Análisis clonal del corazón de ratón neonatal utilizando el modelado del vecino más cercano

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para utilizar el rastreo de linaje multicolor y el modelado del vecino más cercano para identificar cardiomiocitos derivados clonalmente durante el crecimiento y la regeneración en ratones. Este enfoque es objetivo, funciona en diferentes condiciones de etiquetado y se puede adaptar para incorporar una variedad de canalizaciones de análisis de imágenes.

Resumen

Al reemplazar el miocardio perdido o disfuncional, la regeneración de tejidos es un enfoque prometedor para tratar la insuficiencia cardíaca. Sin embargo, el desafío de detectar la regeneración cardíaca de buena fe limita la validación de posibles factores regenerativos. Un método para detectar nuevos cardiomiocitos es el rastreo de linaje multicolor con análisis clonal. Los experimentos de análisis clonal pueden ser difíciles de llevar a cabo, porque las condiciones de etiquetado que son demasiado escasas carecen de sensibilidad para eventos raros como la proliferación de cardiomiocitos, y el etiquetado difuso limita la capacidad de resolver clones. Aquí se presenta un protocolo para llevar a cabo el análisis clonal del corazón de ratón neonatal mediante el uso de modelos estadísticos de las distribuciones de los vecinos más cercanos para resolver los clones de cardiomiocitos. Este enfoque permite la resolución de clones en una variedad de condiciones de marcaje y proporciona un enfoque analítico sólido para cuantificar la proliferación y regeneración de cardiomiocitos. Este protocolo se puede adaptar a otros tejidos y puede ser ampliamente utilizado para estudiar la regeneración de tejidos.

Introducción

Una característica histológica de la insuficiencia cardíaca es la pérdida de cardiomiocitos (CM), ya sea después de una lesión, senescencia o apoptosis¹. La reposición del miocardio perdido o disfuncional a través de la regeneración de tejidos representa una estrategia terapéutica potencial para curar a los pacientes con insuficiencia cardíaca. En las últimas décadas, los avances seminales en biología del desarrollo y regenerativa han desenterrado una capacidad limitada del corazón de los mamíferos para reponer los CM^perdidos 2,3,4,5. Este emocionante trabajo ha planteado la posibilidad de que los mecanismos innatos de crecimiento puedan desplegarse para la regeneración. Debido a que las respuestas regenerativas innatas están funcionalmente ausentes en el corazón de los mamíferos adultos, se necesitan métodos para mejorar la robustez de la reparación endógena para que se logre la regeneración terapéutica del corazón.

Los mecanismos para la regeneración innata del corazón parecen estar conservados en todas las especies. Después de una lesión, las MC preexistentes proliferan para generar nuevas CM en el pez cebra ^6,7, los tritones ^8,9, los ratones ^4,10, las ratas¹¹ y los cerdos^12,13. En consecuencia, muchos grupos están tratando de identificar mitógenos capaces de promover la miocardiogénesis. Sin embargo, este tipo de trabajo es un reto. La tarea de conseguir que los MC de los mamíferos adultos proliferen no solo es desalentadora, sino que es difícil ser capaz de identificar eventos proliferativos raros ^1,14. El reto de identificar las MC cíclicas raras se ve agravado por la tendencia de las MC de mamíferos adultos a sufrir endomitosis preferentemente. Por ejemplo, después de una lesión en el corazón del ratón, casi el 25% de los CM en la zona fronteriza vuelven a entrar en el ciclo celular, pero solo el 3,2% de los CM se dividen⁴. Debido a que la mayoría de las MC cíclicas duplican su genoma pero no se someten a la citocinesis, el simple hecho de intentar un aumento en el número de MC cíclicas es ambiguo para la cardiomiogénesis genuina. Por lo tanto, los ensayos para la incorporación de nucleósidos por las MC o para la presencia de marcadores proliferativos en las MC pueden no indicar completamente la regeneración. A medida que surgen más factores candidatos para la regeneración del corazón, se necesitan ensayos para identificar mejor la hiperplasia de MC.

