Artículo de método

Derivación, expansión, criopreservación y caracterización de células endoteliales microvasculares cerebrales de células madre pluripotentes inducidas por humanos

DOI:

10.3791/61629

⸱

19 de noviembre de 2020

 ,  , 
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry, Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program, Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo detalla un método adaptado para derivar, expandir y criopreservar las células endoteliales microvasculares cerebrales obtenidas diferenciando las células madre pluripotentes inducidas por humanos, y para estudiar las propiedades de la barrera hematoencefálica en un modelo ex vivo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células endoteliales microvasculares cerebrales (BMECs) se pueden diferenciar de las células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) para desarrollar modelos celulares ex vivo para estudiar la función de barrera hematoencefálica (BBB). Este protocolo modificado proporciona pasos detallados para derivar, expandir y criopreservar BMECs de iPSCs humanos utilizando un donante y reactivos diferentes a los notificados en protocolos anteriores. Los iPSC se tratan con esencial 6 medios durante 4 días, seguido de 2 días de cultivo endotelial humano libre de suero medio complementado con factor de crecimiento fibroblasto básico, ácido retinoico, y suplemento B27. En el día 6, las células se sub-cultivan en una matriz de colágeno / fibronectina durante 2 días. La inmunocitoquímica se realiza en el día 8 para el análisis de marcadores BMEC utilizando CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 y SLC2A1. La hinchazón occidental se realiza para confirmar la expresión del marcador BMEC y la ausencia de SOX17, un marcador endodérmico. El potencial angiogénico se demuestra con un ensayo que brota. La resistencia eléctrica transdotelial (TEER) se mide utilizando electrodos de palillo y voltohmómetro a partir del día 7. La actividad del transportador Efflux para la subfamilia de casete de enlace ATP miembro B 1 y miembro C del cassette de unión ATP se mide utilizando un lector multiplaque en el día 8. La derivación exitosa de BMECs se confirma mediante la presencia de marcadores celulares relevantes, bajos niveles de SOX17, potencial angiogénico, actividad transportadora y valores TEER ~2000 Ω x cm2. Los BMECs se expanden hasta el día 10 antes de pasar a placas de colágeno/fibronectina recién recubiertas o criopreservadas. Este protocolo demuestra que los BMECs derivados de iPSC se pueden ampliar y pasar al menos una vez. Sin embargo, se observaron valores TEER más bajos y una localización más pobre de los marcadores BMEC después de la criopreservación. BMECs se puede utilizar en experimentos de co-cultivo con otros tipos de células (neuronas, glia, pericitos), en modelos cerebrales tridimensionales (organ-chip e hidrogel), para la vascularización de organoides cerebrales, y para el estudio de la disfunción BBB en trastornos neuropsiquiátricos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Función de barrera hematoencefálica
La barrera hematoencefálica (BBB) forma un límite que limita el movimiento de sustancias desde la sangre hasta el cerebro. El BBB se compone de células endoteliales microvasculares cerebrales (BMECs) que forman una monocapa que recubre la vasculatura. Los BMECs, junto con astrocitos, neuronas, pericitos, microglia y matriz extracelular, forman la unidad neurovascular. Los BMECs tienen una estructura paracelular estrictamente regulada que permite al BBB mantener una alta resistencia eléctrica transdotelial (TEER), que limita la difusión pasiva y sirve como indicador de la integridad de la barrera1,2. Los BMECs también tienen proteínas que ayudan con el movimiento transcelular como la endocitosis, la transcitosis y la transmigración, así como la extravasación de leucocitos durante una respuesta inmune3. Los BMECs dependen de la afluencia y los transportadores de eflujo para la alimentación y eliminación de productos de desecho, con el fin de mantener un equilibrio homeostatico en el cerebro3. Por ejemplo, solute carrier family 2 member 1 (SLC2A1) es un transportador de afluencia responsable del movimiento de glucosa a través del BBB4, mientras que los transportadores de efflux como el miembro B de casete de encuadernación ATP 1 (ABCB1) y el miembro C de la subfamilia de casete de unión ATP 1 (ABCC1) son responsables de devolver los sustratos de vuelta al torrente sanguíneo3,5,6,7. Los sustratos ABCB1 incluyen morfina, verapamil4,y antipsicóticos como olanzapina y risperidona8,mientras que el transportador ABCC1 tiene una variedad de sustratos incluyendo conjugados de sulfato, vincristina, y glucuronida conjuga4.

