El objetivo de este protocolo es demostrar cómo preparar muestras de cristalografía en serie para la recopilación de datos en un inyector viscoso alto, Lipidico, recientemente encargado en el sincrotrón australiano.
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Artículo de método
Protocolo de inyección lipídica para mediciones de cristalografía en serie en el sincrotrón australiano
En este artículo
Resumen
Resumen
Se ha desarrollado una instalación para realizar mediciones de cristalografía en serie en el sincrotrón australiano. Esta instalación incorpora un inyector de alto viscoso construido específicamente, Lipidico, como parte de la línea de haz de cristalografía macromolecular (MX2) para medir un gran número de pequeños cristales a temperatura ambiente. El objetivo de esta técnica es permitir que los cristales se cultieran/transfieran a jeringas de vidrio para ser utilizados directamente en el inyector para la recopilación de datos de cristalografía en serie. Las ventajas de este inyector incluyen la capacidad de responder rápidamente a los cambios en el caudal sin interrupción de la corriente. Existen varias limitaciones para este inyector de alta viscosidad (HVI) que incluyen una restricción a las viscosidades de muestra permitidas a >10 Pa.s. La estabilidad de la secuencia también puede ser un problema en función de las propiedades específicas del ejemplo. Aquí se presenta un protocolo detallado sobre cómo configurar muestras y utilizar el inyector para mediciones de cristalografía en serie en el sincrotrón australiano. El método demuestra la preparación de la muestra, incluyendo la transferencia de cristales de liozima a un medio viscoso alto (grasa de silicona), y el funcionamiento del inyector para la recolección de datos en MX2.
Introducción
La cristalografía en serie (SX) es una técnica que se desarrolló inicialmente en el contexto de láseres electrónicos libres de rayos X (XFELs)1,2,3,4. Aunque los enfoques de destino fijos se pueden utilizar para SX5,6,7, normalmente, los sistemas de inyectores se emplean para entregar cristales en un flujo continuo al haz de rayos X. Debido a que combina datos de un gran número de cristales, SX evita la necesidad de cualquier alineación de cristal d....
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Protocolo
1. Preparación de cristales en un medio viscoso alto utilizando jeringas de vidrio
- Centrífuga la solución de cristal suavemente (~ 1,000 x g, ~ 10 min a 22 °C) para formar un pellet de cristal suave y eliminar el exceso de búfer. Esto dará lugar a una alta concentración de cristales en el pellet que se puede utilizar para la recopilación de datos.
NOTA: Para evitar la dilución del medio viscoso aumentar la concentración de cristal en este paso. Optimice la relación entre el medio viscoso y el volumen de cristal para cada muestra para obtener una alta concentración de cristales manteniendo una alta viscosidad para los medios. Centrífuga la solució....
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Resultados
Lipidico es un HVI construido como un sistema de entrega alternativo para su uso en MX2 (Figura 1). Es ideal para SX, donde los cristales se cultivan en fase cúbica lipídica o se transfieren a un medio inerte viscoso alto.
Para demostrar la aplicación del inyector, la grasa de silicona mezclada con cristales de liozima se utilizó para recopilar datos SX en la línea de haz MX2 en el sincrotrón australiano. Para montar el inyector en la línea de haz MX2, la boquilla.......
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Discusión
Se ha desarrollado un HVI alternativo, ideal para llevar a cabo experimentos SX en fuentes sincrotrón. Tiene dos ventajas clave sobre los HVIs existentes. En primer lugar, es fácil de instalar en la línea de haz que permite el cambio rápido entre la cristalografía convencional y SX, sólo ~ 30 minutos es necesario para la instalación y alineación en MX2. En segundo lugar, las jeringas de muestra utilizadas para cultivar cristales se pueden utilizar directamente como reservorios para inyección, lo que limita el desperdicio.......
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Divulgaciones
MK trabaja para diseños de Kusel. Kusel Design, un desarrollador de dispositivos de laboratorio personalizado, fue contratado por el Dr. Peter Bentsen de la Universidad La Trobe y el Dr. Tom Caradoc-Davies de ANSTO y para desarrollar un dispositivo de bajo costo para permitir estudios de alto viscoso en la línea de haz MX2 en el Sincrotrón Australiano. El dispositivo fue desarrollado en estrecha consulta con el Dr. Caradoc-Davies. Los autores no tienen intereses financieros competidores.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Centro de Excelencia en Imágenes Moleculares Avanzadas (CE140100011) del Consejo Australiano de Investigación (http://www.imagingcoe.org/). Esta investigación se llevó a cabo en parte utilizando la línea de haz MX2 en el Sincrotrón Australiano, parte de ANSTO, y hizo uso del detector de la Fundación Australiana de Investigación del Cáncer (ACRF).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Lisozima de clara de huevo de gallina | Sigma-Aldrich | L6876 | Se utiliza para cultivar cristales para probar el inyector y los cristales se transfieren a la grasa de silicona. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Grasa de silicona de alto vacío | Dow Corning | Z273554-1EA | Se utiliza para probar el inyector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Aguja inyectora (108 µ m ID) | Nº | de pieza de Hamilton: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Jeringas herméticas de vidrio, 100 y micro; l | Nº | de pieza de Hamilton: 7656-01 | Jeringas utilizadas para la inyección de muestras. www.hamiltoncompany.com |
| Acoplador de jeringa LCP | Formulatrix | 209526 | Acoplador de jeringa para mezclar las muestras |
| Inyector lipídico | La Trobe Univerity/ANSTO | Se trata de un equipo específico al que se puede acceder a través de la Universidad de La Trobe / ANSTO Instalación Australiana de Sincrotrón |
Referencias
- Boutet, S., et al. High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography. Science. 337 (6092), 362-364 (2012).
- Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. N. X-ray lasers for structural and dynamic biology. Reports on Pro....
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Reimpresiones y permisos
