Presentamos un método genético modificado-libre (GM-libre) para obtener las células con un fenotipo neuronal de glóbulos periféricos reprogramados. La activación de una vía de señalización vinculada a la nueva proteína humana ligada a GPI revela un método eficiente libre de GM para la obtención de células madre pluripotentes humanas.
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Artículo de método
Generación Libre De Gm De Células Neuronales Derivadas De La Sangre
En este artículo
Resumen
Resumen
Muchos trastornos neurológicos humanos son causados por la degeneración de las neuronas y las células gliales en el cerebro. Debido a las limitaciones en las estrategias farmacológicas y otras estrategias terapéuticas, actualmente no hay cura disponible para el cerebro lesionado o enfermo. El reemplazo celular aparece como una estrategia terapéutica prometedora para las condiciones neurodegenerativas. Hasta el día de hoy, las células madre neurales (NSC) se han generado con éxito a partir de tejidos fetales, células embrionarias humanas (CE) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Un proceso de desdiferenciación se inició por la activación de la nueva glicoproteína humana ligada a GPI, que conduce a la generación de células madre pluripotentes. Estas células madres pluripotentes sangre-derivadas (BD-PSCs) diferencian in vitro en las células con un fenotipo de los nervios según lo mostrado por microscopia del brightfield y de la inmunofluorescencia. El análisis ultraestructural de estas células por medio de microscopía electrónica confirma su estructura primitiva así como neuronal-como morfología y características subcelulares.
Introducción
El desarrollo de métodos básicos y preclínicos de investigación con células madre fomenta la aplicación clínica de terapias basadas en células madre para enfermedades neurológicas. Tal terapia potencial depende críticamente del método para la generación de células neuronales humanas que conducen a la recuperación funcional1.
Las células madre neurales (NSCs) se auto-renuevan y se diferencian en nuevas neuronas a lo largo de la vida en un proceso llamado neurogénesis adulta. Sólo las áreas cerebrales muy restringidas albergan NSCs competentes para generar neuronas recién nacidas en la edad adulta. Tales NSCs pueden da....
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Protocolo
Se obtuvieron aprobaciones éticas al realizar los experimentos.
1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMNCs)
- Asegúrese de que todos los donantes firmaron el consentimiento informado antes de la extracción de sangre de conformidad con las directrices institucionales.
- Tome 30 mL de sangre de donantes sanos por personal médico capacitado de acuerdo con el protocolo estándar.
- Aísle los PBMNCs por medios de gradiente de densidad. Utilizar 10 mL de medio con 25 mL de sangre 1:1 diluida con solución salina tampón de fosfato (PBS), y centrífuga a 300 x g durante 30 min.
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Resultados
Los resultados proporcionan evidencia de que este nuevo método libre de GM es capaz de revertir las células progenitoras sanguíneas a su estado más primitivo sin actuar directamente sobre el genoma humano.
Hemos demostrado previamente que la reticulación de anticuerpos específicos de proteínas ligadas a GPI se inicia a través de PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN regulación al alza de genes altamente conservados y relevantes para el desarrollo como WNT, NOTCH y C-Kit, iniciando así un proceso de.......
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Discusión
El método no-GM de reprogramación de células humanas descritas en este trabajo se basa en la activación de membrana a núcleo de la maquinaria de señalización detrás de la glicoproteína de membrana humana ligada a GPI que inicia el proceso de desdiferenciación que conduce a la generación ex vivo y la expansión de pscs autorrenuevas obtenidos de sangre periférica humana no manipulada. Estas células cuando se cultivan en medios apropiados son capaces de re-diferenciación en células pertenecientes a diferentes capas.......
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Divulgaciones
La autora correspondiente declara que es titular de una patente relacionada con Novel Human GPI-linked Protein, así como que cofundó y trabaja para ACA CELL Biotech. Los otros autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Dedicado a la memoria del Dr. Rainer Saffrich.
Los autores están especialmente agradecidos a José Manuel García-Verdugo y Vicente Herranz-Pérez por realizar experimentos y análisis em en el Laboratorio de Neurobiología Comparada, Instituto Cavanilles de Biodiversidad y Biología Evolutiva, Universidad de Valencia, CIBERNED, Valencia, España, que fue apoyado por la financiación de la investigación de la Beca Prometeo para grupos de investigación de excelencia PROMETEO/2019/075. El resto de este trabajo fue apoyado por ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Alemania.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Fracción de albúmina V | Roth | T8444.4 | |
| anti-GFAP Cy3 conjugado | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Kit de viabilidad celular | Biozym | 872045 | Biozym descatalogado. El producto fabricado por Logos Biosystems. |
| Ácido ascórbico 2-fosfato sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Sin suero 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Solución básica de FGF | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC medios de | gradiente de densidad |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | perlas magnéticas de tamaño nanométrico |
| Portaobjetos de recuento de células Luna | Biozym | 872010 | Biozym descatalogado. El producto fabricado por Logos Biosystems. |
| Portaobjetos de cámara Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | resina epoxi |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Descatalogado. Disponible en: TMS-013-B |
| GDNF humano recombinante | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamina |
| Grado de glutaraldehído | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Célula de heparina sódica | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| BDNF humano | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Ratón de laminina | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Citrato de plomo | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Contador de células automatizado | Biozym | 872040 | Biozym descontinuado. El producto fabricado por Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsä ulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada cámara digital Olympus | |||
| Multiplatte Nunclon 4 pocillos | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Suplemento 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Medio Neurobasal | Gibco | 10888022 | |
| PBS estéril | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornitina | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Acetato de uranilo C | EMS | 22400 |
Referencias
- Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32(2011).
- Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neur....
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