Aplicación de modelos BBB en trastornos psiquiátricos
La disfunción del BBB se ha implicado en una serie de trastornos neurológicos y psiquiátricos, incluyendo esquizofrenia y trastorno bipolar9,10. Recientemente, los modelos celulares ex vivo derivados de iPSC están siendo utilizados para interrogar los fundamentos celulares y moleculares de los trastornos psiquiátricos, pero estos modelos actualmente no tienen en cuenta el papel potencial desempeñado por la neurovasculatura11,12,13. Se presume que las citoquinas inflamatorias periféricas que circulan en la sangre pueden afectar negativamente al BBB14,15,16,17,pero también hay evidencia para paracelular18,19,20,21,22, transcelular23,24,25,26,27,28,29, y matriz extracelular20,29,30,31,32 anomalías que contribuyen a la disfunción BBB. La interrupción del BBB puede resultar en el contenido de la sangre que entra en el parénquima cerebral y la activación de astrocitos y/o microglia para liberar citoquinas proinflamatorias, que a su vez inician una respuesta inflamatoria33 que puede tener efectos perjudiciales en el cerebro34. Los BMECs son el componente principal del BBB y examinar la estructura y la función de estas células puede mejorar la comprensión de la disfunción del BBB en trastornos neurológicos y psiquiátricos.

Modelos ALTERNATIVOS BMEC
Antes del desarrollo de protocolos eficientes para derivar BMECs de iPSCs1,6,35,36,los investigadores habían empleado BMECsinmortalizados 37 para estudiar la función BBB. Sin embargo, muchos de estos modelos no lograron fenotipos BBB deseables, tal rango fisiológico de valores TEER38,39. La utilización de iPSCs tiene la ventaja de conservar el fondo genético del individuo del que se derivan las células. Los científicos están trabajando activamente en el establecimiento de modelos de microambientes ex vivo derivados de iPSC que recapitulan la estructura y la función del cerebro humano. Los investigadores han desarrollado métodos para derivar BMECs que son estructural y fisiológicamente similares a los BMECs encontrados in vivo. Los métodos para obtener poblaciones purificadas de BMECs derivados de iPSC requieren una serie de pasos diferentes con protocolos optimizados en los últimos años1,6,35,36. Generalmente, los BMECs derivados de iPSC se cultivan en el medio esencial 6 (E6) durante 4 días, seguido de 2 días en el medio libre de suero endotelial humano (hESFM) complementado con factor de crecimiento fibroblasto básico (bFGF), ácido retinoico (RA), y suplemento B27. A continuación, las células se cultivan en una matriz de colágeno IV (COL4) y fibronectina (FN) para obtener >90% BMECs homogéneos1.

La identidad de los BMECs se confirma mediante la inmunofluorescencia que muestra la coexpresión de las proteínas BMEC, incluida la molécula de adhesión de células plaquetarias-endoteliales-1 (PECAM1), SLC2A1 y proteínas de unión estrechas como la proteína de unión estrecha 1 (TJP1), la ocludina (OCLN) y claudin-5 (CLDN5)6. Los ensayos de brotes se han utilizado para confirmar el potencial angiogénico de los BMECs derivados de iPSC. 6 La integridad BBB de los BMECs se evalúa mediante la presencia de valores FIsiológicos in vitro TEER (~2000Ω x cm2)37 y actividad medible para transportadores de eflujo como ABCB1 y ABCC11,6,36. Los recientes avances metodológicos del grupo Lippmann han dado lugar a protocolos BMEC derivados de iPSC con menor variabilidad experimental y reproducibilidad mejorada1. Sin embargo, no se sabe si se pueden ampliar y pasar más allá de la etapa de sub-culto. Nuestro protocolo modificado tiene como objetivo abordar este problema pasando los BMECs derivados de iPSC más allá del día 8 y evaluando si se pueden ampliar aún más para conservar las propiedades de BBB después de la criopreservación. Aunque ningún estudio ha descrito la transferencia de BMECs derivados de iPSC, existe un protocolo para la criopreservación BMEC que retiene las propiedades fisiológicas de BBB después de someterse a un ciclo de congelación-deshielo40. Sin embargo, no se sabe después de la criopreservación BMECs se puede pasar y retener propiedades BBB.

Los BMECs derivados de iPSC utilizando el protocolo Lippmann se han utilizado para modelar la interrupción del BBB en trastornos neurológicos como la enfermedad de Huntington7. Estos BMECs derivados de iPSC también se han utilizado para investigar los efectos de la infección bacteriana como Neisseria meningitidis o Streptococcus del Grupo B en la interrupción de la barrera de la FSC en sangre y BBB respectivamente41,42. Además, utilizando BMECs derivados del iPSC de pacientes con síndrome de eliminación de 22q con esquizofrenia, los investigadores observaron un aumento de la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1), una molécula de adherencia importante en BMECs que ayudan con el reclutamiento y la extravasación de leucocitos en el cerebro43. En conjunto, estos estudios demuestran la utilidad de los BMECs derivados de iPSC para estudiar la interrupción del BBB en trastornos neuropsiquiátricos complejos.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los iPSC humanos fueron reprogramados de los fibroblastos de donantes sanos utilizando un protocolo aprobado por las Juntas de Revisión Institucional del Hospital General de Massachusetts y el Hospital McLean, y caracterizados como descritos en estudios anteriores44,45,46.

NOTA: Brevemente, los fibroblastos fueron reprogramados a iPSC a través de la reprogramación genética basada en ARNM47. Los iPSC se mantuvieron en el medio de células madre (SCM) (ver lista de materiales) y se almacenaron a una densidad de ~1.2 x 102 células/ml con 1 ml de SCM, 10 μM con inhibidor de la proteína quinasa asociada a rho (ROCKi) Y-27632, y 10% (v/v) sulfuro de dimetil (DMSO), en viales criopreservados en nitrógeno líquido a -160 °C. Todos los siguientes procedimientos se llevan a cabo en un gabinete de bioseguridad a menos que se indique lo contrario.