El análisis clonal mediante el rastreo de linaje es un enfoque valioso para el ensayo de la miogénesis porque permite la visualización directa de las células y su progenie. Los enfoques tradicionales para el análisis clonal implican el marcaje poco frecuente de células individuales con un gen reportero. Sin embargo, el rastreo del linaje de un solo color de las células raras puede tener un valor limitado para eventos poco frecuentes, como la proliferación de MC, porque las posibilidades de etiquetar una MC en proliferación son bajas¹⁵. Alternativamente, el rastreo de linaje multicolor puede aumentar la sensibilidad para el análisis clonal¹⁶. En resumen, las células individuales se marcan genéticamente con una de varias proteínas fluorescentes al azar, de modo que las células en proliferación generarán grupos de células de color homogéneo que se pueden resolver a partir de las células fluorescentes vecinas. Este método se ha utilizado para rastrear el crecimiento a través de una variedad de órganos, y se ha aplicado más recientemente a los estudios de la regeneración del corazón en mamíferos^17,18. Si bien el rastreo de linaje multicolor puede detectar la expansión clonal de las MC en las etapas embrionarias y neonatales, las respuestas regenerativas innatas no se detectan fácilmente en el corazón del ratón adulto después de una lesión cardíaca^17,19. Un enfoque para mejorar la sensibilidad del rastreo de linaje multicolor sería aumentar el nivel de etiquetado y aumentar la probabilidad de visualizar eventos raros. Sin embargo, un etiquetado más amplio se produce a costa de no poder distinguir las células marcadas de manera similar como derivadas de un ancestro común frente a las células que se marcaron de forma independiente con el mismo fluoróforo. Aquí se presenta un protocolo que utiliza el modelado del vecino más cercano para identificar CM relacionados clonalmente en el corazón de ratón neonatal. Este método es imparcial, cuantitativo y funciona en una variedad de condiciones de etiquetado.

Protocolo

Todos los procedimientos para el manejo de ratones, la realización de cirugías de supervivencia y la extracción de corazones requieren la aprobación de un comité institucional local de uso de animales.

1. Ratones para el análisis clonal de CMs

1. Cruce ratones Myh6-MerCreMer ²⁰ con ratones Gt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw ratones 21} para generar ratones Myh6-MerCreMer; R26R-Ratones bitransgénicos arco iris.
   1. Mantener las existencias de ratones homocigotos para el alelo R26R-Rainbow y cruzarlos con ratones heterocigotos para el alelo Myh6-MerCreMer, de modo que todos los experimentos se realicen en ratones heterocigotos para el alelo R26R-Rainbow. Alternativamente, use ratones homocigotos para el alelo R26R-Rainbow para aumentar la diversidad de colores, pero esto requerirá un sistema de imágenes que pueda discriminar fielmente los fluoróforos EGFP, mCerulean, mOrange y mCherry.
2. Realizar el genotipado en el momento de la recolección del corazón.
   NOTA: Los ratones Myh6-MerCreMer expresan una recombinasa Cre inducible por tamoxifeno en CM y se pueden genotipificar utilizando los cebadores de PCR CGTACTGACGGTGGGAGAAT (Cre-F) y GTGGCAGATGGCGCGGCAACA (Cre-R) para generar un producto de 200 pares de bases (pb). Los ratones R26R-Rainbow expresan constitutivamente EGFP, pero expresarán estocásticamente mCerulean, mOrange o mCherry después de la recombinación mediada por Cre. R26R-Rainbow se puede genotipificar con los cebadores de PCR CTCTGCTGCCTCCTGGCTTCT (R26-F), CGAGGCGATCACAAGCAATA (R26-R) y TCAATGGGCGGGGGTCGTT (Rainbow-R). El alelo de tipo salvaje da un producto de 350 pb y el alelo arcoíris da un producto de 250 pb.

