Detección de variantes genéticas en el gen CALR mediante análisis de fusión de alta resolución

Resumen

El análisis de fusión de alta resolución (HRM) es una solución sensible y rápida para la detección de variantes genéticas. Depende de las diferencias de secuencia que dan lugar a heterodúplex que cambian la forma de la curva de fusión. Al peinar la HRM y la electroforesis en gel de agarosa, se pueden identificar diferentes tipos de variantes genéticas como los indels.

Resumen

El análisis de fusión de alta resolución (HRM) es un método poderoso para el genotipado y el escaneo de variación genética. La mayoría de las aplicaciones de HRM dependen de colorantes de ADN saturados que detectan diferencias de secuencia y heterodúplex que cambian la forma de la curva de fusión. Se necesita una excelente resolución del instrumento y un software especial de análisis de datos para identificar las pequeñas diferencias de la curva de fusión que identifican una variante o genotipo. Se pueden observar diferentes tipos de variantes genéticas con diversas frecuencias en el gen específico para pacientes con una enfermedad específica, especialmente cáncer y en el gen CALR en pacientes con neoplasias mieloproliferativas negativas para el cromosoma Filadelfia. Los cambios de nucleótido único, las inserciones y/o deleciones (indels) en el gen de interés pueden ser detectados por el análisis HRM. La identificación de diferentes tipos de variantes genéticas se basa principalmente en los controles utilizados en el ensayo qPCR HRM. Sin embargo, a medida que aumenta la longitud del producto, la diferencia entre las curvas de tipo salvaje y heterocigoto se hace más pequeña, y el tipo de variante genética es más difícil de determinar. Por lo tanto, cuando los indels son la variante genética prevalente esperada en el gen de interés, se puede utilizar un método adicional como la electroforesis en gel de agarosa para la aclaración del resultado de la HRM. En algunos casos, un resultado no concluyente debe volver a verificarse/volver a diagnosticarse mediante la secuenciación estándar de Sanger. En este estudio retrospectivo, aplicamos el método a pacientes JAK2 V617F negativos con MPN.

Introducción

Las variantes genéticas somáticas en el gen de la calreticulina(CALR)fueron reconocidas en 2013 en pacientes con neoplasias mieloproliferativas (MPN) como trombocitemia esencial y mielofibrosis primaria^1,2. Desde entonces, se han descubierto más de 50 variantes genéticas en el gen CALR, induciendo un desplazamiento de marco +1 (−1+2)³. Las dos variantes genéticas CALR más frecuentes son una deleción de 52 pb (NM_004343.3 (CALR):c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)), también llamada mutación tipo 1, y una inserción de 5 pb (NM_004343.3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)), también llamada mutación tipo 2. Estas dos variantes genéticas representan el 80% de todas las variantes genéticas de CALR. Los otros se han clasificado como tipo 1 o tipo 2 utilizando algoritmos basados en la preservación de una hélice α cercana al tipo salvaje CALR^4. Aquí, presentamos uno de los métodos altamente sensibles y rápidos para la detección de variantes genéticas CALR, el método de análisis de fusión de alta resolución (HRM). Este método permite la detección rápida de variantes genéticas tipo 1 y tipo 2, que representan la mayoría de las mutaciones CALR ⁵. HrM se introdujo en combinación con la »reacción en cadena de la polimerasa« en tiempo real (qPCR) en 1997 como una herramienta para detectar la mutación en el factor V Leiden^6. En comparación con la secuenciación de Sanger que representa la técnica estándar de oro, la HRM es un método más sensible y menos específico⁵. El método HRM es un buen método de cribado que permite un análisis rápido de un gran número de muestras con un gran coste-beneficio⁵. Es un método de PCR simple realizado en presencia de un tinte fluorescente y no requiere habilidades específicas. Otro beneficio es que el procedimiento en sí no daña ni destruye la muestra analizada que nos permite reutilizar la muestra para electroforesis o secuenciación de Sanger después del procedimiento HRM⁷. La única desventaja es que a veces es difícil interpretar los resultados. Además, la HRM no detecta la mutación exacta en pacientes con mutaciones no tipo 1 o tipo 2^8. En estos pacientes, se debe realizar la secuenciación de Sanger (Figura 1).