1. Dilución de la matriz de membrana del sótano y recubrimiento de placas

  1. El factor de crecimiento diluido (1:50) redujo la matriz de membrana del sótano purificada a partir del tumor en engelbreth-Holm-Swarm en el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco sin fenol rojo.
  2. Cubra las placas de cultivo celular con la cantidad adecuada de matriz de membrana del sótano diluida (es decir, placa de 6 pozos = 1 ml, placa de 12 pozos = 0,5 ml) e incuba estas placas a 37 °C durante al menos 1 hora.

2. Mantenimiento de iPSC

NOTA: La confluencia máxima por pozo en una placa de fondo plano de 6 pozos es ~1.2 x 106 celdas.

  1. Descongelar iPSCs criopreservados en SCM con 10 μM Y-27632 y placa en una placa de 6 pozos recubierta con factor de crecimiento diluido reducido matriz de membrana del sótano.
  2. Mantenga los iPSCs en SCM con 10 μM Y-27632 durante las primeras 24 horas después del deshielo. Cambie a un medio fresco después de 24 horas.
  3. Mantenga los iPSCs en SCM hasta que las células alcancen el 80-90% de la confluencia antes de pasar.
    1. Calcule cuántos iPSC serán necesarios para la diferenciación multiplicando la densidad deseada para la diferenciación (15.600 celdas/cm2)por el área superficial del pozo. Para una placa de fondo plano de 6 pozos, multiplique 15.600 celdas/cm2 por 9,6 cm2 para un total de 149.760 celdas/pozo.
  4. Para pasar, lave las células con la Solución de Sal Equilibrada (HBBS) de Hanks. A continuación, incubar las células con ácido etilenodiaminetetraacetic no enzimático (EDTA) (ver lista de materiales) durante 5 minutos a 37 °C.
    1. Utilice un rascador de células para levantar suavemente las células. Recoger celdas en SCM fresco.
    2. Placas de las células sobre placas de cultivo celular recubiertas con SCM diluidas y mantener las células como se describe en el paso 2.3 o almacenarlas a ~1.2 x 106 células/ml en 1 ml de SCM, 10 μM Y-27632, y 10% DMSO (v/v) en viales criopreservados en nitrógeno líquido a una temperatura de -160 °C.

3. Diferenciación de iPSC a BMECs

NOTA: EDTA no enzimática separa las células en grupos. EDTA enzimática (ver Tabla de Materiales)separa las células en suspensión de una sola célula. El ácido retinoico (AR) debe protegerse de la luz.

  1. Lave iPSCs una vez con la solución salina del tampón de fosfato (DPBS) de Dulbecco. Incubar con EDTA enzimática (1 ml para placa de 6 pozos, 0,5 ml para placa de 12 pozos y 0,25 ml para placa de 24 pozos) durante aproximadamente 5 minutos a 37 °C para producir una sola suspensión celular.
  2. Recoge células y centrífugas a 300 x g (fuerza centrífuga relativa) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Pellets de células resuspend en SCM que contienen 10 μM Y-27632.
  3. Determine la densidad celular mediante trypan blue y contador de celdas automatizado o un dispositivo hemocítómetro. Células de placa a una densidad de 15.600 células/cm2 o 149.760 células/pozo de una placa plana de 6 pozos (con una superficie de 9,6 cm2/pozo) en SCM que contiene 10 μM Y-27632 durante 24 horas.
  4. Inicie la diferenciación después de 24 horas cambiando SCM a medio E6. Cambie el medio E6 diariamente durante los próximos 4 días.
  5. En el día 4 de diferenciación, reemplace el medio E6 por hESFM complementado con suplemento diluido (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF y 10 μM RA. No cambie este medio durante las próximas 48 horas.
  6. Preparar 200 ml de hESFM con diluido (1:200) B27, mezclar 1 ml de suplemento B27 concentrado de 50x a 199 ml de hESFM.
  7. Preparar 20 ng/mL de bFGF reconstituyendo 50 μg de bFGF en 250 μL de tampón Tris (Tris de 5 mM, pH 7.6, 150 mM NaCl) para hacer 200 μg/mL solución de stock. Preparar 200 ml de hESFM que contenga 20 ng/mL bFGF mezclando 20 μL de 200 μg/mL bFGF con 200 ml de hESFM.
  8. Preparar 10 μM RA haciendo primero una solución de 40 mg/ml de caldo ra añadiendo 2,5 ml de DMSO a 100 mg de polvo de AR. Diluir esta concentración a 3 mg/ml para hacer solución de stock de 10 mM. Preparar 200 ml de hESFM que contenga 10 μM RA mezclando 200 μL de 10μM RA en 200 mL hESFM.