2. Criolesión y marcaje de cardiomiocitos

1. Realizar criolesiones como se describió anteriormente con modificaciones menores^22,23. Coloque con cuidado ratones de un día de edad (P1) sobre un lecho de hielo picado durante 3 minutos para inducir un paro cardíaco. Confirme la anestesia adecuada realizando un pinzamiento de los dedos del pie sin retirada reflexiva.
   NOTA: El momento de la anestesia es crítico. La supervivencia puede verse afectada si los ratones se enfrían durante demasiado tiempo. Además, la edad de los ratones es fundamental. La capacidad regenerativa disminuye bruscamente a lo largo de la primera semana de vida¹⁰.
2. Coloque al cachorro anestesiado sobre una compresa fría y bajo el objetivo de un microscopio de disección quirúrgica. Utilice microtijeras de 6 mm para realizar una toracotomía entre la 4ª y la 5ª costilla para exponer la superficie anterior del corazón.
3. Usando una criosonda enfriada en nitrógeno líquido, coloque la sonda en el ventrículo izquierdo durante 1-2 s. En el caso de lesiones simuladas, realice una toracotomía sin criolesión.
   NOTA: La duración de la criolesión determina el alcance de la lesión. Las lesiones prolongadas disminuirán las tasas de supervivencia.
4. Cierre la incisión con una sutura de polipropileno 6-0 unida a una aguja de 0,15 mm de diámetro.
5. Calentar al cachorro rápidamente y estimularlo manualmente para reanudar el flujo sanguíneo. Una vez que el cachorro se mueva espontáneamente, colóquelo sobre una almohadilla térmica.
6. Inyectar a las crías recuperadas 20 μg de tamoxifeno por vía intraperitoneal. En este punto, inyecte analgésicos, como bupivacaína al 0,25% a lo largo de la línea de sutura, si es necesario. Devuelve a los cachorros a la madre.
   NOTA: Los cachorros de una misma camada se recuperan juntos y se devuelven juntos a la madre. Este flujo de trabajo mejora la supervivencia y la reaceptación de la basura por parte de la madre.

3. Extracción de corazones y procesamiento para análisis histológico

1. Coseche corazones a los 20 días después de la lesión (dpi) o al día postnatal (P21), ya que las respuestas regenerativas se pueden observar en este punto^{de tiempo 10}. Primero se sacrifica a los ratones en una cámara de inhalación de CO₂ y luego se transfiere a un microscopio quirúrgico.
   NOTA: La eutanasia debe realizarse de acuerdo con las directrices institucionales para el uso de animales.
2. Una vez que se confirme la presencia de anestesia suficiente, se realiza una doble toracotomía con microtijeras quirúrgicas para exponer el corazón. Luego, perfunda el corazón con 1 mL de KCl 1 M, 1 mL de paraformaldehído al 4% y 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   NOTA: Es necesario un lavado adecuado para limitar los coágulos de sangre intraventriculares que pueden causar autofluorescencia durante la adquisición de imágenes.
3. Después de la perfusión, diseccionar el corazón y colocarlo en un tubo que contenga al menos 1 mL de PBS.
4. Utilice un microscopio de disección para recortar los corazones con el fin de optimizar la incrustación. Una rebanada horizontal debajo del atrio proporciona una buena superficie para incrustar los corazones para secciones de eje corto.
   NOTA: Alternativamente, se puede cortar transversalmente el corazón si se desean secciones de eje largo.
5. Coloque los corazones recortados en 1 mL de sacarosa al 30% (peso/vol) a 4 °C durante 12–18 h. Retire las muestras de la solución de sacarosa. Incruste el tejido recortado en bloques utilizando medios de congelación de tejidos.
6. Congele rápidamente el tejido incrustado en hielo seco y almacene los bloques a -80 °C.
7. Seccionar bloques de corazón entero congelados en secciones de 10 μm con un criostato, montarlos en portaobjetos cargados y almacenarlos a -20 °C. Divide los corazones en serie en 10 diapositivas. Esto se hace montando una sección en cada una de las 10 diapositivas antes de volver a la primera diapositiva para agregar otra sección. Esta estrategia limita la posibilidad de capturar los mismos CM en varias secciones de una diapositiva determinada.
   NOTA: Tenga cuidado de limitar la exposición a la luz para evitar la pérdida de fluorescencia.
8. Cuando esté listo para la toma de imágenes, descongele los portaobjetos y rehidrátelos en PBS. Agregue un medio de montaje anti-decoloración antes de aplicar un cubreobjetos de vidrio # 1.5. Guarde los portaobjetos en un recipiente tapado a 4 °C.
   NOTA: Para conocer los resultados esperados de la criolesión, se dirige al lector a trabajos previos sobre este tema²³. Las secciones cardíacas tienen altos niveles de autofluorescencia. El uso de agentes de enfriamiento, como Sudan Black, antes de la aplicación de un cubreobjetos puede ayudar a mitigar la autofluorescencia. Sin embargo, se debe tener precaución para evitar enfriar los fluoróforos de interés.