La HRM se basa en la amplificación de la región específica del ADN en presencia de un colorante fluorescente de ADN saturado, que se incorpora en el ADN de doble cadena (dsDNA). El colorante fluorescente emite luz cuando se incorpora en el dsDNA. Después de un aumento progresivo de la temperatura, el dsDNA se descompone en ADN monocatenario, que se puede detectar en la curva de fusión como una disminución repentina en la intensidad de la fluorescencia. La forma de la curva de fusión depende de la secuencia de ADN que se utiliza para detectar la mutación. Las curvas de fusión de las muestras se comparan con las curvas de fusión de mutaciones conocidas o CALR de tipo salvaje. Las curvas de fusión distintas representan una mutación diferente que no es tipo 1 o tipo 2^9.

El algoritmo para la detección de variantes genéticas somáticas en el gen CALR mediante HRM, electroforesis en gel de agarosa y método de secuenciación(Figura 1)fue utilizado y validado en el estudio retrospectivo publicado antes^{del 10.}

Protocolo

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Médica de la República de Eslovenia. Todos los procedimientos se ajustaban a la declaración de Helsinki.

1. PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia (qPCR) y análisis post-qPCR por HRM

1. Imprimaciones resuspend enumeradas en la Tabla de Materiales a 100 μM con H₂O estéril, RNasa y Libre de DNasa (ver Tabla de Materiales). Haga una imprimación de concentración de trabajo de 10 μM. Los cebadores utilizados en el protocolo se publicaron antes^{del 2}.
2. Cuantificar el ADN de los granulocitos mediante el método de tinción por fluorescencia siguiendo las instrucciones del fabricante¹¹ (ver Tabla de Materiales). Preparar una solución de ADN de 20 ng/μL utilizando 10 mM Tris-Cl, 0,5 mM EDTA, pH 9,0 (ver Tabla de Materiales).
   1. Además de las muestras de ADN, prepare al menos tres controles de ADN: dos controles positivos con el NM_004343.3 (CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46) (deleción de 52 pb o mutación tipo 1) y NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47) (inserción de 5 pb o mutación tipo 2) variante genética, así como ADN de tipo salvaje y control negativo como control sin plantilla (NTC).
      NOTA: Antes de realizar la configuración de HRM, confirme que el instrumento qPCR está calibrado para experimentos de HRM.
3. Prepare qPCR HRM Master Mix de acuerdo con el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de Materiales) dela siguiente manera: 10 μL de 2x qPCR Master Mix con colorante, 0.2 μL de 10 μM Forward Primer, 0.2 μL de 10 μM Reverse Primer, 8.6 μL de estéril, RNasa y DNasa libre de H₂O. Utilice los cebadores de la Tabla de Materiales. Ejecute tres réplicas para cada muestra de ADN y control.
   1. Prepare el qPCR HRM Master Mix de acuerdo con el número de muestras que se procesan. Incluya un exceso de volumen de al menos el 10% en los cálculos para proporcionar un exceso de volumen para la pérdida que se produce durante las transferencias de reactivos.
4. Mezcle el contenido de la reacción golpeando e invirtiendo suavemente el tubo y el vórtice durante 2-3 s. Recoge todas las gotas dispersas desde la pared del tubo hasta la parte inferior con un breve giro.
5. Preparar una placa de reacción apropiada para el instrumento y el experimento hrM (ver Tabla de Materiales). Transfiera 19 μL de la mezcla maestra qPCR HRM a los pocillos apropiados de la placa de reacción óptica de 96 pocillos.
6. Pipeteo 1 μL de los controles negativos, controles positivos y muestras en los pocillos apropiados de la placa de reacción óptica. Para el NTC, transfiera 1 μL de H₂O estéril, libre de RNasa y DNasa utilizado para preparar la mezcla maestra qPCR HRM en lugar de ADN.