4. Recubrimiento de colágeno IV (COL4) y matriz de fibronectina (FN) para purificación de BMEC derivado de iPSC

  1. Añadir 2 ml de agua estéril a 2 mg de FN para hacer 1 mg/mL FN solución de stock. Añadir 5 ml de agua estéril a 5 mg de COL4 para hacer una solución de stock COL4 de 1 mg/ml.
    1. Permita que el FN se disuelva durante al menos 30 minutos a 37 °C y que el COL4 se disuelva a temperatura ambiente.
  2. Diluir la solución de stock de FN en agua estéril a una concentración final de 100 μg/mL y col4 solución de stock a una concentración final de 400 μg/mL.
  3. Cubra las placas deseadas (placa de 6 pozos = 1 ml de solución COL4/FN, placa de 12 pozos = 0,5 ml, placa de 24 pozos= 0,25 ml y placa filtrada de 12 trastos = 0,25 ml) con la mezcla de 400 μg/mL COL4 y 100 μg/mL FN.
  4. Incubar placas durante un mínimo de 2 horas o durante la noche a 37 °C; para las placas filtradas Transwell, se recomienda un mínimo de 4 horas.

5. Subcultura y purificación de BMECs derivados de iPSC

NOTA: La incubación con EDTA enzimática puede tardar más de 15 minutos dependiendo de la confluencia de las células el día 6 de la diferenciación.

  1. En el día 6 de diferenciación, lave las células dos veces con DPBS. Incubar con 1 ml de EDTA enzimática durante al menos 15 minutos a 37 °C hasta que se obtenga una sola suspensión celular.
  2. Recoger las células a través de la centrifugación a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Pellets de células resuspend con hESFM fresco con suplemento diluido (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF, y 10 μM RA.
  3. Células de semillas sobre placas recubiertas con una mezcla de 400 μg/mL COL4 y 100 células FN de μg/ml utilizando una proporción de 1 pozo de una placa de 6 pozos a 3 pozos de una placa de 12 pozos, 3 pozos de una placa filtrada de 12 ciclos, o 6 pozos de una placa de 24 pozos.
  4. Semilla iPSCs indiferenciadas de la misma línea celular en la placa filtrada col4/FN recubierta de 12 ciclos como control negativo para el análisis TEER.
  5. Después de 24 horas de sub-culturing, cambiar medio a hESFM con suplemento B27 solamente. No se necesitan cambios medios después de este paso.

6. Ensayo de brotes

  1. Recoger BMECs derivados del iPSC día 8 y sembrarlos a 100.000 células/pozo en una placa de fondo plano de 24 pozos recién recubierta con 200 μL/cm2 de matriz de membrana del sótano.
  2. Tratar estas células con hESFM con diluido (1:200) B27 y 40 ng/mL del factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGFA165).
  3. Observe las células cada 24 horas y cambie el medio cada dos días.

7. Inmunocitoquímica (ICC)

NOTA: Icc se lleva a cabo en placas planas de 24 pozos.

  1. Después de 48 horas de sub-culturing (día 8), lave las células dos veces con DPBS. Corrija las células con un 4% de paraformaldehído (PFA) durante 20 minutos.
  2. Lave las células tres veces con DPBS, 5 minutos por lavado. Celdas prebloqueadas durante 1 hora a temperatura ambiente en DPBS con 5% suero de burro y 0.3% Tritón X-100 (v/v).
  3. Incubar con anticuerpos primarios: ratón anti-humano-PECAM1 (1:100, stock 0,5 mg/mL), conejo anti-humano-TJP1 (1:200, stock 0,53 mg/mL), ratón anti-humano-CLDN5 (1:200, 0,5 mg/ml), ratón anti-humano-OCLN (1:200, stock 0,5 mg/mL), y conejo anti-humano-SLC2A1(1:100, stock 0,2 mg/mL) en DPBS que contiene un 5% de suero de burro durante la noche a 4°C.
    1. Enjuague las células una vez con DPBS y luego lave cinco veces durante 5 minutos por lavado con DPBS.
  4. Incubar células con anticuerpos secundarios: burro-anti-conejo Alexa Fluor 555 (1:200) y burro-anti-ratón 488 (1:200) en DPBS que contiene 5% suero de burro durante 1 hora.
  5. Después de esta incubación, agregue Hoechst 33342 trihidroclorida trihidrato diluido (1:1000) en DPBS durante 10 minutos.
    1. Retire la solución Hoechst 33342 y enjuague una vez con DPBS y lave cuatro veces con DPBS durante 5 minutos por lavado.
  6. Visualice las células en microscopios de fluorescencia para buscar la expresión y localización de los fabricantes de células.

8. Medición y análisis del TEER

NOTA: Las placas filtradas Corning 12-Transwell están equipadas con filtros que consisten en membranas de tereftalato de polietileno de 1,12 cm2 y 0,4 micrómetros. Las mediciones TEER se obtienen en réplicas técnicas (3 por pozo) y biológicas (3 pozos por línea celular y/o condición).

