7571-5MG
NutriStem	Stemgent	01-0005
Occludin	Thermo Fisher Scientific	33-1500
Paraformaldehído 16%Servicios de	microscopía electrónica	15710
Perkin Elmer Envision 2103 multiplaca Lector	Perkin Elmer	N/A
Recombinante Humano VEGF 165	Peprotech	100-20
Recombinante Humano FGF-básico (154 a.a.)	Peprotech	100-18B
Ácido retinoico	Sigma Aldrich	R2625-100MG
Rhodamine 123	Sigma Aldrich	83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1)	ThermoFisher	PA1-21041
SOX17	Señalización	81778S
TJP-1 (ZO-1)	ThermoFisher	PA5-28869
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-50ML
Tinte azul de tripán (0,4%) para usar con el contador de células automatizado Countess	Thermo Fisher Scientific	T10282
Valspodar (Sigma) (ciclosporina A)	Sigma Aldrich	SML0572-5MG
Versene solución	Thermo Fisher Scientific	15040066
Y-27632 diclorhidrato (inhibidor de ROCK)	Tocris/ Termo Fisher Scientific	1254

pocillos múltiples Corning A1413202A1516401 celular

Referencias

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Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
Smith, Q. R., Rapoport, S. I.

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Brain Microvascular Endothelial Cells Human Induced Pluripotent Stem Cells Blood Brain Barrier Endothelial Differentiation TEER Measurement Efflux Transporter Activity Immunocytochemistry Western Blotting Sprouting Assay Cryopreservation

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