7. Selle la placa de reacción con la película adhesiva óptica. Hazlo con firmeza para evitar la evaporación durante la carrera. Compruebe que la película adhesiva óptica esté plana a través de todos los pocillos de la placa de reacción para garantizar la correcta detección de fluorescencia.
8. Gire la placa de reacción a 780 x g a temperatura ambiente (RT) durante 1 minuto. Compruebe que el líquido está en el fondo de los pocillos en la placa de reacción. Proceda a ejecutar el ensayo.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Conservar la placa a 4 °C durante un máximo de 24 h. Deje que la placa almacenada a 4 °C se caliente a RT y luego gire la placa brevemente antes de ejecutarla.
9. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, prepare y comience la ejecución para amplificar y fundir el ADN y generar datos de fluorescencia HRM en el instrumento qPCR. En el software del sistema de instrumentos, asigne los controles y las muestras a los pozos apropiados.
10. Para la detección de variantes genéticas CALR, cambie el protocolo de amplificación del instrumento predeterminado y amplifique el ADN utilizando el siguiente protocolo de ciclo térmico: 95 °C durante 10 minutos, seguido de 50 ciclos de 95 °C durante 10 s y 62,5 °C durante 60 s.
11. Realice la etapa de curva de fusión/disociación (HRM) inmediatamente después de qPCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante¹² de la siguiente manera: 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 1 min, y luego una velocidad de rampa de 0.025 °C/s hasta 95 °C. Mantenga la temperatura a 95 °C durante 15 s y a 60 °C durante 15 s.
12. La ejecución finaliza automáticamente. Primero, revise y verifique la gráfica de amplificación(Figura 2).
13. En el menú de experimento del software del sistema de instrumentos, seleccione la opción de gráfico de amplificación. Si no se muestra ningún dato, haga clic en el botón verde Analizar.
    1. En la pestaña gráfica de amplificación, en el menú desplegable Tipo de gráfica, seleccione la gráfica que muestra los datos de amplificación como las lecturas de fluorescencia sin procesar normalizadas a la fluorescencia de la referencia pasiva (ΔRn) en función del número de ciclo (ΔRn vs Ciclo). En el menú desplegable Color de trazado, seleccione Ejemplo.
14. En el menú desplegable Tipo de gráfico, seleccione el tipo de gráfico de amplificación lineal. Para mostrar el ciclo de inicio y fin de la línea base en el gráfico de amplificación lineal, seleccione la opción de inicio de la línea base. Compruebe que la línea base está configurada correctamente. El ciclo final debe establecerse unos pocos ciclos antes del número de ciclo donde se detecta una señal fluorescente significativa. La línea de base generalmente se establece de 3 a 15 ciclos(Figura 2).
15. En el menú desplegable Tipo de gráfico, seleccione el tipo de gráfico de amplificación log10. Muestre la línea de umbral en el gráfico seleccionando la opción de umbral. Ajuste el umbral en consecuencia si no se establece correctamente. El umbral establecido correctamente significa que la línea de umbral cruza la fase exponencial de las curvas qPCR (Figura 2).
16. Verifique que las curvas de amplificación normales estén en todos los pozos de control positivo y de muestra. Verifique que no haya amplificación en los pozos NTC antes del ciclo 40. Una gráfica de amplificación normal muestra un aumento exponencial de la fluorescencia que supera el umbral entre los ciclos 15 y 35(Figura 2). Excluya los pozos de muestra del análisis si no hay amplificación en la posición del pozo.
    NOTA: Si la gráfica de amplificación parece anormal o el NTC indica bien la amplificación, identifique y resuelva el problema de acuerdo con la guía de solución de problemas del fabricante.
17. Excluya el valor atípico con el valor del ciclo de cuantificación (Cq) que difiere de las réplicas por más de 2 en el software del sistema de^{instrumentos 12}. Los valores atípicos pueden producir resultados erróneos de HRM.