  1. 24 horas después de la sub-culturing (día 7), mida EL TEER usando electrodos de palillo y un voltohmmeter cada 24 horas. Consulte el manual del usuario de voltohmmeter para obtener instrucciones específicas sobre cómo obtener mediciones.
    1. Para medir EL TEER, cargue el instrumento del voltohmímetro la noche anterior. Limpie ligeramente el instrumento y los electrodos de palillo con un 70% de etanol antes de colocarlos en el capó de seguridad.
    2. Encienda y calibrar el medidor ohmio según lo recomendado por el fabricante.
    3. Conecte los electrodos de palillo y enjuague los electrodos con un 70% de etanol seguido de DPBS.
    4. Coloque el electrodo final más corto en la plaquita trans-pozo (la cámara apical) y el extremo más largo en la cámara basolateral.
    5. Primero mida un pozo en blanco que esté recubierto únicamente con COL4/FN. Entonces mida los otros pozos.
    6. Enjuague rápidamente los electrodos de palillo con un 70% de etanol seguido de DPBS al medir diferentes condiciones (es decir, medir diferentes líneas celulares).
  2. Después de que se hayan registrado todas las mediciones (en Ω), enjuague los electrodos de palillo con un 70% de etanol y luego agua estéril. Limpie suavemente el electrodo y deje que se seque al aire en la capucha de seguridad.
  3. Promediar los valores TEER triplicado (en Ω) del pozo en blanco y restar este valor medio de cada valor TEER sin procesar por condición.
    1. Promedia los valores restados y multiplícalos por 1,12 cm2 (el área de superficie de la plaquita de 12 trasposados).
    2. Utilice valores transformados desde el paso 6 para generar el gráfico que muestra el valor TEER y los errores estándar para cada día de medición teer.

9. Actividad y análisis del transportador de Efflux

NOTA: El ensayo de actividad del transportador Efflux se realiza en una placa de fondo plano de 24 pozos. Los transportistas de interés de Efflux incluyen ABCB1 y ABCC1. Se recomienda que cada condición se realice en triplicato con pozos de control (es decir, pozos en blanco sin los respectivos inhibidores).

  1. Después de 48 horas de sub-cultivo (día 8), incubar células con 10 μM Valspodar (inhibidor ABCB1) o 10 μM MK571 (inhibidor ABCC1) durante 1 hora a 37 °C.
    1. Preparar 10 mM de caldo valspodar disolviendo 5 mg de polvo (1214,64 g/mol) en 412 μL de DMSO y diluir a una concentración de trabajo de 10 μM. Por ejemplo, para hacer 10 ml de hESFM con 10 μM Valspodar, mezcle 10 μL de 10 mM de caldo Valspodar con 10 ml de hESFM.
    2. Preparar 10 mM MK571 stock disolviendo 5 mg de polvo (537,07 g/mol) en 931 μL y diluir a una concentración de trabajo de 10 μM. Por ejemplo, para hacer 10 mL de hESFM con 10 μM MK571, mezcle 10 μL de 10 mM MK571 con 10 ml de hESFM.
  2. Después de 1 hora, incubar células con 10 μM de rhodamina 123 (sustrato ABCB1) o 10 μM 2',7'-diclorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA, sustrato ABCC1) con o sin sus respectivos inhibidores durante 1 hora a 37 °C.
    1. Preparar 10 mM rhodamina 123 disolviendo 10 mg de polvo (380,82 g/mol) en 875 μL de DMSO y diluir a una concentración de trabajo de 10 μM. Por ejemplo, para hacer 10 ml de hESFM con 10 μM rhodamina 123, mezclar 10 μL de 10 mM rhodamine 123 stock con 10 ml de hESFM.
    2. Preparar 10 mM H2DCFDA disolviendo 50 mg de polvo (487,29 g/mol) en 10,26 ml de DMSO y diluir a la concentración de trabajo de 10 μM. Por ejemplo, para hacer 10 ml de hESFM con 10 μM rhodamina 123, mezclar 10 μL de 10 mM rhodamine 123 stock con 10 ml de hESFM.
  3. Lave las células dos veces con 0,5 ml de DPBS y lilas utilizando DPBS que contenga el 5% de Triton-X (v/v).
  4. Mida la fluorescencia de las células liadas utilizando un lector multiplaca o microplaca (ver lista de materiales).
    1. Ajuste el instrumento lector de placas fluorescentes a 485 nanómetros de excitación y 530 nanómetros de emisión y mida la fluorescencia en estas longitudes de onda.
    2. Para pozos no utilizados en el ensayo transportador, lave las células dos veces con DPBS antes de fijarlas con 4% PFA para cuantificación de núcleos celulares.
  5. Incubar células con Hoechst 33342 trihidroclorida trihidrato diluido (1:1000) en DPBS durante 10 minutos. Imagen de múltiples campos visuales en cada pozo para calcular el recuento promedio de núcleos celulares utilizando microscopios de fluorescencia.
  6. Contar núcleos utilizando Fiji y normalizar los valores de fluorescencia por célula a estos recuentos.
    1. Calcule la acumulación media de fluorescencia restando el valor de acumulación de fluorescencia cruda para cada condición de su respectivo valor en blanco.
    2. Valores restados promedio para cada condición.
    3. Divida los valores medios del paso 9.6.1 por el recuento promedio de celdas. Utilice estos valores para normalizar los valores de fluorescencia por célula.
    4. Utilice valores normalizados para generar una representación gráfica para cada condición inhibitoria y realizar cualquier análisis estadístico necesario.