4. Imágenes

NOTA: Los pasos a continuación se aplican al uso de un microscopio comercial (consulte la Tabla de materiales) que tenga un sistema de fluorescencia de campo amplio vertical con cubos de filtro equipados para discriminar fluoróforos mCerulean, EGFP, mOrange y mCherry, y el software asociado con esta configuración (consulte la Tabla de materiales). Los pasos adicionales variarán según el sistema de imágenes exacto que se utilice.

1. Visualice toda la diapositiva con un aumento de 5x con solo el filtro GFP para crear un mapa de diapositivas.
2. Seleccione secciones individuales en el mapa de diapositivas que estén intactas y con autofluorescencia limitada para la obtención de imágenes. Debido al corte en serie en conjuntos de 10 portaobjetos, las secciones adyacentes estarán separadas por al menos 100 μm, lo que impide la obtención de imágenes de los mismos CM.
3. Realice imágenes de escaneo de mosaicos para las secciones individuales utilizando un objetivo 20x con los filtros mCerulean, mOrange, mCherry y EGFP. En la Figura 1 se muestran imágenes representativas.
4. Guarde las imágenes en un formato que permita recuperar la información de cada canal. Tenga cuidado de nombrar los archivos en un formato que permita identificar el corazón, el fluoróforo y la posición de la sección dentro del corazón. Se requiere un enfoque sistemático de nomenclatura para los pasos computacionales que se indican a continuación.