18. En las curvas de fusión derivadas, revise las regiones/líneas de temperatura previas y posteriores a la fusión. Las regiones previas y posteriores a la fusión deben estar dentro de un área plana donde no haya grandes picos o pendientes en los niveles fluorescentes (Figura 3). Si es necesario, ajústelo en consecuencia. Configure el inicio y la parada de las líneas de temperatura previas y posteriores a la fusión con una separación de aproximadamente 0,5 °C entre sí (Figura 3). Reinicie el análisis si los parámetros se ajustan haciendo clic en el botón Analizar.
19. En la pestaña de gráfico de diferencia, en la pestaña configuración del gráfico, elija uno de los controles de tipo salvaje (homocigoto) que se replica como ADN de referencia y reinicie el análisis haciendo clic en el botón Analizar.
20. En la pestaña Curvas de fusión alineadas, confirme que todos los controles positivos tienen el genotipo correcto y que NTC no pudo amplificarse(Figura 4). En la tabla de pozos, seleccione los pozos que contienen un control positivo para resaltar la curva de fusión correspondiente en los gráficos de análisis. Confirme que el color de la línea corresponde al genotipo correcto. Repita los pasos para los pozos que contienen los otros controles positivos y NTC.
21. En la pestaña Curvas de fusión alineadas, revise cuidadosamente las visualizaciones de trazado para los ejemplos desconocidos y compárelos con los gráficos para los controles (Figura 4). En la tabla de pozos, seleccione los pozos que contienen las réplicas de muestras desconocidas, verifique el color de la curva de fusión y alinee con los controles en una secuencia ordenada seleccionando los pozos que contienen controles positivos uno por uno. Repita el proceso para todas las muestras desconocidas.
    NOTA: La muestra desconocida contiene la variante de uno de los controles si su curva de fusión está estrechamente alineada con ella. Se podrían mostrar diferentes grupos de variantes (diferentes colores) que indican que la muestra desconocida consiste en una variante desconocida, que no corresponde a los controles (Figura 8). Un nivel bajo de la variante genética somática puede estar presente en la muestra del paciente. Esto podría influir en la interpretación del resultado de la HRM, particularmente en el límite de detección del ensayo (Figura 9). En estos casos, el color o incluso la forma de la línea podrían parecerse mucho a la del genotipo de tipo salvaje.
    1. Cuando el resultado no sea concluyente, combine los resultados de hrM con los resultados de la electroforesis en gel de agarosa y los métodos de secuenciación. Vuelva a probar la muestra o solicite y vuelva a probar una nueva muestra si es necesario.
    2. Revise cuidadosamente el conjunto de datos para las curvas de réplica y verifique que la alineación de cada réplica dentro del grupo sea ajustada. Excluya la réplica si no se alinea estrechamente con las otras muestras del grupo (valor atípico). Vuelva a probar la muestra si hay más valores atípicos presentes y los resultados no son concluyentes. Tenga en cuenta que la cantidad y la calidad de la muestra de ADN influyen en los resultados de la HRM.
22. Analice el resultado de la muestra desconocida en la ficha Gráfica de diferencia. Repita el procedimiento descrito en el paso 1.21 y compruebe que los resultados obtenidos para la muestra desconocida son los mismos.
23. Luego, ejecute los productos qPCR HRM en el gel de agarosa.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Guarde la placa a 4 °C durante no más de 24 horas o a -20 °C durante un período de tiempo más largo, pero no más de 7 días. Deje que la placa almacenada a 4 °C se caliente a RT y luego gire la placa brevemente antes de ejecutarla. Deje que la placa almacenada a - 20 ° C se descongele y se caliente a RT, y luego gire la placa brevemente antes de ejecutarla.