10. Pasar, expandir y criopreservar BMECs

  1. Reponga los cultivos BMEC del día 8 con hESFM fresco complementado con B27 diluido (1:200) y permita que las células se expandan durante dos días más en la matriz COL4/FN.
  2. Cubra una nueva placa filtrada de 12 transcillos y una placa de fondo plano de 24 pozos con 400 μg/mL COL4 y 100 μg/mL FN e incubar durante 4 horas.
  3. El día 10, lave las células con DPBS e incuba con 1 ml de EDTA enzimática durante al menos 15 minutos a 37°C hasta que se obtenga una sola suspensión celular.
  4. Recoger las células a través de la centrifugación a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    1. Para criopreservar estas células, resuspend pellets celulares con hESFM fresco con 30% Suero Bovino Fetal (FBS) y 10% DMSO.
    2. Almacene los BMECs derivados de iPSC en viales criopreservados en un recipiente de isopropanol durante las primeras 24 horas a -80 °C y, a continuación, colóquelo en nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo a -160 °C.
    3. Para pasar estas células, pellets celulares resuspend con hESFM fresco complementado con diluido (1:200) B27.
  5. Células de semillas sobre placas recubiertas preparadas en el Paso 10.2. Células de semillas que utilizan una proporción de 1 pozo de una placa de 6 pozos a 3 pozos de una placa filtrada de 12 ciclos y a 6 pozos de una placa de 24 pozos. Permita que las células crezcan y se expandan durante 24 horas.
  6. El día 11, mida el TEER siguiendo los pasos enumerados en el paso 8.
  7. El día 12, realice ICC siguiendo los pasos enumerados en el Paso 9.
  8. Para descongelar los BMECs criopreservados, coloque los viales criopreservados en un baño de agua tibia o cuentas a 37oC. A continuación, transfiera los BMECs descongelados a 5 ml de hESFM complementados con B27 diluido (1:200).
    1. Recoger las células a través de la centrifugación a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Resuspend las células en hESFM complementadas con diluido (1:200) B27, 10 μM RA y 10 μM Y-27632.
    2. Después de 24 horas, cambie de medio a hESFM complementado con diluido (1:200) B27 y 10 μM Y-27632 sin AR.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diferenciación BMEC
Algunos pasos críticos en este protocolo deben seguirse con precisión (Figura 1). E6 uso medio en el día 1 es importante, ya que se utiliza a menudo para derivar linaje neuroectoderm de iPSCs dentro de un período relativamente corto de tiempo que produce resultados reproducibles a través de múltiples líneas celulares36. Otro paso importante es el día 4 de la diferenciación, donde el medio E6 debe cambiarse a hESFM con B27 diluid...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modificaciones y solución de problemas