5. Análisis de imágenes para identificar CMs marcados

1. Seleccione las secciones con imágenes que están intactas de cada conjunto y distribúyalas aleatoriamente a todos los screeners. Asegúrese de que los filtros cumplan con los siguientes pasos para cada imagen.
2. Para cada canal (mCerulean, mOrange y mCherry), utilice la herramienta "Balance de color" de ImageJ²⁴ para ajustar el brillo y el contraste de la imagen y ayudar al usuario a identificar las celdas etiquetadas.
   NOTA: ImageJ es una herramienta gratuita de análisis de imágenes que se puede descargar desde https://imagej.net. Este protocolo utiliza la versión 2.0.0-rc-69/1.52i.
3. En ImageJ, seleccione 'Establecer mediciones' en el menú desplegable 'Analizar '. En la ventana que se abre, seleccione 'Área | Centro de masa | Rectángulo delimitador | Límite al umbral».
   NOTA: El módulo de sustracción de imagen a veces se puede utilizar para mejorar la señal de fluoróforo en relación con la autofluorescencia de fondo. Sin embargo, si se realiza, la resta debe realizarse sistemáticamente para todas las imágenes de un conjunto de datos.
4. Con la imagen de interés abierta, seleccione 'Herramientas' y luego seleccione 'Administrador de ROI' en el menú desplegable 'Analizar'. Se abrirá la ventana 'Administrador de ROI'.
5. Seleccione la herramienta "Selecciones a mano alzada" de la barra de herramientas de ImageJ y trace la celda de interés (Figura 2A). Una vez trazado, presione 't' o use el botón 'Agregar [t]' en la ventana 'Administrador de ROI' (Figura 2B). Repita el procedimiento para todas las celdas de un solo canal.
   NOTA: La segmentación y el ROI deben realizarse para cada canal por separado.
6. Una vez que se hayan seleccionado todas las celdas de un canal determinado, guarde el ROI como un archivo .zip. Para ello, selecciona primero "Deseleccionar" en la ventana "Administrador de ROI" para asegurarte de que no se resalte ningún ROI. A continuación, haz clic en la pestaña "Más" de la ventana "Gestor de ROI" y selecciona la opción "Guardar". Esto abrirá el navegador de escritorio, donde los ROI se guardan como un archivo .zip.
7. Exporte las mediciones de cada uno de los ROI como un archivo .csv. Para hacer esto, asegúrese de que no se resalte un solo ROI, nuevamente seleccionando 'Deseleccionar' y luego seleccione 'Medir' en la ventana 'Administrador de ROI'. Esto abrirá una nueva ventana de 'Resultados' con todas las mediciones seleccionadas anteriormente.
8. En la ventana "Resultados", seleccione "Archivo" y, a continuación, seleccione "Guardar como" en el menú desplegable (Figura 2C). Esto abrirá una vez más el navegador de escritorio, de modo que el archivo se pueda guardar en el formato .csv.
   NOTA: Asegúrese de guardar el ROI y las mediciones antes de pasar a segmentar el siguiente canal.
9. Tenga cuidado de nombrar los archivos en un formato que permita identificar el corazón, el canal y la posición de la sección dentro del corazón. Por ejemplo, 'HeartType#_Set#_Section#_Channel' (por ejemplo, 'CI-1_Set4_S3_mOrange.zip' para los ROI y 'CI-1_Set4_S3_mOrange.csv' para las mediciones correspondientes).
   NOTA: El código siguiente asume la convención de nomenclatura anterior. Una convención de nomenclatura diferente requerirá la modificación del código.

6. Análisis estadístico

NOTA: Las células que portan el mismo fluoróforo son una mezcla de células derivadas clonalmente (parentesco) y células no relacionadas que se sometieron a un evento de recombinación aleatorio para expresar el mismo fluoróforo (no parentesco). Sobre la base de datos anteriores¹⁷, se supone que las células parentales tienen una proximidad física más cercana que las células no emparentadas que expresan el mismo fluoróforo. Por lo tanto, las células parentales y no parentales se pueden diferenciar en función de un umbral de distancia. Sin embargo, para determinar el umbral, es necesario desconvolucionar las distribuciones de vecinos más cercanos para las células parentales y no parentales. Afortunadamente, las distribuciones de vecinos más cercanos para células no parentales se pueden estimar evaluando los valores de vecino más cercano de cada célula a la célula más cercana que lleva un fluoróforo diferente. Aquí, se presenta la metodología para determinar estadísticamente una distancia umbral para definir la clonalidad y para asignar una probabilidad de parentesco entre las células.

