Blot occidental de ultra alta velocidad usando tecnología de mejora de la inmunorreacción

Resumen

Una técnica de distensión occidental de ultra alta velocidad se desarrolla mejorando la cinética de la unión antígeno-anticuerpo a través de la tecnología de drenaje cíclico y reposición (CDR) junto con un agente que mejora la inmunorreacción.

Resumen

Una mancha occidental (también conocida como inmunoblot) es un método canónico para la investigación biomédica. Se utiliza comúnmente para determinar el tamaño relativo y la abundancia de proteínas específicas, así como modificaciones de proteínas post-traslacionales. Esta técnica tiene una rica historia y permanece en uso generalizado debido a su simplicidad. Sin embargo, el procedimiento de hinchazón occidental famosamente toma horas, incluso días, para completar, con un cuello de botella crítico siendo los largos tiempos de incubación que limitan su rendimiento. Estos pasos de incubación son necesarios debido a la lenta difusión de anticuerpos de la solución a granel a los antígenos inmovilizados en la membrana: la concentración de anticuerpos cerca de la membrana es mucho menor que la concentración a granel. Aquí, presentamos una innovación que reduce drásticamente estos intervalos de incubación mediante la mejora de la unión de antígenos a través del drenaje cíclico y la reposición (CDR) de la solución de anticuerpos. También utilizamos una tecnología de mejora de la inmunorreacción para preservar la sensibilidad del ensayo. Una combinación del método CDR con un agente comercial de mejora de la inmunorreacción aumentó la señal de salida y redujo sustancialmente el tiempo de incubación de anticuerpos. La mancha occidental de ultra alta velocidad resultante se puede lograr en 20 minutos sin ninguna pérdida de sensibilidad. Este método se puede aplicar a las manchas occidentales utilizando detección quimioluminiscente y fluorescente. Este sencillo protocolo permite a los investigadores explorar mejor el análisis de la expresión proteica en muchas muestras.

Introducción

Una mancha occidental (también conocida como inmunoblot) es una técnica poderosa y fundamental en una amplia gama de disciplinas científicas y clínicas. Esta técnica se utiliza para examinar la presencia, la abundancia relativa, la masa molecular relativa y las modificaciones post-traslacionales de las proteínas^1. Combinado con el análisis de imágenes digitales, este método puede analizar de forma fiable la abundancia de proteínas y modificaciones de proteínas^2. Aunque la mancha occidental se realiza de forma rutinaria, es un método que consume mucho tiempo y requiere mucho trabajo. Se requieren largas incubaciones del a....

Protocolo

1. SDS-PAGE y transferir a una membrana PVDF

1. Realice SDS-PAGE para separar las proteínas en función del tamaño relativo.
   NOTA: Cualquier sistema de gel comercial o casero está bien. Por favor, siga el protocolo del fabricante.
2. Transfiera proteínas separadas de un gel a una membrana PVDF.
   NOTA: Los métodos de transferencia comunes (transferencia semi-seca o húmeda) son adecuados. Por favor, siga el protocolo del fabricante.

2. Bloqueo de membranas PVDF

1. Incubar las membranas en amortiguadores de bloqueo adecuados durante 1 h con agitación a temperatura ambiente.
   NOTA: Dependiendo del anticuerpo pri....

Resultados

Este ejemplo ilustra la eficacia del método CDR junto con la tecnología de inmunoenhancing en western blot. La incubación estática se realizó en una película flexible semitransparente donde las membranas PVDF fueron incubadas con la solución de anticuerpos, mientras que la incubación de CDR fue en un horno de hibridación mediante tubos giratorios que contenían las membranas y la solución de anticuerpos (Movie). La Figura 2 mostró cantidades de antígeno y anticuerpos, respectivamente, necesar.......

Discusión

Western blot es una técnica analítica ampliamente utilizada para detectar proteínas específicas que se desarrolló ~Hace 40 años^7,8. Desde entonces, la técnica ha seguido evolucionando, con innovaciones posteriores mejorando la sensibilidad, velocidad y cuantificación de la técnica^{2,9,10,11,12,}

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de ensayo de PP de alta claridad con fondo redondo de 14 ml, graduado, con tapa a presión	Falcon	352059
Apollo Película de transparencia para impresoras láser	N/A	N/A	Cualquier tipo de película de transparencia para impresoras láser está bien.
Azure Imaging System 600	Azure Biosystems	Azure 600	Cualquier tipo de sistema de adquisición de imágenes está bien para la detección quimioluminiscente y/o fluorescente.
Puede obtener la solución potenciadora de la inmunorreacción de señal	TOYOBO	NKB-101
CARNATION Clavel instantáneo de leche en polvo descremada		N / A
ECL anti-ratón IgG, Rábano picante peroxidasa unido F (ab')2 fragmentos de ovejas	GE Healthcare	NA9310V
ECL anti-conejo IgG, Rábano picante peroxidasa ligado a F(ab')2 fragmentos de burro	GE Healthcare	NA9340V
HYBAID Micro-4 N	/A	N/A	Cualquier horno de hibridación está bien siempre que los tubos se giren uniformemente en posición horizontal.
Membrana de PVDF Immobilon-P, 0,45 y micro; m tamaño de poro	Millipore Sigma	IPVH304F0
IRDye 680RD Anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra	LICOR	926-68070
IRDye 800CW Anticuerpo secundario anti-IgG de cabra anti-conejo	LICOR	926-32211
KPL LumiGLO Reserve Sustrato quimioluminiscente	seracare	5430-0049
Anticuerpo anti-ß actina de ratón	Millipore Sigma	A5316
Tampón de bloqueo Odyssey (PBS)	LICOR	927-40100	Tampón de bloqueo para detección fluorescente
OXO Centrifugadora de ensaladas OXO		32480V2B	Cualquier centrifugadora de ensaladas está bien siempre que las membranas de PVDF se enjuaguen vigorosamente sin rasgarse.
Película de sellado	Parafilm Bemis	Parafilm M PM996	película flexible semitransparente
Tapones de rosca de polietileno de punta plana para tubos de centrífuga de fondo cónico de 50 mL	Falcon	352070
Anillos para sujetar un tubo de 14 ml en el centro de un tubo de 50 ml	N/A	N/A	Preparado en un taller mecánico
Conejo anti-6X Su etiqueta	anticuerpo Abcam	ab9108
Tween20	Millipore Sigma	P2287