En este protocolo, hicimos algunas modificaciones en el uso de una matriz extracelular de uso común y medios de cultivo celular durante la culturing iPSC para la derivación de BMECs (Figura 1). Estos cambios no afectaron a la capacidad de derivar BMECS de iPSC humanos como se describe en el Protocolo Lippmann1. Se utilizó una línea iPSC de un donante sano diferente para demostrar que e...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por un Premio R01MH113858 del Instituto Nacional de Investigación Biobehavioral de Salud Mental para Nuevos Científicos Innovadores (BRAINS) R01MH113858 (a R.K.), premio KL2 TR002542 (PL) de los Institutos Nacionales de Salud. un Premio del Instituto Nacional de Desarrollo Científico Clínico de Salud Mental K08MH086846 (a R.K.), una Beca de la Fundación R Baer Jr de Sídney (a P.L.) el Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (a R.K.), la Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (a R.K.), la Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (a R.K.), el Instituto de Células Madre de Harvard (a R.K.) y por Steve Willis y Elissa Freud (a R.K.). Agradecemos a la Dra. Annie Kathuria por su lectura crítica y comentarios sobre el manuscrito.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2′,7′-diclorodihidrofluoresceína diacetato SigmaAldrichD6883-50MG
AccutaseSigma AldrichA6964-100mL
Alexa Fluor 488 Burro anti-Ratón IgGLife TechnologiesA-21202
Alexa Fluor 555 Burro anti-Conejo IgGLife TechnologiesA-31572
B27 SuplementoThermo Fisher Scientific17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Señalización de células mAb de ratón3528S
CLDN5 (Claudin-5)Thermo Fisher Scientific35-2500
Colágeno IV de placenta humanaSigma AldrichC5533-5mg
Corning 2 mL Vial criogénico de polipropileno roscado interno Corning  8670
Corning  Placas de cultivo celular de fondo plano Costar (6 pocillos)Corning353046
Corning  Placas de cultivo celular de fondo plano Falcon (24 pocillos)Placa de353047
Corning Transwell con insertos de membrana de poliéster permeable (12 pocillos)Correderas Corning3460
CountessThermo Fisher ScientificC10228
DMEM/F12 (sin rojo fenol)Thermo Fisher Scientific 
DMSOSigma AldrichD2438-50mL
Suero de burroSigma AldrichD9663-10ML
DPBS (+/+)Gibco/Thermo Fisher Scientific14040-117
Voltímetro epitelial/ohmio (TEER) (EVOM2) STX2World Precision InstrumentsN/A
Essential 6 Medio (Thermo Fisher)Thermo Fisher Scientific
Suero Fetal Bovino (FBS)Sigma AldrichF2442
FibronectinaSigma AldrichF2006-2mg
Geltrex Factor de Crecimiento Reducido Libre de LDEV Matriz de Membrana BasalThermo Fisher ScientificA1413202
Hanks' Balance Solución salina con calcio y magnesio Thermo Fisher Scientific24020-117
Hoechst 33342, triclorhidrato, trihidratoThermo Fisher ScientificH3570
Medio libre de suero endotelial humanoThermo Fisher Scientific11111044
InCell Analyzer 6000General ElectricN/A
Invitrogen  Contador de células automatizado CountessThermo Fisher Scientific N/A
MK-571Sigma AldrichM7571-5MG
NutriStemStemgent01-0005
OccludinThermo Fisher Scientific33-1500
Paraformaldehído 16%Servicios demicroscopía electrónica15710
Perkin Elmer Envision 2103 multiplaca LectorPerkin ElmerN/A
Recombinante Humano VEGF 165Peprotech100-20
Recombinante Humano FGF-básico (154 a.a.)Peprotech100-18B
Ácido retinoicoSigma AldrichR2625-100MG
Rhodamine 123Sigma Aldrich83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1)ThermoFisherPA1-21041
SOX17Señalización81778S
TJP-1 (ZO-1)ThermoFisherPA5-28869
Triton X-100Sigma AldrichT8787-50ML
Tinte azul de tripán (0,4%) para usar con el contador de células automatizado CountessThermo Fisher ScientificT10282
Valspodar (Sigma) (ciclosporina A)Sigma AldrichSML0572-5MG
Versene soluciónThermo Fisher Scientific15040066
Y-27632 diclorhidrato (inhibidor de ROCK)Tocris/ Termo Fisher Scientific1254
pocillos múltiples Corning A1413202A1516401 celular