1. Usando los archivos .csv obtenidos de la sección 5, calcule las distancias de vecino más cercanas para cada celda dentro de un corte de corazón. Compile estos resultados en distancias dentro del canal (mCerulean-mCerulean, mOrange-mOrange y mCherry-mCherry) y entre canales (mCerulean-mOrange, mOrange-mCherry y mCherry-mCerulean). Guarde los resultados en dos archivos .csv: uno para las distancias dentro del canal y otro para las distancias entre canales.
   1. Instale el código de Python²⁵ que requiere las bibliotecas numpy y pandas.
      > pip install numpy; pip install pandas
   2. Calcule distancias y exporte archivos de .csv para distancias dentro del canal y distancias entre canales utilizando snippet_6_1.py de python.
2. Lea las distancias dentro del canal y entre canales en una trama de datos R²⁶ , convirtiendo los identificadores cardíacos en una variable categórica. Aplique un umbral elegido ad-hoc observando los histogramas del vecino más cercano (Figura 3A,C) para minimizar los valores atípicos. Asegúrese de elegir un umbral que cubra más del 90% de las distancias entre canales y dentro del canal, excluyendo al mismo tiempo la cola larga para evitar el sobreajuste al ruido a grandes distancias de vecino más cercano. Este protocolo utiliza un umbral de 400 μm (Figura 3). Utilice Rscript snippet_6_2.R para ejecutar este paso.
   NOTA: Alternativamente, se pueden modelar múltiples segmentos como variables individuales. Este protocolo limita la complejidad del modelo al nivel del corazón para facilitar el modelado y la estimación.
3. Obtenga los logaritmos naturales para las distancias dentro del canal y entre canales. Debido a que las celdas son entidades no puntuales que ocupan espacio, la distribución mínima de la distancia del vecino más cercano se centra alrededor de un valor distinto de cero y tiene colas asimétricas, ya que la distancia máxima entre pares de celdas puede ser sustancialmente mayor que los valores medianos (Figura 3A,C). Utilice la distribución log-normal para modelar dichas distribuciones (Figura 3B,D). Para ello, utilice Rscript snippet_6_3.R.
4. Utilice el siguiente modelo bayesiano para estimar las medias y varianzas de las distribuciones de los vecinos más cercanos entre parientes (α₂, σ_{2 2}) y no parentales (α₁,^{σ 2}₁), y la probabilidad de que surjan distancias dentro del canal a partir de la distribución de parentesco (π=e^β/(1+e^β)):
   bw.dist_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limiwi.dist_i ~ N(α₁, σ²₁| l.limi2, σ²₂| l.limiσ₁ ~T₁(0,1|σ₁>0)
   σ₂ ~T₁(0,1|σ₂>0)
   α₁ ~ Unif(2,6)
   α₂ ~ Unif(1,5)
   β ~ Unif(-5,0)
   donde Unif(a,b) es la distribución uniforme en el intervalo [a,b], N(μ,σ²|l2 restringida al intervalo (l,u), T₁(0,1|x>0) es la distribución estándar de Cauchy (T con 1 grado de libertad) restringida a la semirrecta positiva, bw.dist_i es la^i-ésima distancia registrada entre pares de canales y wi.dist_i es la^i-ésima distancia de pares registrada dentro del canal. Obsérvese que las distancias registradas dentro del canal tienen una distribución de mezcla de dos componentes que refleja la mezcla de pares de células parentales y no parentales.
   1. Proporcione al modelo antecedentes informativos si es posible. Por ejemplo, este protocolo espera que las células parentales estén más cerca unas de otras que las células no parentales, por lo que esto se proporciona a priori para la media de la distribución de las distancias. A continuación, utilice los paquetes runjags²⁷ y coda²⁸ R y el programa JAGS²⁹ para la estimación de parámetros (Rscript snippet_6_4.R).
5. Ejecute el modelo JAGS con el número de cadenas correspondiente al número de CPU disponibles. Utilice Rscript snippet_6_5.R para realizar este paso. Permita que el software se ejecute hasta la convergencia.
6. Utilice métricas para probar la convergencia del algoritmo, como el tamaño efectivo de la muestra (disponible con runjags), el diagnóstico de convergencia de Gelman-Rubin (disponible con runjags) y su autocorrelación (autocorr/autocorr.diag disponible en coda). Verifique la bondad de ajuste del modelo estimado para las distancias de los vecinos más cercanos inspeccionando un gráfico Q-Q, que traza una comparación a nivel de cuantiles de los valores reales y estimados para las distancias de los vecinos más cercanos utilizando Rscript snippet_6_6.R (Figura 4C,F). Este script requiere que el usuario edite los valores de las líneas 25-29 de snippet_6_6.R en función de la salida del Comando 6.
   NOTA: Idealmente, se debe obtener un tamaño de muestra efectivo (SSeff) superior a 10.000 para cada uno de los parámetros³⁰. Sin embargo, un SSeff superior a 2.500 puede ser adecuado para algunos modelos complejos. El diagnóstico de Gelman Rubin es de 1,00 para una convergencia perfecta y debe ser inferior a 1,05 para una convergencia satisfactoria. Una alta autocorrelación indica una mezcla lenta dentro de las cadenas y es un indicador de convergencia lenta. El gráfico de autocorrelación debe seguir un decaimiento exponencial en el caso de un buen modelo. El gráfico Q-Q de las distribuciones reales y modeladas del vecino más cercano (Figura 4C,F) debe seguir la diagonal lo más cerca posible.
7. Después de verificar la precisión de los modelos, obtenga la probabilidad de que un par de celdas sean kin en función de su distancia. Para determinar una distancia umbral para determinar si es probable que las células dentro del canal sean parentales, identifique la distancia a la que la probabilidad de ser kin cae por debajo de 0,5. Esto se puede hacer usando Rscript snippet_6_7.R.
   NOTA: Se pueden elegir umbrales alternativos en función de los objetivos experimentales. Para algunas aplicaciones, los umbrales pueden no ser relevantes y la probabilidad de ser un par de parentesco puede usarse directamente para ponderar pares de celdas.