2. Electroforesis en gel de agarosa

1. Ejecute los productos qPCR HRM en un gel prefabricado de agarosa al 4% que contenga una tinción fluorescente de ácido nucleico utilizando el sistema de electroforesis en gel apropiado (consulte la Tabla de materiales, Figura 5). Ejecute solo una réplica positiva, negativa, NTC y qPCR HRM de muestra.
   NOTA: Siempre se deben usar guantes al manipular geles. Cualquier otro sistema de electroforesis en gel puede cumplir este propósito si se elige el porcentaje equivalente de agarosa, la tinción de ácido nucleico fluorescente y el formato del pozo.
2. Ejecute el sistema de electroforesis en gel de acuerdo con el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Retire el gel prefabricado en el cassette del paquete, retire el peine e insértelo en el aparato de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Cargue el gel dentro de los 15 minutos posteriores a la apertura del paquete.
3. Diluir una muestra de 10 μL a 20 μL con H₂O estéril, RNasa y libre de DNasa. Cargar cada pozo con 20 μL de muestra diluida.
4. Diluir 3 μL de solución estándar de tamaño de ADN a 20 μL con H₂O estéril, libre de RNasa y DNasa (ver Tabla de Materiales). Cargue el pozo M con 20 μL de solución estándar de tamaño de ADN diluido (Figura 6).
5. Llene los pocillos vacíos con 20 μL de H₂O estéril, libre de RNasa y DNasa.
6. Seleccione inmediatamente el programa de acuerdo con el porcentaje del gel que se está ejecutando y establezca el tiempo de ejecución en el aparato en 10 minutos.
7. Inicie la electroforesis dentro de 1 minuto de la carga de la muestra presionando el botón GO. El tiempo de electroforesis puede extenderse si no se obtiene una resolución suficiente.
   NOTA: No exceda el tiempo máximo recomendado de funcionamiento de la electroforesis de agarosa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
8. Cuando se complete la electroforesis, visualice el ADN en el gel utilizando una luz azul o transiluminación UV. La visualización, el análisis y el almacenamiento de las imágenes de electroforesis se realizan principalmente mediante un generador de imágenes de gel con sistema de fotodocumentación(Figura 5).
9. Analizar e interpretar el patrón de gel de productos qPCR HRM visualizado comparando los resultados de la muestra desconocida con los controles positivos(Figura 7 y Figura 8).
10. Si los resultados desconocidos de la muestra hrM y electroforesis en gel indican que existe una variante genética desconocida, secuenciar el producto qPCR HRM utilizando cebadores descritos en la Tabla de materiales de acuerdo con el protocolo descrito¹³.
    PRECAUCIÓN: Los geles de agarosa que contienen una mancha fluorescente de ácido nucleico deben eliminarse adecuadamente según las regulaciones de la institución.

Resultados

La región de interés del ADN amplificada con éxito con un aumento exponencial de la fluorescencia que supera el umbral entre los ciclos 15 y 35 y valores muy estrechos del ciclo de cuantificación (Cq) en todas las muestras y controles replicados(Figura 2)es un requisito previo para la identificación fiable de variantes genéticas mediante análisis HRM. Esto se logra mediante el uso de una determinación precisa de ADN con tinción de fluorescencia y una cantidad igual de ADN en el experimento q...

Discusión

La fusión de ADN de alta resolución es una solución simple para el genotipado y el escaneo de variantes genéticas¹⁴. Depende de las diferencias de secuencia que dan lugar a heterodúplex que cambian la forma de la curva de fusión. Se pueden observar diferentes tipos de variantes genéticas con diversas frecuencias en el gen específico para un determinado grupo de pacientes con cáncer^1,2,15,

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
E-Gel EX 4% Agarose	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G401004
Fuorometer 3.0 QUBIT	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q33216
Invitrogen E-Gel iBase y E-Gel Safe Imager Combo Kit	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X	Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific	4415440	Componentes: AmpliTaqGold 360 ADN polimerasa, colorante HRM comercial MeltDoctor, mezcla de dNTP que incluye dUTP, sales de magnesio y otros componentes tampón, formulados con precisión para obtener resultados óptimos de HRM
MicroAmp Placa de reacción rápida de 96 pocillos (0,1 mL)	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4346907
MicroAmp Película adhesiva óptica	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4311971
NuGenius	Syngene	NG-1045	Gel Sistemas de documentación
Primer CALRex9 Forward	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (Alta pureza, sin sal)
Primer CALRex9 Reverse	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (Alta pureza, sin sal)
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN		51306	Kit de aislamiento de ADN con tampón para la dilución de ADN.
Tubos de ensayo Qubit	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32856
Ensayo QUBIT dsDNA HS	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32854
Trackit 100bp DNA Ladder	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	10488058	Ladder consta de 13 fragmentos individuales con las bandas de referencia a 2000, 1500 y 600 pb.
Sistema de PCR en tiempo real ViiA7	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4453534
Water sin nucleasa	VWR, Life Science	436912C	Agua libre de RNasa, DNasa y proteasa