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
  2. Smith, Q. R., Rapoport, S. I. Cerebrovascular Permeability Coefficients to Sodium, Potassium, and Chloride. Journal of Neurochemistry. 46, 1732-1742 (2006).
  3. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  4. Sanchez-Covarrubias, L., Slosky, L., Thompson, B., Davis, T., Ronaldson, P. Transporters at CNS Barrier Sites: Obstacles or Opportunities for Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design. 20, 1422-1449 (2014).
  5. Stamatovic, S., Keep, R., Andjelkovic, A. Brain Endothelial Cell-Cell Junctions: How to "Open" the Blood Brain Barrier. Current Neuropharmacology. 6, 179-192 (2008).
  6. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, 783-791 (2012).
  7. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, 1365-1377 (2017).
  8. Eum, S., Lee, A. M., Bishop, J. R. Pharmacogenetic tests for antipsychotic medications: clinical implications and considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18, 323-337 (2016).
  9. Najjar, S., et al. Neurovascular Unit Dysfunction and Blood–Brain Barrier Hyperpermeability Contribute to Schizophrenia Neurobiology: A Theoretical Integration of Clinical and Experimental Evidence. Frontiers in Psychiatry. 8, 83(2017).
  10. Pollak, T. A., et al. The blood-brain barrier in psychosis. Lancet Psychiatry. 5, 79-92 (2018).
  11. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  12. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18, 471-479 (2017).
  13. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 1-2 (2016).
  14. Hwang, Y., et al. Gene expression profiling by mRNA sequencing reveals increased expression of immune/inflammation-related genes in the hippocampus of individuals with schizophrenia. Translational Psychiatry. 3, 321(2013).
  15. Kim, S. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 11, (2016).
  16. Lizano, P., et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. American Journal of Psychiatry. 176, 564-572 (2019).
  17. Harris, L. W., et al. The Cerebral Microvasculature in Schizophrenia: A Laser Capture Microdissection Study. PLoS ONE. 3, 3964(2008).
  18. Greene, C., Hanley, N., Campbell, M. Claudin-5: gatekeeper of neurological function. Fluids and Barriers of the CNS. 16, 3(2019).
  19. Maes, M., Sirivichayakul, S., Kanchanatawan, B., Vodjani, A. Breakdown of the Paracellular Tight and Adherens Junctions in the Gut and Blood Brain Barrier and Damage to the Vascular Barrier in Patients with Deficit Schizophrenia. Neurotoxicity Research. 36, 306-322 (2019).
  20. Katsel, P., Roussos, P., Pletnikov, M., Haroutunian, V. Microvascular anomaly conditions in psychiatric disease. Schizophrenia - connection. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 77, 327-339 (2017).
  21. Pouget, J. G., et al. Genome-Wide Association Studies Suggest Limited Immune Gene Enrichment in Schizophrenia Compared to 5 Autoimmune Diseases. Schizophrenia Bulletin. 42, 1176-1184 (2016).
  22. Luo, X., et al. Systematic Prioritization and Integrative Analysis of Copy Number Variations in Schizophrenia Reveal Key Schizophrenia Susceptibility Genes. Schizophrenia Bulletin. , 15(2014).
  23. Cai, H. Q., et al. Increased macrophages and changed brain endothelial cell gene expression in the frontal cortex of people with schizophrenia displaying inflammation. Molecular Psychiatry. , (2018).
  24. Katsel, P., Davis, K. L., Gorman, J. M., Haroutunian, V. Variations in differential gene expression patterns across multiple brain regions in schizophrenia. Schizophrenia Research. 77, 241-252 (2005).
  25. de Klerk, O. L., et al. Regional increase in P-glycoprotein function in the blood-brain barrier of patients with chronic schizophrenia. Psychiatry Research: Neuroimaging. 183, 151-156 (2010).
  26. Hoosain, F. G., et al. Bypassing P-Glycoprotein Drug Efflux Mechanisms: Possible Applications in Pharmacoresistant Schizophrenia Therapy. BioMed Research International. 2015, 1-21 (2015).
  27. Kimchi-Sarfaty, C., et al. A "Silent" Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
  28. Martínez-Magaña, J. J., et al. Exploratory Analysis of Rare and Novel Variants in Mexican Patients Diagnosed with Schizophrenia and Dementia. Revista de Investigación Clínica. 71, 1879(2019).
  29. Girard, S. L., et al. Increased exonic de novo mutation rate in individuals with schizophrenia. Nature Genetics. 43, 860-863 (2011).
  30. Xu, B., et al. De novo gene mutations highlight patterns of genetic and neural complexity in schizophrenia. Nature Genetics. 44, 1365-1369 (2012).
  31. Kurian, S. M. Identification of blood biomarkers for psychosis using convergent functional genomics. Molecular Psychiatry. 22, (2011).
  32. Prata, D. P., Costa-Neves, B., Cosme, G., Vassos, E. Unravelling the genetic basis of schizophrenia and bipolar disorder with GWAS: A systematic review. Journal of Psychiatric Research. 114, 178-207 (2019).
  33. Trépanier, M. O., Hopperton, K. E., Mizrahi, R., Mechawar, N., Bazinet, R. P. Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia: a systematic review. Molecular Psychiatry. 21, 1009-1026 (2016).
  34. Busse, S., et al. Different distribution patterns of lymphocytes and microglia in the hippocampus of patients with residual versus paranoid schizophrenia: Further evidence for disease course-related immune alterations. Brain, Behavior, and Immunity. 26, 1273-1279 (2012).
  35. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160(2015).
  36. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14, 9(2017).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance (TEER) to Measure the Integrity of Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. 142, Springer. New York. 99-114 (2019).
  38. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  39. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 33(2013).
  40. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of Brain Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Is Enhanced by Rho-Associated Coiled Coil-Containing Kinase Inhibition. Tissue Engineering Part C: Methods. 22, 1085-1094 (2016).
  41. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. 10, 1181(2019).
  42. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. 2, 00398(2017).
  43. Crockett, A. M., et al. Disruption of the Blood-Brain Barrier in 22q11.2 Deletion Syndrome. biorXiv. , (2019).
  44. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9, 321(2019).
  45. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and Functional Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids in Schizophrenia. JAMA Psychiatry. , (2020).
  46. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 34(2020).
  47. Warren, L., Lin, C. mRNA-Based Genetic Reprogramming. Molecular Therapy. 27, 729-734 (2019).
  48. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , 52099(2014).
  49. Wang, P., Rodriguez, R. T., Wang, J., Ghodasara, A., Kim, S. K. Targeting SOX17 in Human Embryonic Stem Cells Creates Unique Strategies for Isolating and Analyzing Developing Endoderm. Cell Stem Cell. 8, 335-346 (2011).
  50. Blume, L. F., Denker, M., Kunze, T., et al. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazie. , 19-24 (2010).
  51. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D. G., Robey, P. G. Human Pluripotent Stem Cell Culture: Considerations for Maintenance, Expansion, and Therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  52. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. NeuroReport. 29, 588-593 (2018).
  53. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  54. Baruah, J., Vasudevan, A. The Vessels Shaping Mental Health or Illness. Open Neuroimaging Journal. 13, 1-9 (2019).
  55. Lopes, R., Soares, R., Coelho, R., Figueiredo-Braga, M. Angiogenesis in the pathophysiology of schizophrenia - comprehensive review and a conceptual hypothesis. Life Sciences. 128, 79-93 (2015).
  56. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 12, 13(2015).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Blood Brain BarrierEndothelial DifferentiationTEER MeasurementEfflux Transporter ActivityImmunocytochemistryWestern BlottingSprouting Assay

Artículos relacionados