Detección de variantes genéticas en el gen CALR mediante análisis de fusión de alta resolución

Resumen

El análisis de fusión de alta resolución (HRM) es una solución sensible y rápida para la detección de variantes genéticas. Depende de las diferencias de secuencia que dan lugar a heterodúplex que cambian la forma de la curva de fusión. Al peinar la HRM y la electroforesis en gel de agarosa, se pueden identificar diferentes tipos de variantes genéticas como los indels.

Resumen

El análisis de fusión de alta resolución (HRM) es un método poderoso para el genotipado y el escaneo de variación genética. La mayoría de las aplicaciones de HRM dependen de colorantes de ADN saturados que detectan diferencias de secuencia y heterodúplex que cambian la forma de la curva de fusión. Se necesita una excelente resolución del instrumento y un software especial de análisis de datos para identificar las pequeñas diferencias de la curva de fusión que identifican una variante o genotipo. Se pueden observar diferentes tipos de variantes genéticas con diversas frecuencias en el gen específico para pacientes con una enfermedad específica, especialmente cáncer y en el gen CALR en pacientes con neoplasias mieloproliferativas negativas para el cromosoma Filadelfia. Los cambios de nucleótido único, las inserciones y/o deleciones (indels) en el gen de interés pueden ser detectados por el análisis HRM. La identificación de diferentes tipos de variantes genéticas se basa principalmente en los controles utilizados en el ensayo qPCR HRM. Sin embargo, a medida que aumenta la longitud del producto, la diferencia entre las curvas de tipo salvaje y heterocigoto se hace más pequeña, y el tipo de variante genética es más difícil de determinar. Por lo tanto, cuando los indels son la variante genética prevalente esperada en el gen de interés, se puede utilizar un método adicional como la electroforesis en gel de agarosa para la aclaración del resultado de la HRM. En algunos casos, un resultado no concluyente debe volver a verificarse/volver a diagnosticarse mediante la secuenciación estándar de Sanger. En este estudio retrospectivo, aplicamos el método a pacientes JAK2 V617F negativos con MPN.

Introducción

Las variantes genéticas somáticas en el gen de la calreticulina(CALR)fueron reconocidas en 2013 en pacientes con neoplasias mieloproliferativas (MPN) como trombocitemia esencial y mielofibrosis primaria^1,2. Desde entonces, se han descubierto más de 50 variantes genéticas en el gen CALR, induciendo un desplazamiento de marco +1 (−1+2)³. Las dos variantes genéticas CALR más frecuentes son una deleción de 52 pb (NM_004343.3 (CALR):c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)), también llamada mutación tipo 1, y una inserción de 5 pb (NM_004343.3 (CALR):....

Protocolo

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Médica de la República de Eslovenia. Todos los procedimientos se ajustaban a la declaración de Helsinki.

1. PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia (qPCR) y análisis post-qPCR por HRM

1. Imprimaciones resuspend enumeradas en la Tabla de Materiales a 100 μM con H₂O estéril, RNasa y Libre de DNasa (ver Tabla de Materiales). Haga una imprimación de concentración de trabajo de 10 μM. Los cebadores utilizados en el protocolo se publicaron antes^{del 2}.
2. Cuantificar el ADN de los granulocitos mediante e....

Resultados

La región de interés del ADN amplificada con éxito con un aumento exponencial de la fluorescencia que supera el umbral entre los ciclos 15 y 35 y valores muy estrechos del ciclo de cuantificación (Cq) en todas las muestras y controles replicados(Figura 2)es un requisito previo para la identificación fiable de variantes genéticas mediante análisis HRM. Esto se logra mediante el uso de una determinación precisa de ADN con tinción de fluorescencia y una cantidad igual de ADN en el experimento q.......

Discusión

La fusión de ADN de alta resolución es una solución simple para el genotipado y el escaneo de variantes genéticas¹⁴. Depende de las diferencias de secuencia que dan lugar a heterodúplex que cambian la forma de la curva de fusión. Se pueden observar diferentes tipos de variantes genéticas con diversas frecuencias en el gen específico para un determinado grupo de pacientes con cáncer^1,2,15,

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
E-Gel EX 4% Agarose	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G401004
Fuorometer 3.0 QUBIT	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q33216
Invitrogen E-Gel iBase y E-Gel Safe Imager Combo Kit	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X	Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific	4415440	Componentes: AmpliTaqGold 360 ADN polimerasa, colorante HRM comercial MeltDoctor, mezcla de dNTP que incluye dUTP, sales de magnesio y otros componentes tampón, formulados con precisión para obtener resultados óptimos de HRM
MicroAmp Placa de reacción rápida de 96 pocillos (0,1 mL)	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4346907
MicroAmp Película adhesiva óptica	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4311971
NuGenius	Syngene	NG-1045	Gel Sistemas de documentación
Primer CALRex9 Forward	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (Alta pureza, sin sal)
Primer CALRex9 Reverse	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (Alta pureza, sin sal)
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN		51306	Kit de aislamiento de ADN con tampón para la dilución de ADN.
Tubos de ensayo Qubit	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32856
Ensayo QUBIT dsDNA HS	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32854
Trackit 100bp DNA Ladder	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	10488058	Ladder consta de 13 fragmentos individuales con las bandas de referencia a 2000, 1500 y 600 pb.
Sistema de PCR en tiempo real ViiA7	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4453534
Water sin nucleasa	VWR, Life Science	436912C	Agua libre de RNasa, DNasa y proteasa