Resultados

Siguiendo el protocolo de criolesión neonatal se deben producir corazones P21 con y sin lesión. Los corazones criolesionados tienen una lesión bien circunscrita, mientras que la superficie de los corazones simulados es lisa y homogénea. En los corazones criolesionados, el área de la lesión debe ser consistente de corazón a corazón. Después de la microscopía, se deben obtener imágenes similares a la Figura 1. Tenga en cuenta que la resolución de la imagen permite la identificación de CM indiv...

Discusión

El rastreo de linaje multicolor es un enfoque poderoso para identificar patrones de crecimiento de órganos con resolución de una sola célula. Sin embargo, una limitación importante para el rastreo de linaje multicolor es la necesidad de un etiquetado escaso de las células, lo que puede reducir la sensibilidad para identificar eventos raros. Para órganos como el corazón con niveles notoriamente bajos de renovación de células parenquimatosas, esto puede llevar a subestimaciones de las resp...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
#1.5 cubreobjetos de vidrio	FisherScientific	12-544E
6-O prolene	Ethicon	8706H
Medio de montaje antidecoloración	FisherScientific	00-4958-02
			inhalación de CO2
Compresa
Cryomolds VWR		15160-215
Cryoprobe	World Precision Instruments	501313
Cubos de
Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-EGFP,-mCerulean,-mOrange,-mCherry)Ilw ratones
		Software ImageJ	https://imagej.net
KCl 1M	FisherScientific	LC187951
Leica CM3050 criostato
Microtijeras
Myh6-CreERT2	ratones The Jackson Laboratory	005657
Soporte para agujas	World Precision Instruments	14109
Solución salina
Python			https://www.python.org/
R			https://cran.r-project.org/
Agitador
giratorio Sacarosa
30% (peso/vol)	FisherScientific	BP220
Tijeras de disección quirúrgica	World Precision Instruments	14393
Jeringa para tamoxifeno	VWR BD328438
Tamoxifeno, 20 μ g	Sigma	T5648
Medios de congelación de tejidos	VWR	15148-031
Blanco Portaobjetos esmerilados/Plus	Globe Scientific	1358W
Zeiss Axio Imager M1 sistema
Zen 2.5 Blue software